生物化学讲义20-基因工程及蛋白质工程 考研生物化学辅导讲义

第三部分 分子生物学－信息途径重组DNA 技术中常用的工具酶By Wang Z iiff eng工具 酶功能限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA 连接酶 催化DNA 中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA 切口封合或使两个DNA 分子或片段连接DNA 聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA 分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA 序列分析 ④填补3´末端Klenow 片段又名DNA 聚合酶I 大片段，具有完整DNA 聚合酶I 的5'→3' 聚合、3'→5'外切活性，而无5'→3'外切活性。

常用于 cDNA 第二链合成，双链DNA 3'末端标记等反转录酶 ①合成cDNA②替代DNA 聚合酶I 进行填补，标记或DNA 序列分析多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基第三部分 分子生物学－信息途径➢ 基因重组是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA 进行切割 、连接，组成一个新的DNA 分子的过程，又称DNA 重组。

➢ 基因克隆将重组DNA 分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA 分子，称此为基因克隆、DNA 克隆或分子克隆。

➢ 基因工程实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA 技术或基因工程。

By Wang Z iiff eng第三部分 分子生物学－信息途径限制修饰系统：限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA 带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA➢ 根据限制酶的作用特性，一般分为三类：——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，➢ 其中常用的是Ⅱ型限制酶。

By Wang Ziiffeng第三部分 分子生物学－信息途径➢ II 型限制性核酸内切酶：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分， 辅助因子Mg 2+，位点序列旋转对称（反向重复）。

第三部分 分子生物学－信息途径第二十节 基因工程和蛋白质工程§20.1 基因的克隆§20.2 蛋白质的表达By Wang Ziiffeng第三部分 分子生物学－信息途径第二十节 基因工程和蛋白质工程By Dr.Wang 2008.08By Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径➢同裂酶：来源不同的限制酶，识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。

By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径➢同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。

By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径➢星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性pH，或50%甘油），限制酶的特异性降低。

结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。

例如 HindIII AAG↓CTTBy Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径第三部分分子生物学－信息途径Klenow片段（聚合酶Ⅰ大片断）：By Wang Ziiffeng 第三部分分子生物学－信息途径Klenow片段用途⑴ 补齐双链DNA的3ˊ末端；⑵ 用标记碱基补齐3ˊ末端；⑶ 在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；⑷ DNA序列分析。

5' 3'双链DNA3'5'外切酶Ⅲ5' 3'3' 5'5'- 粘端Klenow DNA聚合酶5'3'变性5'[α-32P]dNTP3'标记末端5'3'+ 标记探针3'5' By Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径Taq DNA 聚合酶（耐热DNA聚合酶）：➢Taq DNA 聚合酶催化DNA合成的最适温度范围70 75℃，➢95℃以上高温，半小时不失活，➢最适合用于聚合酶链反应（PCR）。

By Wang Ziiffeng 第三部分分子生物学－信息途径逆转录酶：逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴ 以单链RNA 为模板，催化合成cDNA单链⑵ 具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶ 以DNA为模板，催化合成cDNA双链。

逆转录酶的应用：⑴ 将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵ 补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶ 代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷ 制备杂交探针等。

By Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径DNA聚合酶Ⅰ：E.Coli DNA聚合酶Ⅰ是一个具有3 种酶活性的多功能性酶。

➢包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性➢应用：⑴ 催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵ 第二条cDNA链的合成；⑶ 对DNA3’突出末端进行标记；⑷ DNA序列分析。

第三部分分子生物学－信息途径分子克隆常用DNA聚合酶：➢DNA聚合酶Ⅰ➢DNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段➢Taq DNA聚合酶➢T4 噬菌体DNA聚合酶By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径碱性磷酸酶：碱性磷酸酶(BAP) 能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。

➢用途⒈ 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。

⒉ 用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。

第三部分分子生物学－信息途径末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)：将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。

➢应用① 探针标记P32-α.dGTPG G G G G G G G32 32 32 3 32 32 32 32② 在载体和待克隆的片2 段上形成同聚物尾，以便于进行连接第三部分分子生物学－信息途径基因克隆常用的载体:是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA 。

常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNABy Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径载体的种类：➢克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：⑴ 能够在受体细胞复制；⑵ 带有药物抗性基因，便于筛选；⑶ 可导入受体细胞。

➢表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。

By Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径DNA连接酶(DNA ligase)：DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。

➢用途（1）两个双链DNA片段连接起来（2）修补带有缺口的双链DNA分子By Wang Z iiff eng历年真题讲解一、填空题27、反转录酶可催化cDNA 合成，水解模板RNA 和。

（08）答案：双链DNA 的合成By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径以质粒为载体的DNA克隆过程By Wang Z iiff eng 第三部分分子生物学－信息途径一、目的基因的获取目的基因是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。

目的基因来源1）制备基因组DNA2）制备cDNA3）聚合酶链反应（PCR）4）人工合成基因By Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径1）制备基因组DNA（基因文库）➢条件：温和，在EDTA或SDS等存在下用蛋白酶K消化细胞、酚抽提。

➢片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离常用噬菌体载体或质粒载体。

➢DNA连接酶连接。

➢进入宿主细胞内培养扩增。

➢用分子杂交、凝胶电泳等方法鉴定。

By Wang Z iiff eng 第三部分分子生物学－信息途径2）制备cDNA （cDNA文库）（1）合成cDNA第一条链反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。

引物是与mRNA3ˊ端 polyA互补的寡聚dT（12～18dT片段）（2）合成cDNA第二条链RNase去掉模板mRNA（3）构建cDNA文库①cDNA两端加接头或衔接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。

衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。

②cDNA与载体相连。

③导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。

By Wang Z iiff eng第三部分分子生物学－信息途径DNA克隆的基本步骤目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接DNA导入受体菌重组体的筛选克隆基因的表达By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径载体必须具备的基本条件:⒈ 有自身的复制子，能独立复制。

⒉ 具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)。

⒊ 具有遗传表型或筛选标记。

⒋ 有足够的容量以容纳外源DNA片段。

⒌ 表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。

⒍ 载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入该非必需区，而载体本身不受影响。

By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径❖为何酶促反应需要那么高的温度？➢为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板➢防止非特异性的引物退火➢延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度➢DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶By Wang Z iiff eng 第三部分分子生物学－信息途径❖影响PCR质量的一些因素？➢模板:选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA 的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。

➢目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC 量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。

可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。

➢引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断。

➢酶：纯度、可信度，碱基错配率<1/1000。

By Wang Ziiffeng第三部分分子生物学－信息途径❖一些衍生的PCR技术⏹逆转录PCR (RT-PCR)⏹套式PCR (nested PCR)⏹反向PCR(inverse PCR)⏹差示PCR（DD-PCR)⏹单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)⏹不对称PCR(asymmetric PCR)⏹锚定PCR(auchored PCR)⏹长程PCR (long and accurated PCR)⏹锅柄PCR (panhandle PCR)By Wang Ziiffeng 第三部分分子生物学－信息途径4）人工合成基因：引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA 合成仪通过化学合成原理合成目的基因。