代谢组学研究进展

代谢物组学（metabonomics）一词是英国伦敦大学帝同学院的Nicholson教授于1999年首次提出，指的是通过分析生物的体液、组织中的内源性代谢产物话（metabonome，代谢物组或代谢物图谱）的变化来研究整体的生物学状况和基因功能调节的现代生物医学分支学科。与传统的代谢研究相比，代谢物组学通过现代化学的仪器分析技术检测机体整个代谢产物谱的变化，并通过多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况。代谢物组学与细胞代谢物组学（metabolomics）的区别是细胞代谢物组学研究单个细胞或一个相对独立系统中的小分子成分因外界环境改变而发生的代谢变化，主要应用于植物生理和细胞学研究。其实早在20世纪60年代，代谢物组学的核心技术——核磁共振技术（NMR），就已经被应用到代谢研究中。但直到20世纪90年代，随着模式识别分析技术的发展，代谢谱的定量分析才得以实现，并应用于药物和基因功能的研究。利用代谢物组学研究药物对整体的作用主要依赖于多参数检测外源物质攻击所导致的机体新陈代谢改变。这种方法也适合研究基因突变和转基因所产生的代谢改变以及疾病诊断和疗效评价。在药物发现阶段，它可以进行体内毒性研究、先导药物的筛选和目标化合物的优化及体内动物模型的药效筛选。在药物开发阶段，它可以在临床前安全性评价方面进行生物标志物的发现和毒性机制的研究，从而可有效地利用动物模型研究人类疾病的治疗，发现与临床安全性和有效性有关的生物标志物。

1 研究的对象——生物体液

许多生物体液都可以进行代谢物组学研究，包括唾液、血液、血浆、尿液、乳液、脑脊液、组织萃取液等。不同体液的器官分布及功能各不相同，因此包含的代谢产物成分也存在较大差异。每种体液都具有特异性的NMR指纹谱，其中可溶性物质的浓度和分子间的相互作用决定了峰谱的密度和分布。如血浆、脑脊液和尿液的代谢谱能够反映某些药物或某种发生在单一器官或多个器官的疾病所产生的代谢变化。NMR谱很适于体液的生化分析，因为其灵敏度高（检测限达ng级），检测速度快，样品无需预处理，并且几乎所有代谢物都具有特有的1H－NMR谱。利用特定的软件可以很容易地把所有可溶性体液中所存在的最大的障碍信号（水峰谱）除去而不影响结果分析。

药物毒性筛选和临床诊断中对体液的要求首先是量足、易得，且对机体不会产生损伤，这样尿液和血浆都适合代谢物组学研究。利用血浆进行代谢物组学研究的样品和常现生化分析以及药动学研究是一致的，而尿液在代谢物组学的研究中有其自身的优点。首先，如果不处死动物，通过静脉血管采集血液将对动物产生损伤和一定程度的应激，影响结果。更为关注的是血液采集的时间和频率的限制，大大影响了血浆大规模的使用；而尿液就不存在以上问题，通过代谢笼可以定时、随时收集尿液，并不会对动物产生任何影响。尿液一维1H－NMR谱图（600MHz或更大）由成千上万条线组成，其中包含了数千种代谢物。尿液的1H －NMR谱主要由低分子物质组成，因为NMR主要测定的是相对分子质量低于20×104的小分子物质。而血浆中含有大量的高分子物质，像蛋白质和脂蛋白将会产生较宽的信号峰，小分子物质的信号也有可能整合到大分子的信号峰上。这样血浆样品必须经过除蛋白处理，或通过自旋回波（Spin－echo）处理以降低由于蛋白质或其他大分子产生的宽信号峰对实验结果的影响，而这样的处理也会对分析结果产生一定的影响。因此，代谢物组学研究中最常用的体液为尿液。在收集时应该使尿液保持低温，并要添加一定量的防腐剂（一般选用叠氮钠，因为在NMR分析中叠氮钠不会产生有影响的信号）。

2 研究的核心——核磁共振技术

早在20世纪60年代，NMR就已经应用到代谢研究中，但当时质子工作频率低（小于300MHz），能分析的内源性代谢产物较少；随着质子工作频率和测量灵敏度的提高（大于400MHz）以及模式识别技术的发展，NMR技术可分析测定更多的小分子物质，并发展成为

代谢物组学研究的核心技术。对于疾病、毒性反应、基因突变等病理过程引起的复杂的代谢成分改变，NMR无疑是一种非常好的技术手段。首先，NMR是物质分子结构研究中的重要剖析工具，H，F等原子的原子核如同小磁体，当置于外界磁场中时，即按磁场方向取向。NMR谱就是以测定改变这种取向所需要的射频能为基础。其中最常用的是1H－NMR，它能反映有机分子结构中处于不同位置的H原子的信息。在外加磁场的作用下，分子中多个H 原子所处的电子环境也完全不同，其共振频率也不相同，因此，其原子就会有不同的化学位移。相反，在不同的分子中，处于相同电子环境的质子（也称等性质子）都有大致相同的化学位移。通过辨析各种质子的吸收峰并根据各自的化学位移，就可初步推断其分子结构。其次，魔角自旋核磁共振技术[magic angle spinning（MAS－NMR）]可用于研究完整组织和细胞的代谢变化，实验后的样品还可以被用于别的试验研究。除NMR外，质谱（MS）、气质联用技术（GC/MS）、高效液相色谱（HPLC）和其他光谱分析技术都曾应用于代谢物组学研究。

从生物分析角度上看，MS和NMR都是进行代谢物组学研究比较好的工具。但在鉴定完整的生物材料上，因为NMR对生物材料没有任何损伤性，在复杂混合样品分析时可以得到更丰富的生物学信息，所以被广泛应用。与NMR相比，MS技术更加灵敏，但其产生的离子化抑制比较难消除，导致模式定量分析比较困难，并且试验前样品还需要进行萃取和衍生化处理。因为代谢物组研究中测定方法的发展方向最终将要实现大规模的样品处理和数据的自动化分析，所以，一般选用比较方便的NMR技术，尤其是在药物毒理和临床研究中。最近研究表明，基于NMR技术的代谢物组学能够在哺乳动物上区分出由于基因的突变而引起代谢表型的改变，鉴定出由于基因和环境因素作用而产生的特定的代谢型（metabotypes）。代谢物组学技术也可以鉴定出动物突变体和疾病状态下人的一些异常的代谢变化。Griffin等利用基于NMR的代谢物组学技术研究了在基因突变情况下动物的代谢表型。Moolenaar等利用基于NMR的代谢物组学技术检测尿液，研究疾病状态下人的代谢表型。

3 研究的支柱——模式识别技术

生物体液NMR谱图的复杂性是妨碍得到有用的生物学信息的限制因素，因为即使是一张一维1H－NMR谱图就可能含有几千条可分辨的谱线，从中得到可以区分不同代谢状态的信息是代谢物组研究的关键。显然这几千条谱线不可能都作为参数研究，所以代谢物组研究所要做的分析方法主要是数据降维。因为对于含有n个参量的模式矢量，每个关量是n 维空间中的一个点。如n=2或3，则可直接用图形显示这些模式矢量，人眼也可以直接对其进行区分判别。但n＞3时，这种直接显示显然是不可能的，这就涉及到数据降维的问题。如何将n维空间的图景在2维或3维空间显示出来，并尽可能减少原n维空间中分类信息的丢失，是数据降维处理的核心所在。

数据降维的分析方法很多，大致可分为有监督的（supervised）模式识别方法和无监督的（unsupervised）的模式识别方法。属于有监督的模式识别方法有SIMCA（Soft Independent Modeling of Class Analogy），PLS（Partial Least Squares）和PLS-DA （PLS-Discriminant Analysis）方法等。无监督的模式识别方法有PCA（Principal Component Analysis）法、非线性作图（Non －linear Mapping，NLM）和分层聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）等。通过数据降维模式识别分析方法的一般过程是首先对数据进行无监督的模式分析，然后选定某一类样本进行数据建模，再对变量进行加权处理，选定主成分建模的主成分数目，最后利用有监督性统计的方法判别未知样本。

目前，最常用的模式识别方法是PCA法。PCA 是一种将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标（主成分，PC）上的探索性统计分析方法，利用PC描述数据集内部结构，实际上也起着数据降维的作用。PC是由原始变量按一定的权重经线性组合而成的新变量。这些新变量具有以下性质：① 每个PC之间都是正交的。②第1个PC包含了数据集的绝

大部分方差，第2个次之，依此类推。这样，由头2个PC作图，就能够很好地代表数据集所包含的生物学变化。这样的PC图能够直观地描述药物作用到器官之后，根据其作用机制而表现内在的集束行为，每个样本在PC图上的位置完全由它的代谢反应所决定。这样根据PC图中所得到的发生改变的谱峰的位置，经过一定生物信息学分析得到发生改变的物质，从而可以了解发生毒性作用的机制。

基于NMR的代谢物组研究分析方法的基本步骤是：首先测定一系列NMR谱图，不用对谱峰进行指认，把谱看作是一个n维对象，直接将谱图分解成250～1000个区域进行积分，得到积分强度；然后将这些简化的数据输入程序，利用PCA等方法进行分析，得到PC 图。处于相似生理状态的样本通常具有相似的组分，因此在PC图中处于相邻位置。通过生物信息学分析可以得到不同状态下的生物标志物，然后再根据这些生物标志物进行机制或筛选研究。

4 研究的应用

4.1 在药物毒理研究中的应用

通常情况下，药物通过与遗传物质直接作用而产生毒性，或通过诱导系统合成与药物代谢有关的酶，从而产生有毒的产物。在这种情况下，用基因组和蛋白质组学方法来评价毒性是有用的。然而，生物异源物质有可能只在药理学水平上产生作用，因而可能不会影响基因的调节和表达。再者，某些毒理学效应可能与基因的改变和蛋白质的合成完全不相关。因此，在许多情况下，从基因组和蛋白质组角度考虑到的反应并不能预测药物毒性。然而，药物引起的生理紊乱都会产生直接的生化反应，或通过与控制代谢的酶相结合而引起内源性生化物质在比例、浓度、代谢通量等方面的改变。如果这种变化足够大的话，就会影响整个生物体的功能。生物体液中的代谢物与细胞和组织中的代谢物处于动态平衡。因此，生物体中由于中毒或代谢损害而引起的细胞功能异常一定会反映在生物体液成分的变化上。这样通过检测血浆、尿液、胆汁等生物体液中的一些具有特殊意义的微量物质，经过合适的分析方法就能区分出不同的代谢状态，从而也能根据不同的代谢表型区分出不同的药物作用。Anthony等利用NMR技术通过测定尿中代谢成分的变化研究不同肾毒性药物的作用机制。

在药物毒理研究中，由1H－NMR谱检测到的生物体液中的内源性代谢物模式完全依赖于药物毒性的类型。每一种类型的药物都会在生物体液中产生特征的内源代谢物浓度和模式变化，这种特征给我们提供了药物毒性作用机制和毒性靶器官。可以利用代谢物组学进行毒性标志物研究、毒理机制研究和药物毒性筛选。

因为尿液的收集不会对机体造成任何损伤，故通过测定尿液的代谢物组研究很适合药物的筛选。进行药物筛选需要满足3个方面的信息：首先，要能够鉴定出单个或对照组的实验动物是否为正常状态；其次，通过模式识别分析与对照组和模型药物产生的代谢谱相比较，能够鉴定出受试化合物的“毒性状态”；最后通过分析鉴定出毒性作用的生物标志物。很明显，NMR技术能够在复杂的混合物中检测出小分子物质。因此，可以利用代谢物组学技术进行毒性标志物研究。Holmes等利用代谢物组学研究肾小管S3段损伤性化合物HgCl2和HCBD，结果随肾小管S3段损伤的加剧，尿中葡萄糖、乳酸、羟丁酸盐、马尿酸盐、肌酐和酮戊二酸显著升高，表明尿中这些物质可以作为肾小管S3段损伤性药物的生物标志物。硝酸双氧铀引起肾毒性的标志物为尿中高浓度的羟丁酸。

国际知名的制药公司辉瑞、罗氏、诺和诺德、百时美施贵宝以及礼来于2003年在英国伦敦大学的帝国学院成立了毒理代谢物组学国际研究协作组（The Consortium on Metabonomic Toxicology，COMET）。建立该协作组的目的是为在药物发现阶段应用代谢物组学对药物进行毒性筛选，从而有效地降低药物的不良反应，以提高研发成功率。

4.2 在基因功能研究中的应用

利用代谢物组技术检测生物体液，根据其代谢表型可以把不同类动物（像大小鼠）区分开。动物种类不同，沉默基因（silent gene）所表现的功能就不同，从而影响了代谢过程，以致产生了不同的代谢表型。这样的研究结果也许可以解释药物在不同种类动物中毒性的差异，由于代谢产物和受体数量的不同，而造成内源代谢途径活性的差异，从而引起药物在动物体内产生的毒性不同。这也说明了利用代谢物组技术可以研究转基因动物和动物突变体代谢的表型，进而可以研究基因的功能作用。Griffin等的研究表明，通过肝细胞转染破坏宿主细胞膜可以引起明显的代谢变化，这种干涉过程对细胞系统或机体本身所产生的作用也许引起一部分或一类基因的功能发生改变。结果表明可以应用代谢成分的改变研究基因的功能。Lёonie等利用代谢成分的改变研究沉默基因突变所导致表型发生改变，结果表明代谢物组是研究基因功能的一个很好的途径，因为机体在同种状态下的基因和蛋白质数量要比代谢成分的数量多许多。代谢物组学还可以应用在疾病的诊断、发生过程的研究、植物代谢等方面。

5 结语

总之，代谢物组学已经作为一种独立的技术被广泛应用于药物的毒性研究和基因功能研究中，还被几家制药公司纳入其药物研发方案中。许多生物化学、药物毒理学和临床化学的问题都可以用基于高分辨1H－NMR的整体代谢物组学来加以阐述。从生物体液1H－NMR 谱图可以得到大量的代谢物数据，并由此确定毒性的靶器官，推导出毒性的作用机制，损伤发生、发展和消失过程中的生物标记物。代谢物组学还能提供生物体的代谢指纹图谱（“代谢型”），因而可以应用于药物临床研究的设计、疾病的终点、疾病发生机制等研究。但代谢物组学毕竟还在发展阶段，还有许多问题值得探讨，如生物体液不同造成代谢表型的差异、NMR灵敏度尚待提高、模式识别技术使用的局限性和如何将基因组学、蛋白质组学和代谢物组学有效地组合和解释这些组学所得到的结果等。但相信着随科技的发展，代谢物组学将在药物筛选、基因功能研究、疾病的诊断和发生机制的研究上具有广阔的应用前景。