细菌基本检验技术(实验)
微生物学检验常用的技术方法
微生物学检验常用的技术方法随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。
医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。
微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检查的重要方法之一。
它是细菌分类和鉴定的基础。
根据其形态、结构和染色反应性，为进一步鉴定提供参考依据。
1、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。
一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。
常用显微镜有如下几种。
1.普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。
显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。
故用油(浸)镜放大1000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。
普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2.暗视野显微镜它通常用于观察非染色微生物的形态和运动。
在普通显微镜中安装暗场集中器后，光线无法从中间直接穿透，视野变暗。
当试样从聚光器边缘接收到斜射光时，它可能会散射。
因此，可以在暗场背景下观察到细菌或螺旋体等明亮的微生物。
3.相衬显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。
在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4.荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同。
主要区别在于光源、滤光片和集中器。
目前，大多数实验仪器使用落光装置。
高压汞灯通常用作光源，可以发出紫外线或蓝紫光。
滤波器有两种：激励滤波器和吸收滤波器。
除了普通的亮场集中器外，还可以使用蓝光荧光显微镜可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。
尿液细菌学检验基本技术课件
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2020/7/22
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•保存与运输 • 室温<2小时 • 冰箱<8小时 •奈瑟菌不能冷藏
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•细菌学检验
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操 作 流 程
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尿液细菌学检查
• 1．涂片检查：革兰染色：查革兰阳性 菌、阴性菌或假丝酵母菌。抗酸染色：查 结核分枝杆菌。淋球菌涂片：用革兰染色 和吕氏美蓝染色，如发现革兰阴性成双 排列的圆形或椭圆形球菌，应进一步培养 证实。
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• 7、留取尿液标本应立即送检，否
则尿中细菌迅速繁殖，使菌落计
数不可靠而影响诊断；
8、无菌导尿管采集尿液，应在排
出15ml尿液后收集标本，但导尿
有潜在引入尿道菌的危险。
9、留置导尿管采尿，应先以75%
酒精消毒导管口，用无菌注射器
收集5—10ml尿，长期留置导尿管
患者，应在更换新尿管时留取尿
标本；
（三）细菌学检验
• 1、检验程序
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三 泌尿标本
一 尿液标本
• 中段尿培养加计数对于泌尿道感染的 诊断有重要价值。细菌培养必须结合 菌落计数辨别是否为病原菌。
• 有致病菌或条件致病菌生长，正常尿 液菌落计数不超过103cfu/ml，菌落计 数>105cfu/ml，提示感染（膀胱炎， 肾盂肾炎、肾或膀胱结核等）。
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•常见病原菌主要有大肠埃希 菌、葡萄球菌、链球菌、变 形杆菌和伤寒沙门菌等。
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尿液标本
• 无菌采集中段尿
• 如考虑厌氧菌感染， 采取膀胱穿刺法采 集标本。
现代微生物学检验基本技术
现代微生物学检验基本技术随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。
医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。
第一节微生物形态学检查细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，它是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应性等，为进一步鉴定提供参考依据。
一、显微镜检查由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。
一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。
常用显微镜有如下几种。
1．普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。
显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。
故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。
普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。
2．暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动。
在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。
3．相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。
在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。
4．荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。
目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。
滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。
用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。
细菌的生化试验—硝酸盐还原实验(微生物检验课件)
有助于鉴别肠杆菌科、嗜血杆菌属、奈瑟菌属、布兰汉菌属、假单胞菌属等。
硝酸盐还原试验结果
-+
红色为阳性 无色为阴性
硝酸盐还原试验结果
+
-
无色+锌粉→无色：阳性 无色+锌粉→红色：阴性
硝酸盐ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ原试验
原理：
使硝酸盐还原的细菌能从硝酸盐中获得氧，使其成为亚硝酸盐或其它还原物。 培养基中的亚硝酸基能与α-萘氨和苯磺酸形成红色的N-α-萘氨偶氮苯磺酸。 若出现红色现象则说明该菌还原硝酸盐。
硝酸盐还原试验方法
方法：
取一环待检菌接种到硝酸盐琼脂斜面上，35℃培养18~24小时，然后依次加入含α萘氨和对氨基苯磺酸的试剂各1mL，30s后观察结果。
实验食品中细菌总数、霉菌和酵母菌的检验
实验 食品中细菌总数、霉菌和酵母菌的检验一、实验目的要求1、了解细菌总数检验的意义。
2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法3、掌握国际法测定菌落总数的方法和技能4、掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能5、熟练无菌操作技术。
二、原理菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。
霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。
霉菌和酵母也可造成中腐败变质。
由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。
由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。
霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。
例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等 。
因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。
目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。
我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。
三、试剂和仪器细菌总数的检验部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml广口瓶 1个 稀释样品2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支 稀释样品5、1ml移液管 5 支6、直径为90mm平皿 10套 倒营养平板7、250ml量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm（二）应灭菌、消毒的器材剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只， 开瓶器（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1、0.85%NaCl生理盐水 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2、营养琼脂： 2瓶 100ml/瓶 250ml三角瓶食品中霉菌和酵母菌的计数部分：（一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌）规格名称 数量 用途1、500ml广口瓶 1个 稀释样品2、500ml三角瓶 1个 配制生理盐水3、250ml三角瓶 2个 配制营养琼脂4、18×180mm试管 3支 稀释样品5、1ml移液管 ５ 支6、10ml移液管 1支6、直径为90mm平皿 10套 倒平板7、250ml量筒 1支8、玻璃珠：直径约5mm 适量（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把 不锈钢药匙1把 称量纸：适量酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只（三）应制备的培养基培养基总量 所用容器1.灭菌蒸馏水： 1瓶 300ml/瓶 500ml三角瓶2.高盐察氏培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶3.孟加拉红培养基： 1瓶 120ml/瓶 250ml三角瓶四、实验内容细菌总数的检验部分：（一）、基本操作过程：样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。
微生物检验学之细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L型的检查一、基本条件（一）细菌实验室中华人民共和国卫士行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
7.细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、CO2培养箱、厌氧培养设备；用于观察细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备培养基时用的pH计；细菌检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
(完整word版)细菌学检验
细菌学检验重点第一章细菌学实验的基本要求1、实验室生物安全(Laboratory biosafety）：实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。
2、生物安全防护基本要求实验室生物安全防护（biosafety protection for laboratories）–实验对象：致病的微生物及其毒素–综合措施：实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序和规程等–确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。
实验室生物安全通用原则•积极防止操作者在污染的环境中接触生物危害物；•主动封闭生物危害材料产生之源,防止从操作部位向周围环境释放；•尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。
3、实验室必须设有专职的生物安全负责人实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人。
生物安全等级•生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级.–实验室生物安全防护要求：一级最低，四级最高。
4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区和污染区5、各级生物防护实验室特点•一级生物安全防护实验室（BSL—1/P1）：适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生物实验室等.•二级生物安全防护实验室（BSL-2/P2 ）实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。
在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时,在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。
•三级生物安全防护实验室(BSL—3/P3）：适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗.•四级生物安全防护实验室( BSL-4/P4 )：适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。
临床微生物检验基本技术标准-2023年5月1日实施
目次范围 (1) 1规范性引用文件 (1) 2术语和定义 (1) 3无菌操作及消毒灭菌技术要求 (2) 4标本处理及制片技术要求 (3) 5染色技术要求 (4) 6显微镜检查技术要求 (4) 7接种技术要求 (5) 8培养技术要求 (7) 9鉴定技术要求 (8) 10分子检测技术要求 (11) 11免疫学检测技术要求 (12) 12质量保证 (12) 13临床微生物检验基本技术标准1 范围本标准规定了医学实验室在临床微生物检验领域的基本技术要求。
本标准适用于开展临床微生物检验的医学实验室。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
GB 19489 实验室生物安全通用要求WS/T 442 临床实验室生物安全指南WS/T 639 抗菌药物敏感性试验的技术要求WS/T 497 侵袭性真菌病临床实验室诊断操作指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1消毒 disinfection杀灭或清除物体上活的病原微生物的方法。
3.2灭菌 sterilization杀灭物体上所有微生物（包括细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物）的方法。
3.3无菌 asepsis指不存在活菌。
3.4无菌操作 aseptic operation防止微生物进入人体或无菌物品、无菌区域的操作。
3.5接种 inoculation将目标微生物转移至适于生长繁殖的人工培养基或活的生物体内的方法。
3.6荧光淬灭 fluorescence quenching指由于荧光分子与其他分子发生作用而出现的光度降低、发光时间缩短乃至停止发光的现象。
3.7一套血培养 a set of blood culture从同一个穿刺点采集的血液，通常分别注入一个需氧血培养瓶和一个厌氧血培养瓶进行血培养。