高效液相色谱电化学内标法测定血浆高半胱氨酸

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临床检验杂志 ("") 年第 (! 卷第 * 期
=CIJHFH \1TLJ92 1] =2IJID92 49^1L9G1LE PDIHJDH， ("")， ?12-(!， 81-* 文献标识码： .
文章编号： （("")） !""!#$%&’ "*#"(+(#"(
中图分类号： ,&&%-!
・ 实验研究・
高效液相色谱电化学内标法测定血浆高半胱氨酸 !
! 曾立明! ， 王小卫( ， 彭贵华（ 长沙 &!"""+； ! / 中南大学湘雅医院检验科， ( / 湖南省肿瘤医院检验科）
摘要： 目的
建立用高效液相色谱电化学内标法直接测定血浆中高半胱氨酸的方法。方法
高半胱氨酸被四氢硼酸钠还原
后， 以 " / "( 012 3 4 醋酸盐缓冲液 （含 " / ! 0012 3 4 567.#89( 和 " / ! : 3 4 辛基磺酸钠， 为流动相， 巯基丙酰甘氨酸为内标， 经 ;<& / "） 电化学检测电极电位为 > +"" 0?， 内标法定量。结果 =!+反相柱进行色谱分离， 该法测定线性范围 ( @ ("" ! 最低检测 012 3 4， 该法简便、 快速、 （ !"） 日间 !" ) / BA @ & / BA ， 回收率 B+ / $A @ !") / )A 。结论 限为 " / * ! 012 3 4，日内变异系数 ) / (A @ ) / &A ， 精确， 适于临床实验室测定血浆高半胱氨酸水平。 关键词： 高半胱氨酸； 高效液相色谱； 电化学； 内标法
图%
空白血浆色谱图
分成 ( 组， 每组各管 ! & " 回收率 取小试管 !’ 支， 各 中分别加入 ! ))*+ , - "#$ 标准液 (、 ./ 和 !./ +， ! 管加正常人新鲜血浆至 ! & / )+， 混匀后按样品处理 步骤操作测其回收率， 每管平行测定 ’ 次， 结果取均 值， 回收率分别为 !/(0(1 、 !/!0%1 、 .2031 。
高半胱氨酸 （ C101DEFGHIJH， 是仅次于胆固醇 <DE） 的心脏疾病危险因子。高水平的血浆 <DE 与心脑血 管、 周围血管粥样硬化病变有关， 也与 .2KCHI0HL 病、 肾功能衰竭、 流产及糖尿病的早亡有密切联系。 （ MNO.） 、 酶 <DE 的检测常用荧光偏振免疫分析 、 高效液相色谱荧光检测 联免 疫 测 定 （ 54OP. ） 和毛细管电泳检测 （ <N5= ） 等。 其 中 （ <N4=#M6 ） 但操作复杂 （需衍生） ， 稳 <N4=#M6 国内外均有报道， 定性差， 难以满足临床测定。本实验在参考国外有 的基础上， 对样本处理和色谱条件进行 关文献 ［!#&］ 了适当的改进， 筛选出适宜的内标物， 建立了血浆 并已试用于临床。 <DE 测定的 <N4= 方法， ! 材料与方法 平 ! / ! 材料 高效液相色谱仪系 Q9GHLF 公司产品； 头微量进样针系 <90I2G1J =1 产品， (* ! 2； .7 #!)" 柱 恒温装置系天津金洲科学仪器公司产品。<DE、 巯基 四氢 丙酰甘氨酸和辛基磺酸钠为 PI:09 公司生产； 硼酸钠为 RHLDS#PDCTDC9LUG 公司产品； 其他试剂均为 国产分析纯。 准确称取 <DE !)/ *( 0: ! / " 试剂配制 标准溶液： 溶于 !"" 02 重蒸馏水中， 配成 ! 0012 3 4 贮存液， 分析 时用流动相 . 稀释成 !" ! 012 3 4 标准工作液。内标 溶液： 准确称取巯基丙酰甘氨酸 !%/ )(0: 溶于 !"" 02 重蒸馏水中， 配成 ! 0012 3 4 贮存液， 分析时用流动相 . 稀释成 "/* 0012 3 4 内标工作液。还原剂： "/ ! 014 3 （溶解在 "/"% 012 3 4 89W< 和 )" 02 3 4 二 4 89V<& 溶液 甲亚砜中） 。蛋白沉淀剂： "/"% 012 3 4 三氯醋酸。 用 ! / # 样 本 收 集 与 保 存 空 腹 静 脉 采 血 ) 02， 在 )" 0IJ 内 离 心 （ ) """ L 3 0IJ，!" 567.#89( 抗凝， !
各自作平行 ! & # 精密度 取(份不同浓度的血浆样本， 2 次和 !/ 个工作日的日内和日间实验。结果批内 !" 为 (0%1 4 (051 ， 日间 !" 为 (0.1 4 50.1 。 ! &$ 参考范围 随机选取健康男性 (/ 人， 女性 %’ 万方数据
（收稿日期： 修回日期： %//%K!/K!/， %//(K/%K!6） （本文编辑： 陈维忠）
图! "#$ 及内标标准品色谱图
有遗传、 年龄、 营养状 " & ! 影响血浆 "#$ 因素很多， 况、 疾病、 药物等， 因此采血前应禁食影响 "#$ 水平 的药物如叶酸、 氨甲喋呤等。应采用 >;? :6 、 >;? :!% 、 抗凝血检测并及时分离血浆冰冻保存。由于红细胞 是产生 "#$ 的主要场所， 血液离体后还将不断产生 故尽量在 (/ );< 内分离血 "#$ 入血浆使结果偏高， 浆， 如不能做到迅速分离血浆， 应在全血中加入稳定 剂如氟化钠， 可以部分抑制 "#$ 的释放。 " & " 流动池的污染和电极的腐蚀对测定有较大影 响， 检测前先用 6 ))*+ , - 的硝酸清洗流动池， 用脉 冲方式冲洗工作电极， 或用重铬酸钾洗液浸泡工作 电极 ’ );<， 洗净后使用， 这样可提高检测灵敏度， 使 峰形更稳定无干扰。为使待测物与内标分离良好， 我们发现只用流动相 @ 洗脱， 分离效果欠佳， 而加 入一点改性剂甲醇则效果较好。文献报道未见用电 化学内标法， 我们根据文献 ［ !］ 的提示， 选择巯基丙 酰甘氨酸作为内标物， 并且对流动相作了较大改进。 开机分析前， 流动相 @ 在流速 / & ’ )+ , );< 和工作电 极电位 A 2// )> 条件下过夜循环， 以去除背景电 流， 这样可降低基线噪音和漂移， 提高检测精确性。
参考文献：
［ ! ］BCD)* E，@D#C++*<; F，G9HH*+9 I，%& ’( ) ";J=KLCDM*D)9<#C +;NO;P #=D*)9?*JD9L=;# )C?=*P M*D )C9QOD;<J ?*?9+ L+9Q)9 =*)*#$Q?C;<C +CRC+Q ［ S］ （! , %） ： & S F=D*)9?*JD :， !..2， 3!. (!K(6 & ［%］ TUVD9)* S -， B;<WC+Q?C;< @ V， :*##9HH; B X， %& ’( ) Y*?9+ =*)*#$Q?C;<C ;< L+9Q)9：=;J=KLCDM*D)9<#C +;NO;P #=D*)9?*JD9L=;# PC?CD);<9?;*< Z;?= ［ S］ C+C#?D*#=C);#9+ PC?C#?;*< 9<P J+9QQ$ #9D[*< C+C#?D*PC & S F=D*)9?*JD （! , %） ： :， !..2， 3%/ %/’K%!/ & ［(］ \)*+;< - @， \#=<C;PCD S @& GC9QODC)C<? *M ?*?9+ L+9Q)9 #$Q?C;<C OQ;<J
万方数据 作者简介： 曾立明， 男， 大学本科， 主管技师， 主要从事色谱分离技术工作。 !B%) 年生，
临床检验杂志 %//( 年第 %! 卷第 ’ 期
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人， 年龄 !2 4 6’ 岁， 平均 (2 岁， 测定血浆 "#$ 水平， 结果 （ 为男： （!/ & ( 7 % & (2） 女： （. & %’ 7 # 7 $） )*+ , -， ! ! )*+ , -。 参 考 范 围 确 定 为 男： ’ & ’5 4 !’ & ! % & (’ ） ! 女： )*+ , -， 5 & ’’ 4 !5 & / ! )*+ , -。 ! " 讨论 " & % "#$ 在体内约有 3’1 以二硫键形式与蛋白质 结合， 必须用还原剂打开二硫键， 才能测定血浆中总 反应在 %/ );< 可 "#$。本实验用 89:"5 作还原剂， 完成， 在 % = 内进行去蛋白操作不影响结果。
图(
血浆样品及内标色谱图
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