《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验五
《生物制药技术》实验指导实验五、四环素生物效价测定（选作）一、实验目的1、了解杯碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、掌握杯碟法测量抗生素效价的方法。
二、实验原理衡量发酵液中抗生素的含量称效价(titer或titre)，效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。
抗生素的生物测定方法有三大类：稀释法、比浊法以及扩散法。
扩散法中杯碟法(cup and plate method)或称管碟法(tube and plate method) 一种是常用的方法。
它是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的样品溶液分别加到牛津杯(Oxford cup，一种标准的不锈钢小管)中，置于含有敏感试验菌的琼脂平板上进行扩散渗透，一定时间后抗生素在菌层培养基形成浓度由高到低的自然梯度，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。
测量出抑菌圈的大小，以计算抗生素的浓度。
在一定的浓度范围内，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，且在一定的试验条件下，可直接利用抑菌圈的直径近似地代替其平方，因而从样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得样品的生物效价。
将已知效价的金霉素标准液先制成标准曲线，根据被检品溶液的抑菌圈的大小，就可从标准曲线上查出效价的对数值，从中计算出相应效价，再乘以稀释倍数，即计算出待测样品中抗生素的效价。
因杯碟法是利用抑制敏感细菌的直接测定方法，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度很高，不需要特殊的设备，故多被采用。
但此法也有缺点，即操作步骤多，培养时间长，获得结果慢。
尽管如此，由于它的独特优点，仍然被世界各国所公认，作为国际通用的方法被列入各国药典中。
三、实验材料及设备（一）实验材料1、菌种：工程菌：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）。
生物制药实习报告
生物制药实习报告实习目的本次实习的目的是让我们了解和掌握基本的生物制药生产方法，学习实验操作技能以及正确使用相关仪器设备的方法和注意事项。
实习内容1. 培养微生物我们首先需要培养出我们需要的微生物。
首先，要准备好培养基，选用适合微生物生长的基质，并给予适宜的温度和气氛。
我与同组同学负责培养大肠杆菌。
我们首先按照配方将培养基制作好后，使用无菌技术将培养基装到培养皿中。
目的是避免细菌的污染。
接下来，我们将微生物接种到培养皿里，并将培养皿置于恒温培养箱内，控制温度和气氛使其生长。
2. 粗提材料制备粗提材料制备是整个生物制药生产过程中至关重要的一步。
我们需要通过对微生物的培养，并进行后续处理得到目标生物分子的混合液体，即粗提材料。
我的小组负责大肠杆菌的培养和粗提材料的制备。
在得到足够量的菌体后，我们使用离心机将培养液离心。
通过离心的方式使菌体集中在一起。
接下来，我们将离心分离出的细菌在蠕动的匀浆器内不断打破，使细胞内部的目标分子释放出来。
这样处理后，我们得到了粗提材料。
3. 粗提材料的纯化为了得到高纯度的目标分子，我们需要对粗提材料进行纯化。
纯化的原理是根据生物分子的特性，分离出我们需要的目标物。
我们的组负责的是进一步的纯化。
我们使用了层析技术，将粗提材料加入到指定的层析柱中，并通过电泳等手段，使其物质在层析柱中发生分离。
最后，我们得到了较高纯度的目标生物分子。
4. 生物药物制剂的研究生物药物制剂的研究是针对我们得到的高纯度的目标分子进行的。
我们要对目标分子进行进一步的研究，以制定出合适的剂量和制剂方式。
我的组负责的是研究大肠杆菌所产生的胰岛素类生物药物制剂。
我们的主要任务是根据制剂要求，设计出不同的制剂，并进行对比实验，确定制剂方式和适宜的剂量。
实习体会在这次实习中，我学习了生物制药生产的基本流程和技巧，了解了生物药物制剂的研究过程。
同时，我也深刻体会到，生物制药的生产过程需要高度的精细和耐心，并且需要更高的无菌实验技能，更严格的信息管理技巧，每一个环节都需要严格、细致的操作和态度。
药品生产技术《《生物制药技术》课程设计》
淄博职业学院?生物制药技术?课程设计〔2021级〕系部制药与生物工程系制药技术教育教学部专业生物制药技术教师苏艳2021年 8月 18日一课程概况1 课程性质学分：7学分总学时：108课时授课对象：生物制药技术专业高职高专学生2、课程背景前导课：?应用微生物技术?，后续课?药物分析与检验技术?、?生物别离纯化技术?3、课程功能?生物制药技术?是高职生物制药技术专业的专业核心课程。
旨在培养学生较全面地掌握生物制药技术典型产品发酵菌种类型的形态、代谢特征、原料的预处理及培养基的制备、灭菌与空气的净化、菌种选育和扩大培养、发酵工艺过程控制和参数检测、产品的别离提取等根本理论，掌握与发酵岗位相关的操作技能，取得相应岗位的职业技能等级证书，不断提高学生的专业能力、方法能力和社会能力，培养能够胜任发酵及其相关岗位的高素质技能型专门人才。
二课程目标1 课程总体目标：本课程目标是根据社会需求和企业岗位实际，参照生物发酵工四级〔中级〕的职业标准〔国家尚未公布发酵工程制药工职业标准〕，旨在培养学生具备生物制药岗位群所需的根本职业素养、操作技能与技术应用能力，重点强化学生对药物发酵的生产、检测和自动化控制的专业技能的掌握。
在授课过程中，通过工程导向和任务驱动的活动，逐步建立适应现代生产方式的工作标准，使学习者掌握发酵生产技术，并具有良好的职业素质。
同时培养学生爱岗敬业、团结协作、吃苦耐劳的职业精神与学生的创新意识、自我开展能力和社会适应能力。
2具体目标知识目标：能陈述培养基配制的关键步骤，并准确描述培养基的灭菌方法；能陈述典型药物产品发酵生产的特点和工艺过程；能描述菌种保藏的原理，熟悉常用菌种的保藏方法；能陈述典型药物产品发酵用设备的结构与功能；能陈述典型药物发酵生产质量控制要点及检测方法；能陈述引起发酵生产工艺异常、设备异常的主要因素，并能够采取相应的解决措施。
能力目标：能进行培养基配制及灭菌操作；能按照工艺配方正确计算出原料、辅料的投料量；能进行药物发酵生产主要设备与管路的使用维护；能按照标准操作规程进行生产和设备操作；能进行药物发酵生产质量控制要点检测操作；能识别药物发酵生产异常情况并在指导下进行处理；能识别药物发酵生产常见设备异常情况。
高中生物生物制药技术的应用教案
高中生物生物制药技术的应用教案引言：生物制药技术是一项应用广泛并在医学、农业和工业领域产生深远影响的生物技术。
通过利用生物材料和生物过程，生物制药技术可以生产出特定的药物和化合物。
在高中生物教育中，了解生物制药技术的应用具有重要意义。
本教案将介绍高中生物教学中，生物制药技术的应用及相关实验。
教学目标：1. 了解生物制药技术的概念和原理；2. 掌握常见的生物制药技术及其应用；3. 学习生物制药技术实验的操作方法和注意事项；4. 发展学生的实验设计和数据分析能力；5. 了解生物制药技术对医学和工业的重要性。
教学内容：一、生物制药技术概述A. 生物制药技术的定义和发展历程B. 生物制药技术的应用领域C. 生物制药技术在医学和工业中的意义二、重combinantDNA技术的应用A. recombinantDNA技术的基本原理B. 生物制药中的重combinantDNA技术实例1. 重combinantDNA技术在生产人胰岛素中的应用2. 重combinantDNA技术在生产生长激素中的应用三、细胞培养技术的应用A. 细胞培养技术的原理和步骤B. 细胞培养技术在生物制药中的应用1. 细胞培养技术在生产疫苗中的应用2. 细胞培养技术在生产单克隆抗体中的应用四、酶工程技术的应用A. 酶工程技术的基本原理B. 酶工程技术在生物制药中的应用1. 酶工程技术在生产食品添加剂中的应用2. 酶工程技术在生产生物柴油中的应用五、分子诊断技术的应用A. 分子诊断技术的原理和种类B. 分子诊断技术在医学中的应用1. PCR技术在基因检测中的应用2. DNA芯片技术在肿瘤筛查中的应用实验设计：实验一：重combinantDNA技术实验目的：掌握重combinantDNA技术在实验室中的操作方法材料：大肠杆菌DH5α菌株、质粒、限制酶、DNA聚合酶等步骤：1. 将目标基因插入质粒中；2. 转化大肠杆菌；3. 鉴定转化菌落；4. 扩大菌液；5. 提取目标蛋白。
《生物制药技术》实验
《生物制药技术》实验指导实验一金霉素链霉菌培养基的制备实验目的：1、学会培养基的配制2、掌握灭菌方法。
实验原理：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。
在固体培养基上产生金色色素，故名。
其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。
菌落开始为白色，长孢子后变青色。
抗菌素工业上用以生产金霉素。
放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。
放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。
多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。
放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。
因其生长具辐射状，故名放线菌。
放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。
但其菌落较小而致密，不易挑取。
不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。
四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。
抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。
品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。
器材：1ml移液枪；铝锅；电炉试剂：NaBr母液（0.1g／ml）KCl母液（0.1g／ml）M-促进剂母液（2.5mg／ml）实验步骤：1．种子培养基种子培养基(g／L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO34，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。
生物制药技术使用的最佳实验流程与操作指南详细说明
生物制药技术使用的最佳实验流程与操作指南详细说明生物制药技术在现代医药领域发挥着重要的作用，它利用生物学和化学原理，利用生物体来合成和生产药物。
为了确保生物制药技术在实验中的准确性和有效性，制定一套最佳的实验流程与操作指南是至关重要的。
本文将详细说明生物制药技术使用的最佳实验流程和操作指南。
1. 实验流程设计(1) 实验目标和假设：在设计实验流程之前，首先要明确实验目标和相关假设，确保实验的科学性和可行性。
(2) 流程安排：根据实验目标和假设，确定实验所需步骤的顺序，并将其编排为一个完整的实验流程。
流程安排应合理化，以确保实验步骤的逻辑性和连贯性。
(3) 实验方案：根据实验目标和假设，选择合适的生物制药技术方法和实验条件，并确定所需材料和设备。
2. 实验操作指南(1) 实验前准备：在进行实验之前，需要做好充分的实验准备工作。
包括准备所需材料和试剂，校准实验仪器，准备实验室环境和安全设施等。
(2) 实验步骤：根据实验流程，详细描述每个实验步骤的操作过程。
包括实验仪器的设置和调试，试剂的配制和加样，以及反应条件的控制等。
(3) 实验记录：在实验过程中，及时记录实验数据和观察结果，并进行详细的实验记录。
实验记录应包括实验日期、实验步骤、实验数据、观察结果等。
(4) 质量控制：在每个实验步骤中，应加强质量控制，确保实验结果的可靠性和可重复性。
包括对试剂的质量检查，实验设备的校验和标定，以及实验操作员的培训和质量监控等。
(5) 安全措施：生物制药技术涉及到生物材料和化学试剂，具有一定的安全风险。
在实验中，应采取必要的安全措施，包括穿戴实验服和防护用品，遵守实验室操作规程，进行废弃物的处理等。
3. 实验结果分析和讨论(1) 数据分析：对实验结果进行统计和分析，比较实验组和对照组的差异，评估生物制药技术的效果和可行性。
(2) 结果解释：根据实验结果，解释实验现象的原因和机制，并与先前研究成果进行比较和讨论。
(3) 结论和建议：总结实验结果，得出结论，并提出进一步改进和研究的建议，为生物制药技术的应用和发展提供指导。
生物制药工艺试验
取 a 液 85mL 和 b 液 15mL 混匀，即得 pH＝7.5 磷酸盐缓冲溶液。 3、供试液的制备与测定：准确吸取待测溶液 1mL，将其稀释 1～25 倍，再 从稀释液中准确吸取 1mL，注入 25mL 的容量瓶中，加水 4mL 和酒石酸亚铁溶 液 5mL，充分混合，再加 pH＝7.5 的磷酸盐缓冲溶液至刻度，用 1cm 比色杯， 在波长 540nm 处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度。
制药工程专业微生物实验讲义
（怀化学院微生物学课程组）微生物学实验室学生要求为了营造一个安全有效、秩序良好的实验室环境，达到“科学、规范、安全、高效”的目的，特对进入微生物学实验室进行实验的学生作如下要求。
1.按已分好的班级组次，按时参加实验，并完成实验项目。
2.进入实验室前，要求穿戴整齐，需穿好实验服，不能穿人字拖类拖鞋进入实验室。
3.上课前要求上交当堂课程的实验预习报告。
4.要求独立或以小组为单位完成实验项目，实验期间保持实验室安静，不能大声喧哗，并及时记录好实验数据。
5.实验完成后及时对实验结果进行分析并完成实验报告。
6.实验完成后需及时清洗实验器皿，清洁和整理实验台，做好卫生，保持实验室干净整洁。
授课教师：刘卫今、黎晓英（以下实验内容仅供参考，具体内容以相应教材为准）实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1．掌握培养基配制的原理。
2．通过对牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
3．解高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。
二、实验原理1．什么是培养基，一般培养基应具备哪些营养要素？2．培养基有哪些类型，为什么培养不同的微生物需要的培养基不同，培养基为什么要调节pH 值，配制好的培养基为什么要立即灭菌？3．高压蒸汽灭菌的原理是什么？三、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖（或蔗糖）、链霉素、1mol/L NaOH、1mol/LH Cl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布和玻璃漏斗等。
四、操作步骤(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。
其配方如下:牛肉膏3g，蛋白胨l0g，NaCl5g，琼脂15-20g, 水1000mL，pH 7.4～7.61. 称量：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。
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《生物制药技术》实验指导
实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型）
实验目的：
掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。
实验原理：
层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。
将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。
层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。
但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。
此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。
一般是水相和有机溶剂相。
常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。
被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。
一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。
当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。
分配系数大的移动快（阻力小）。
薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。
当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。
通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。
薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。
薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。
薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。
本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。
材料、试剂和器材：
仪器和设备：
玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子）
试剂：
四环素、金霉素标准品（1000U/ml）用0.1 M盐酸溶解并稀释定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。
展开剂：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5) 2L。
草酸、氨水
其它物品：
1.5ml离心管、小烧杯、玻璃棒、毛细玻璃管或微量注射器、pH试纸（pH覆盖1.0～
2.0）（或酸度计）、饭盒（或大培养皿）、凡士林
实验步骤：
1．层析板处理
层析板105℃烘烤过夜，均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH4.5)，于空气中晾干、备用。
2．点样
选取两种定向发酵液加草酸酸化至pH为1.5～2.0，取上清约l .2 ml于1.5ml离心管中，10000 rpm，5min，备用。
在距层析板底边2.5~3 cm起始线上(用铅笔划线，做出点样点记号)，用毛细玻璃管在薄层层析板上点四环素标准品和金霉素标准品溶液3次，发酵液上清点8～10次，点样点不大于0.4cm，每次都要吹干后再点。
（一般效价在1000u／ml以上点3次，500～1000u／ml点4次，200～500u／ml点5次）。
剩余的发酵液上清于4℃冰箱保存。
3. 层析（展开）
用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展开剂。
层析前需预先用展开剂预平衡层析缸，可在缸中倒入2cm高的展开剂，密闭，一般保持15－30分钟。
然后将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，在室温下展层6～8h（与温度有关）。
封口不严可涂抹凡士林。
4．荧光显影
待溶剂前沿展至板的一半以上时将层析板取出，标出溶剂前沿，于通风橱中晾干，用氨水熏数秒钟后即可在紫外灯下显影，画出黄色斑点，分别算出R f值。
（四环素标准品慢和金霉素标准品快）
无水四环素在波长365nm下显黄色荧光，根据与标准对照可定性测定。
注意事项：
因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。
要控制好点样量，样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象。
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
作展开剂中极少量强极性溶剂(0.5％)或pH值的改变可显著改善拖尾现象。
实验四四环素的效价测定（综合型）
实验目的：
1、了解抗生素效价的表示方法
2、学习抗生素的测定方法
实验原理：
实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。
效价(titer或titre)是评价抗生素效能的标准，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，也是衡量发酵液中抗生素含量的尺度，人们以1µg 金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。
四环素和金霉素在酸性条件下，加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素，其色度与含量成正比。
在碱性条件下，四环素较稳定，而金霉素则生成无色的异金霉素：
根据上述原理，可以在酸性条件下，利用比色法测定四环素、金霉素混合液的总效价；而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素，然后再在酸性条件下，使四环素生成黄色的脱水四环素，经比色测得四环素效价。
总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。
本实验只测定四环素的效价。
因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。
发酵液中，由于杂质的干扰，将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少杂质对比色反应的干扰。
材料、试剂和器材：
试剂：
EDTA lg／l00ml、NaOH 3mol／L、HCl 6mol／L、蒸馏水
盐酸四环素标准液: 精密称取盐酸四环素标准品0.0410 g 于烧杯中, 用适量蒸馏水(或0.1mol／L的盐酸溶解)溶解, 转移至200 m l容量瓶中定容配成0.2 m g /m l的溶液。
器材：
分光光度计、玻璃比色池、水浴锅、电炉、不锈钢锅、擦镜纸、50ml容量瓶（或比色管）、大烧杯、移液枪、1mL枪头、洗耳球
实验步骤：
取上述保存的处理发酵液上清l ml (效价约为1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml 浓度为lg／l00ml EDTA溶液，加蒸馏水9ml，再加入lml浓度为3mol／L的NaOH，在20~25℃
下保温15min后，加入2.5ml浓度为6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷却，稀释至刻度，在分光光度计上于440nm（或380 nm）处测定其吸光度值。
（紫外为100-390nm；可见光为380-780nm，根据波长选择石英比色池或玻璃比色池，否则玻璃对于紫外光有吸收）对照样品（不加诱导剂）的前处理方法与上述步骤一样，只是在加入HCl后，不加热，稀释至刻度，作为测定样品的空白对照, 调零。
取1ml四环素标准品于50ml容量瓶中，加1ml浓度为6mol／L的HCl，水浴煮沸15min 后，冷却，稀释至50ml，440nm（或380 nm）测吸光度。
（以蒸馏水作为空白测定）以定向发酵培养基中的对照组作为空白对照，测定其它三个处理组的吸光度。
（有时可能因对照组处理不当而使其它组的读数为负值，这时可以以蒸馏水作为空白。
）
计算公式：
发酵液中四环素的效价=
A
发酵×四环素标准品的效价
A
四环素标准。