质粒DNA的小量提取汇总
质粒小量抽提
质粒小量抽提1、UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒（上海生工）(1)将过夜培养的菌液12000rpm离心15s，彻底去除上清；加500μl 1×STE（或1×PBS）重悬菌体，12000rpm离心15s，彻底去除上清；(2)加入100μl Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌；注1：如果不能够充分悬浮，呈现团块状，会使得细菌裂解不完全，降低产量；注2：此时可先将ddH2O放入60℃水浴进行预热。
(3)加入200μl Solution II，立即温和混匀（倾斜45°角，顺一个方向，慢慢旋转离心管），使细菌裂解，室温放置2min；注1：不能剧烈混合，否则会出现基因组DNA污染。
加入溶液Solution II进行裂解的时间，不要超过5min，以溶液由浑浊变清，同时变粘为裂解完全的标志；注2：天气冷时，Solution II中的SDS会析出，故需要将其预热至清澈无沉淀。
(4)加入350μl Solution III，立即上下颠倒5~10次，使之充分中和，室温放置5min；注：如果混有RNA，说明RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入Solution III 后室温延长放臵时间5-10min。
(5)12000rpm，离心10min；注：离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心，并延长离心时间，待完全沉淀蛋白后再取上清到吸附柱中。
实际试验中，可以在室温以最高速（16000rpm）离心10-15min。
(6)将步骤(5)中上清转移到套放于2.0-ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心30s；注：不要吸取到沉淀，否则会出现基因组DNA和蛋白质污染。
(7)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，吸取500μl Wash Solution到UNIQ-10柱，10000rpm室温离心1min；(8)重复步骤(7)；(9)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，12000rpm室温离心2min，以彻底去除Wash Solution；注：将离心后的UNIQ-10柱放入恒温箱中50℃干燥5min，或自然晾干10min，有助于酒精的挥发，提高DNA的洗脱效率。
质粒小量提取
质粒DNA的小量制备
方法
1.接种一个质粒菌落到5ml LB（含相关抗生素）培养液中,37℃摇床生长至饱和状态（过夜）。
2.取1.5m1菌液高速离心20秒 (或6000转/分)。
3.垂悬沉淀在1O0ul GTE溶液中，室温5分钟。
4.加2O0ul NaOH/SDS溶液，混匀置冰浴5分钟。
5.加3M KAC或3M NaAc l5Oul，旋涡混匀，置冰上5分钟。
6.高速离心3分钟，转移0.4m1上清到另一微型离心管中，加0.8m195%乙醇或无水乙醇或0.6倍体积异丙醇，置室温15~20分钟。
7.高速离心3分钟，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次高速离心弃上清，沉淀置37℃孵箱使乙醇挥发。
8.每管加30ul TE或SDW溶解沉淀后，封口，或加RNaseA消化RNA后再纯化，置-20℃备用。
9．用1%的琼脂糖凝胶电泳提取液，于凝胶成像系统观察结果。
质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法) S2517实验室 第三组
Tris-HCl：三（羟甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基 甲烷。在这里，Tris缓冲液主要是做核酸和蛋白质的溶剂。
EDTA：四乙酸二氨基乙烷（二氨基乙烷四乙酸），又叫托立龙、依 地酸。EDTA 是一种重要的络合剂。EDTA用途很广，可用作彩色感 光材料冲洗加工的漂白定影液，染色助剂，纤维处理助剂，化妆品添 加剂，血液抗凝剂，稳定剂，合成橡胶聚合引发剂，EDTA是螯合剂 的代表性物质。能和碱金属、稀土元素和过渡金属等形成稳定的水溶 性配合物。在这里主要作用是降低细胞膜的稳定性。
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溶液二的作用是使细菌细胞壁破裂释放内容物，核酸和蛋白质在碱 性条件下变性。溶液需要新鲜配制。
溶液三的作用是使pH恢复中性，质粒DNA复性，而染色体DNA与 蛋白质-SDS复合物形成白色沉淀。溶液三使用前需用冰预冷。
2.实验中加入酚-氯仿、无水乙醇、70%乙醇和RNaseA的作用分别 是什么？
酚——变性蛋白质； 氯仿——萃取溶液中的酚； 无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA； 70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分； RNase A—— 对RNA有水解作用
2.氨苄西林 100 mg/mL。
3.溶液一 50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 10mmol/L EDTA (pH 8.0)。
4.溶液二 （新鲜配制） 0.2mol/L NaOH , 1％ SDS。 5.溶液三 0.5mol/L醋酸钾60 mL , 冰醋酸11.5 mL ，H2O 28.5 mL。 6.酚/氯仿 将酚和氯仿等体积混合，用Tris-HCl平衡至pH 7.6 ， 置于 棕色瓶中4℃保存。 7.TE缓冲液（pH 8.0) 10mol/L Tris-HCl (pH 8.0) , 1mmol/L EDTA 8.RNase A (10 mg/mL)。 9.70%乙醇、无水乙醇。
质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法).
【操作方法】
将含有pQE30质粒的大肠杆菌TG1 10µl接种到10ml含氨卞 青霉素(100µg/ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜 取1.5ml培养物转入离心管中，10000r/min离心1分钟,吸净 上清液。 将细菌沉淀物悬浮于100µl冰冷的溶液Ｉ中,用旋窝振荡器彻 底悬浮细菌沉淀。 加200µl新鲜配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,轻缓颠倒离心管5次,以 混合内容物,禁止剧烈震荡,置于冰浴中2min。 加入150µl冰预冷的溶液Ⅲ ，盖上管口，反复颠倒数次,然后 使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,随后置于冰浴中5分 钟
【思考题】 思考题】
1.
溶液Ⅰ 溶液Ⅱ 溶液Ⅲ的作用分别是什么 加溶液 加溶液Ⅰ 溶液Ⅱ 溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用分别是什么?加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、 溶液Ⅲ时要注意哪些问题? 溶液Ⅲ时要注意哪些问题
溶液Ⅰ的作用 溶液Ⅰ的作用：分散细胞，螯合金属离子使金属酶失活。 注意：加入溶液后一定要彻底悬浮细菌沉淀，否则所提质粒DNA的纯度 及得率会大大降低。 溶液Ⅱ的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂，核酸和蛋白质变性。 溶液Ⅱ的作用 注意：不能剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基 因组片段。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免 质粒受到破坏。如果未变的清亮，可能菌体过多，裂解不彻底，应减 少菌体量。 溶液III的作用 的作用：使pH值恢复至中性，质粒DNA复性，染色体DNA与 溶液 的作用 蛋白质-SDS复合物沉淀。 注意：溶液加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
【实验原理】
在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变 性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条 互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将 pH值中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原 来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性 而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体 DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物 等一起沉淀下来而被除去，然后用酚-氯仿抽提， 进一步纯化质粒DNA。上清液中的质粒DNA。上 清液中的质粒DNA因不溶于70%乙醇，可在加入 乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
质粒小提
质粒小提（这里试剂盒没有柱平衡步骤）：
1、大离心管4000rpm离心5min，吸除上清；
2、每5ml菌液、加入250μlP2，上下颠倒6-8次，温和，＜5min；
4、加入350μlP3，上下颠倒6-8次，温和；12000rpm离心10min；
5、取上清，加到柱子里，12000rpm离心2min，弃废液；
6、加入去蛋白液HB 500μl，12000rpm离心1min，弃废液；
7、加入75%乙醇700μl，12000rpm离心1min，弃废液；
8、重复上一步；
9、空离一次，12000rpm离心2min，弃收集管；
10、晾干；
11、加ddH2O溶解，放2min，12000rpm离心2min。
注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入250μl溶液P1（先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料
质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告#特选资料DNA（Deoxyribonucleic Acid），中文名叫脱氧核糖核酸，是生命活动的基础物质。
它是各种生物体的特征物质，在细胞的核内存在，也是遗传信息的载体。
病毒DNA也用于各种研究和检测，尤其是在病毒的鉴定及转基因技术中发挥着重要作用。
因此，定性病毒DNA提取及少量DNA琼脂糖凝胶电泳实验都成为实验室检测中必不可少的一项实验内容。
本实验采用DNA提取试剂盒（TOYOBO）进行DNA的提取，特点是无色素、无皂、无蛋白、简便快捷，可以获得高质量的脱氧核糖核酸产物并提高检测效率。
该试剂中的抗腐蚀劑、抑制核糖核酸的酶和其他特殊的保护剂，能够有效防止DNA降解，为提取保护DNA。
本实验做法如下：用离心机将试管内管壁完全湿润，然后在试管中加入灭菌液中离心5min，在电烙铁上将试管放置至400℃时将管口朝内容物烤，使病毒落入管内，加入溶解液将病毒完全溶解，加入避免pH影响的预测液，再加入 DNA提取试剂盒内的DNA提取液，再加入离心液，速度2000rpm/min，离心15min，将DNA分离，收集上清液，即可完成DNA 的提取。
下一步，将提取的DNA溶液经过超滤处理，清洗去盐、去酵氨酸和其他病毒物质，然后将收集的DNA溶液加入加热消化液（20ul加强热金属离子消化液），任务反应器中加入DNA溶液，改变反应器温度逐渐提高，以到达95℃时，保留10min，完成加热消化，之后将消化液在室温空气中反应30min，待反应液体质清澈后，收取液体。
最后，加入检测凝胶（1.2%琼脂糖凝胶）及TBE解剖液，调节溶液酸碱度至7.4,凝胶细胞中加入示性荧光物质即蛋白质标记剂，加入磁控脱水，进行凝胶电泳实验，常用50V ——200V，应用1.0mh氯化钠池，当特征带迁移至仪器中央时，实验完毕。
经上述实验，本实验成功提取了少量 DNA，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳实验证实，获得了琼脂糖凝胶电泳图像，数据获取良好印证实验结果满足实验要求。
质粒DNA的小量快速提取
其他杂质的去除
细菌细胞破坏后，细胞内容物释放出来，除了DNA 外，还有RNA、蛋白质、细胞器碎片、可溶性杂质 如糖、有机酸碱及盐分等。这些都必须通过相应的 技术手段去除。 碱变性中所用的NaOH-SDS溶液还可沉淀大分子 RNA及部分蛋白质。 酚、氯仿可去除蛋白质。 无水乙醇、异丙醇可沉淀核酸，去除可溶性杂质。 两者的区别？ RNase可降解RNA。
一、基因工程简介
概念：应用酶学的方法 在体外将各种来源的遗传 应用酶学的方法, 应用酶学的方法 同源的或异源的、原核的或真核的、 物质 （ 同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA)与载体 与载体DNA接合成一具有自我复 的或人工的 与载体 接合成一具有自我复 制能力的DNA分子 复制子 分子( 制能力的 分子 复制子replicon)，继而通过转 ， 化或转染宿主细胞， 化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 分子。 细胞，再进行扩增提取获得大量同一 分子 也称基因克隆 重组DNA 基因克隆或 也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)
质粒DNA的小量 快速提取
第五次实验 质粒DNA的小量快速提 取制备 目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否 目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否 DNA
确实由载体质粒与目的基因组成， 确实由载体质粒与目的基因组成，已排除其它可能 方式的连接。 方式的连接。 常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切 常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切 DNA 分析； 互补；插入失活；杂交筛选。 分析；α互补；插入失活；杂交筛选。 正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和 正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和 DNA 5.4kb 1.1kb的目的基因 的目的基因。 1.1kb的目的基因。 错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。 错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。 反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大 反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大 ）： 小不同。 小不同。
6小量质粒DNA提取操作
小量质粒DNA提取操作过程(Omega.Eazy nucleic Acid I solation E.Z.N.A. plasmid miniprep Kit I)1.5ml-5ml的菌液↓离心13000g, 1min轻轻倒掉或吸掉培养基，加250ulSolutionⅠ/Rnase A。
涡旋或反复吸吹以充分悬浮细胞. ↓加250ulSolutionⅡ,温柔颠倒旋转EP管使溶菌产物澄清，室温孵育2-4 min.↓（Ⅱ不用时拧紧）加350ulSolutionⅢ并立即颠倒充分混匀直到见白色绒毛状的沉淀.↓离心13000g, 10min可见紧质白色沉淀,立即小心的将上清加入吸附柱上.不要扰动沉淀,不要吸到细胞残片. ↓离心13000g, 1min弃滤液，加500ul Buffer Hb 于吸附柱上, 去除残留蛋白.↓离心13000g, 1min弃滤液，加700ul加乙醇的Wash Buffer 洗柱1min .若乙醇被冰冻则要事先拿到室温. ↓离心13000g, 1min重复上步骤一次(可选)↓弃滤液，必须空离.↓13000g, 1min将柱子放入1.5mlEP管加入40ul超纯水,室温1-2min.↓离心13000g, 1min-20℃保存为了质粒而准备的细胞培养应该从新鲜的平板中的单克隆生长来,从从甘油或液态培养基中直接进行subculturing(分部培养)很可能造成质粒产量的不稳定,或丢失.用新鲜的转化产物或新鲜streaked平板上的分离的单克隆用合适的培养体积合适的培养基及抗生素37℃摇菌16H,这样能得到较好的结果.为了较高的质粒产量,开始的体积要基于细胞的密度,,建议OD600在2.0-3.0.太高的菌液密度会超过纯化试剂的承载能力.需要自己准备的:●离心机至少13000rcf●灭菌离心管1.5ml或2ml●无水乙醇●灭菌的15-50ml的离心管(D6945)重要提示:●把额外提供的RNase A 加入Solution Ⅰ ,在4℃保存●将Solution Ⅱ, Solution Ⅲ中盐沉淀加热到37℃保证沉淀完全溶解.●用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer 浓缩液, “00”加如6ml;“01”加入60ml;“02”加入60ml. 保存于室温.●所有步骤在室温下进行.安全信息:●Solution Ⅱ :氢氧化钠, 刺激.●Solution Ⅲ: 乙酸, 刺激.●Buffer: 异丙醇, 易燃.●RNase A: 核酸酶, 敏化剂.The E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I D6942/6943/694430ug of high-quality plasmid DNA from 1-5ml bacterial culturesThe E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit II D694560ug of high-quality plasmid DNA from 10-15ml bacterial cultures。
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采用碱裂解法提取质粒DNA 步骤如下：
取1.5ml培养好的菌体，10000g离心30s，弃上清， 将细菌沉淀重悬于100μL用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧 烈振荡悬浮菌体。加200μL新配制的溶液Ⅱ，放置 5分钟。加150μL用冰预冷的溶液Ⅲ，冰上放置5分 钟（加一滴氯仿）。12000g离心5（10）分钟，将 上清转移到另一离心管中。用2倍体积的无水乙醇 沉淀双链DNA，振荡混合，于-20℃放置30分钟。 12000g离心10分钟。弃上清，将离心管倒置于一 张纸巾上，以使所有液体流出。用1毫升70%乙醇 洗涤DNA沉淀，小心弃上清，无菌风吹干。用适 当体积的DHR重新溶解核酸，-20℃保存。电泳 检测。
Transferability: conjugative, nonconjugative
compatibility and incompatibility
质粒的不相容性（不亲和性）
compatibility and incompatibility
质粒在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系 密切的不同质粒，不能够在同一个宿主细胞系 中稳定共存的现象
酶切后质粒 原质粒 ocDNA 线状DNA cccDNA
有些质粒既能够整合到染色体上，又能 以游离状态存在，并能携带部分染色体 基因进行转移，它们被称为附加体。
Episomes（附加体）: Plasmids having the ability to integrate into host chromosome
大肠杆菌的F质粒 MW=63MD, 大小为9ห้องสมุดไป่ตู้.5kb， 30um长， 含有约100个基因。
质粒DNA的存在形式有3种：
① 共价闭环DNA（cccDNA）， 常以超螺旋形式存在；
② 开环DNA（ocDNA），此种 质粒DNA的两条链中有一条 发生一处或多处断裂，因此 可以自由旋转从而消除张力， 形成松弛的环状分子；
③ 线状DNA，因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成。 因此质粒DNA电泳的结果中 有可能出现三条泳带，它们 的泳动速度为：cccDNA > 线 状DNA > ocDNA。
质粒DNA的小量提取
原核微生物的核外遗传物质 质粒： 独立于染色体外的可自主复制的遗传成分
Characteristics： Not necessary for bacterial viability
Self-replication: stringent, relaxed
Encode some bacterial properties: fertility(F), resistance, virulence(Vi), bactericin