纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化

纤维素酶高产菌的分离筛选与培养基优化李荣杰（安徽丰原集团有限公司，安徽蚌埠233010）摘要：以纤维素粉为惟一碳源，从取自某木材公司木材堆放处的土样中筛选出92株能够分解纤维素的菌株，采用刚果红鉴别培养基进行鉴定，选取透明圈较大的菌株10株进行液体培养，并测定它们的酶活，获得一株酶活高的里氏木霉FYFJ928，其发酵水平为8.3IU/mL 。

进一步研究培养基组分及培养条件对里氏木霉FYFJ928摇瓶发酵产纤维素酶的影响，在培养温度28℃，转速为200r/min 条件下进行培养，其最佳培养基组成：0.5%酵母粉，0.06%硫酸镁，0.5%磷酸二氢钠，2%葡萄糖，2%玉米浆，0.5%硫酸铵和8%纤维素粉，培养6d 后，其发酵水平可达到15.6IU/mL ，比优化前提高了近1倍。

关键词：里氏木霉；筛选；纤维素酶中图分类号：Q939.5文献标识码：A文章顺序编号：1672-5190（2009）06-0009-03Isolation of High Producing Cellulase Strain and Its Culture Medium OptimizationLI Rong-jie（Anhui Fengyuan Co.,Ltd.,Bengbu 233010,China ）Abstract ：The 92strains of cellulose-decomposing microorganisms were isolated from soil with timber plant stacked,ten colonies with distinct red zones were selected from them by congo red agar medium.By measuring the enzyme activity of liquid culture filtrates ，A strain （Trichoderma reesei FYFJ928）was obtained with higher cellulase activity ，and the filter paper enzyme （FPA ）was 8.3IU/mL.T.reesei was cultured in different medium to study the ability of producing cellulase at 28℃with rotate speed at 200r/min.The optimum medium was determined as follows:0.5%yeast extract,0.06%MgSO 4,0.5%NaH 2PO 4,2%glucose,2%corn steep liquor,0.5%（NH 4）2SO 4and 8%cellulose powder,the FPA was 15.8IU/mL under the optimized culture medium after cultured for 6days ．Key words ：Trichoderma reesei ;screening;Cellulase纤维素是自然界中含量最丰富的碳水化合物，是一类可再生的资源和能源。

但是纤维素很难被分解利用，如何将纤维素转化为能直接利用的资源和能源是摆在人们面前的一个难题。

纤维素的降解有两条途径：化学法和生物法。

化学法的特异性差、纯度低、污染环境，而用生物酶法可克服这些缺点，因此，纤维素酶一经发现就受到了世界各国科学界的重视。

纤维素酶（cellulase ）是指能降解纤维素β-1，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，其主要组分是内切β-1，4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4，也称Cr 酶）、外切葡聚糖酶（EC3.2.1.91，也称C1酶或微晶纤维素酶）和β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21，也称CB 酶或纤维二糖酶）［1］。

前两种酶主要溶解纤维素，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，当这3种主要成分活性比例适当时，就能完成纤维素的降解，可用于生产燃料酒精、食品和各种化学品。

此外，近年来发现纤维素酶在众多的工业领域具有广泛的应用价值，如食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸工业等［2］。

如前所述，纤维素酶降解纤维素与化学法相比具有很大优势，但是纤维素酶用量大、成本高，同样限制了其应用。

因此必须筛选合适的菌株，优化发酵工艺以提高纤维素酶的产量，从而降低成本。

国外对纤维素酶有40多年的广泛研究，纤维素酶产生菌代表性菌株有木霉、青霉和曲霉等［3］，其中里氏木霉被认为是最好的纤维素酶产生菌之一［4-5］。

该研究采用定性、定量的筛选法从木材厂土壤中筛选到1株产纤维素酶活较高的里氏木霉，摇瓶发酵活力达到8.3IU/mL 。

经过工艺优化，发酵水平达到15.6IU/mL ，比出发菌提高了近1倍。

1材料与方法1.1菌种木材厂土壤中筛选到1株产纤维素酶活较高的里氏木霉。

1.2培养基1.2.1筛选培养基：磷酸二氢钠0.1%，硫酸镁0.05%，硫酸铵1.5%，琼脂2.0%，纤维素粉0.5%~1.0%，pH 值为5.8~5.9。

1.2.2刚果红纤维素培养基［6］：刚果红纤维素培养基的配制见参考文献［6］。

1.2.3液体发酵培养基：硫酸镁0.1%，磷酸二氢钠0.5%，葡萄糖1.0%，玉米浆1.0%，硫酸铵0.5%，纤维素粉4%，pH 值为5.8~5.9。

1.3菌种筛选将土样适当稀释，用脱脂棉过滤，涂布于刚果红纤维素筛选培养基，28℃培养48h （见图1、图2）。

根据显色圈的直径大小，进行初选。

将初选菌株液体发酵测定酶活力复选，筛选出纤维素酶高产菌株。

1.4酶活力测定［5］1.4.1酶活力的测定方法：取发酵液于5000r/min 离心10min ，上清液即为用于测定的粗酶液。

取50mg Whatman NO.1滤纸条（1cm ×6cm ），加1mL 0.05M 柠檬酸—柠檬酸钠液冲液（pH 值为4.8），加入适当稀释酶液50μL ，50℃反应30min ，加入DNS 终止反应，沸水浴5min ，测还原糖。

以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计算酶活力。

1.4.2酶活力计算方法：1个滤纸酶活力国际单位（FPAIU/mL ）定义为：酶解反应中每分钟生成1.0μmol 葡萄糖（以还收稿日期：2009－05－19作者简介：李荣杰（1962—），男，正高级工程师，硕士，主要研究方向为生物化工。

Animal Husbandry and Feed Science 畜牧与饲料科学2009，30（6）:9-11图1纤维素酶产生菌原糖计）的酶量。

1.4.3计算公式：1个滤纸酶活力国际单位（FPAIU/mL ）=葡萄糖量（mg ）×1000×稀释倍数180（葡萄糖分子量）×30min （反应时间）×0.05mL （酶液）2结果与分析2.1菌种筛选与鉴定通过初筛，从土样中选取92株能够在以纤维素粉为惟一碳源的平板上生长旺盛的菌株。

将纯化后的菌株点到刚果红鉴别培养基上进行复筛，选取透明圈较大的菌株10株。

通过摇瓶液态发酵，测定酶活力，最终选取1株活力最高的霉菌（见图1）。

菌种鉴定特征为：在察氏培养基上，肉眼观察菌落迅速蔓延，形成较薄的菌丝层，菌落初期为白色、平坦，后期因产生分生孢子而呈深绿色。

产孢区常排列成同心轮纹状，菌落背面无色，有时也呈浅黄色。

镜检菌丝透明、有隔、细胞壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出、无色、分枝多，对生或互生二至三级分枝，整体像树枝；分枝与分生孢子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶形；分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺，单孢，靠黏液在小梗上聚集成球状绿色的分生孢子头。

据此初步鉴定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科木霉属里氏木霉［7-8］。

2.2培养基优化2.2.1氮源对液态发酵产酶的影响：从表1可以看出，该试验所用氮源中，酵母粉是最好的氮源，酶活达到8.5IU/mL ，其次是玉米浆和硫酸铵，酶活为7.8IU/mL 和6.2IU/mL 。

考虑到用玉米浆和硫酸铵作为氮源活力相当，活力比酵母粉低得不多，价格比酵母粉低得多，故用这3种作为氮源，进一步做正交试验，确定3种氮源的使用量，见表2。

图3所示最佳氮源配比为：酵母粉1%，玉米浆1%，硫酸铵1%，活力达到11.8IU/mL 。

因素影响顺序为：酵母粉>玉米浆>硫酸铵。

考虑到酵母粉价格较贵，玉米浆比硫酸铵更适于产酶，配方调整为：酵母粉0.5%，玉米浆2%，硫酸铵0.5%，活力达到11IU/mL 。

2.2.2碳源对液态发酵产酶的影响：纤维素酶属于诱导酶，一般来说不同碳源对纤维素酶的合成具有显著影响，因而设计了一系列碳源，考察对FYFJ0623产酶的影响。

从表3可以看出，该试验所用碳源中，纤维素粉是最好的碳源，酶活达到11.6IU/mL 。

试验中发现，以葡萄糖为碳源虽然最终活力不高，但前期菌体生长快，酶活力增长也较快。

故用这2种作为碳源，进一步做正交试验，确定2种碳源的使用量，见表4。

图4所示最佳碳源配比为纤维素粉8%，葡萄糖2%，活力达到14.8IU/mL 。

2.2.3无机盐对液态发酵产酶的影响：Mg 2+在微生物的生长代谢中起着重要作用，是许多重要酶的激活剂或辅助因子，在细胞中起着稳定核糖体、细胞膜和核酸的作用［9］。

由图5表1氮源对液态发酵产酶的影响氮源（0.5%）酵母膏玉米浆硫酸铵蛋白胨酶活（IU/mL ）8.57.86.23.0表2试验设计及结果项目试验1试验2试验3试验4试验5试验6试验7试验8试验9硫酸铵（%）0.50.50.51.01.01.02.02.02.0酵母粉（%）0.51.02.00.51.02.00.51.02.0玉米浆（%）0.51.02.01.02.00.52.00.51.0试验结果（IU/mL ）9.011.210.110.911.310.510.010.611.0表3碳源对液态发酵产酶的影响碳源（4%）淀粉麸皮纤维素粉秸秆粉葡萄糖酶活（IU/mL ）2.06.011.68.04.0图3氮源正交实验结果0.5120.5120.512121086420氮源配比（%）酶活力（I U /m L ）硫酸铵酵母粉玉米浆图2非纤维素酶产生菌畜牧与饲料科学第30卷10吴显荣，穆小民.纤维素酶分子生物学研究进展及趋向［J ］.生物工程进展，1994，14（4）：25-27.胡学智．酶制剂生产技术［M ］.北京：化学工业出版社，1994.张辉，桑青.生物降解纤维素研究新进展［J ］.安徽农业科学，2007，35（27）：8651-8653.Persson I ，Tjerneld F,Hahn -Hagerdahl B .Fungal cellulolytic enzyme production ：a review ［J ］.Process Biochemistry ，1991，26（2）：65-74.缪静，张术臻，程显好，等.纤维素酶提取工艺及酶学性质的研究［J ］.安徽农业科学，2008，36（19）：7954-7955.可知，在培养基中加入0.6%硫酸镁最有利于产酶，酶活达到14.5IU/mL 。