TAKARA公司pMD19-T说明书
宝生物PCR试剂盒说明书
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mRNA
使用 AMV 反转录酶，配制反转录反应液合成 cDNA 的第一条链。
按以下条件进行反转录反应：
（ 30℃
10 min.）*
42℃～60℃ 15～30 min. 1 Cycle95℃5 min.
5℃
5 min.
* 使用 Random 9 mers 进行反转录时，首先在 30℃下保温 10 min，使 Random
1 ml
1 ml 150 μl
1 ml 25 μl
25 μl
25 μl
【各种引物序列】
引物名称 Random 9 mers Oligo dT-Adaptor Primer Control F-1 Primer Control R-1 Primer M13 Primer M4
各引物序列 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ 包含 dT 区域及 M13 Primer M4 序列。 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′
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●引物选择
用于反转录的引物可视实验具体情况选择 Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer 或特异性下游引 物。对于不具有 Hairpin 构造的短链 mRNA，3 种引物中的任何一种都可以使用，但一般应按以下方法进 行选择。
Random 9 mers
Oligo dT-Adaptor Primer
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●RNA 样品制备
本试剂盒是把 RNA 合成 cDNA，然后再对此 cDNA 进行扩增的试剂盒。RNA 的纯度会影响 cDNA 的合成 量，而制备 RNA 的关键是要抑制细胞中的 RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的 RNA 分解酶的污染。因 此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话 等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 RNA 分解酶的污染。
takara反转录试剂盒说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
— 1—
基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
pMD19-T载体说明书
TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。
本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。
因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。
pMD-19T
效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。 5. 进行切胶回收纯化 DNA 片段时，不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。 6. Solution I 应尽量避免反复冻融。 7. 建议使用新配制的平板培养基。
1 μl
Control Insert*2
1 μl
dH2O
3 μl
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
TaKaRa Code：D104A
pMDTM19-T Simple Vector
目录
内容
●制品说明 ●制品内容 ●保 存 ●纯 度 ●用 途 ●pMDTM19-T Simple Vector的结构 ●实验操作
■Control DNA 片段的克隆实验 ■一般 DNA 片段的克隆实验
pMD18-T载体说明书
TaKaRa Code：D101ApMD®18-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®18-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD®18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control反应。
●制品内容pMD®18-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支Control Insert（50 ng/μl） 10 μl×1支Solution I* 75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存：-20℃●纯度■ Control Insert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA片段。
●用途■ 进行TA克隆，克隆PCR产物。
■ 对克隆后的PCR产物使用Bca BEST TM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种髙效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提髙了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、髙效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率髙。
T载体的制备：1商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72〜751反应，进行末端的加T。
2自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为Xcml,其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3'T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
Takara基因组抽提试剂盒说明书
照说明书的要求进行。 ② DNA 中含有乙醇。在 Rinse B 洗净时，离心速度和时间应严格遵循说明书要求进行。
Q5. 能否使用本试剂盒提取酵母菌中的基因组 DNA？ A5. 不能。因为酵母菌属于真核微生物，其细胞壁的化学组成和结构与细菌不同，因此 Lysozyme 不
TaKaRa Code：DV810A
MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0 （50 次量）
说明书
宝生物工程(大连)有限公司
内容
●制品说明 ●制品内容 ●运输温度 ●保存温度 ●实验前的准备 ●操作方法 ●使用例 ●注意事项 ●Q&A
22 ml
Solution C
35 ml
DB Buffer
25 ml
Rinse A
28 ml
Rinse B*3
24 ml
Elution Buffer
4 ml
*1 RNase A1 为混浊溶液。 *2 若出现沉淀，请于 65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。 *3 首次使用前，请添加 56 ml 的 100%乙醇。
11. 弃 Filter Cup，在滤液中加入 450 μl 的 DB Buffer， 混合均匀。
12. 将试剂盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。
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图 1. 操作流程简图
13. 将上述操作 11 的混合液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 14. 将 500 μl 的 Rinse A 加入至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
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出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物？ A-3 本载体来源于 pUC19 载体。因此，用于 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。 Q-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比有何不同？ A-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比，β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的
B）结 果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC19 DNA。
Control Insert
连接/转化效率 （cfu/μg Vector）
白色菌落比率（%）
效率（%）*
＋
2.8×106
96.3
90 以上
－
2.2×105
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
●制品说明
pMDTM19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC19 载体改建而 成，在pUC19 载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行 酶切反应后，再在两侧的 3＇端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产 物的 3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于本载体以 pUC19 载体为基础构建而成，所以它具有同 pUC19 载体相同的功能。此外，本制品中的高 效连接液 Solution I 可以在短时间内（约 30 分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大 大方便了实验操作。本制品中的 Control Insert（500 bp）还可以用于 Control 反应。 本载体与pMDTM18-T Vector 相比，本制品的 β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短， 菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容
pMDTM19-T Vector（50 ng/μl） Control Insert（50 ng/μl） Solution I* * 使用时请于冰中融解。
20 μl×1 支 10 μl×1 支 75 μl×2 支
●保 存： -20℃
●纯 度
■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有 90%以上含有 Insert DNA 片段。
●Q&A
Q-1 怎样提高连接转化效率？ A-1 1. 确认 Insert DNA 片段的 3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真 DNA 聚合酶（如：TaKaRa
Pyrobest、KOD、Pfx、Pfu 等）扩增的 PCR 产物是平滑末端，不能直接进行 TA 克隆。 2. 纯化 PCR 产物。最好使用切胶回收的 PCR 片段，以除去 PCR 产物中的非特异性片段和引物等
TaKaRa Code：D102A
pMDTM19-T Vector
目录
内容
●制品说明 ●制品内容 ●保 存 ●纯 度 ●用 途 ●pMDTM19-T Vector的结构 ●实验操作
■Control DNA 片段的克隆实验 ■一般 DNA 片段的克隆实验
●相关说明 ●使用注意 ●Q&A
Page
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●实验操作
■ Control DNA片段的克隆实验
A）操作方法
1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。
pMDTM19-T Vector*1
1 μl
Control Insert*2
1 μl
dH2O
3 μl
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
*3 Insert DNA的使用量 在进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔比一般为 1 ：2～10。
●相关说明
1. 感受态细胞的选择。 转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想 的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’编码的［LacZ△M15］） 产生 ω Fragment，才可能和载体 DNA 产生的 LacZ α 多肽相结合，表现出 β -半乳糖苷酶活性（α 互补性）。 2. Insert DNA 的要求。 Insert DNA 应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回 收时可使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code：D301 或 DV805A）。 3. Insert DNA 使用量的计算方法。 进行克隆时，Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比一般为 1：2～10，我们可以根据自己的实验情况 选择合适的 Vector DNA 和 Insert DNA 的摩尔数比。Insert DNA 使用量的计算方法如下： Insert DNA 的使用量（ng）=nmol 数×660×Insert DNA 的 bp 数 本载体 1 μl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。 4. 阳性克隆的检测。 DNA片段成功插入至pMDTM19-T Vector中后，一般情况下 β -半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆 体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段 插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kbp的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试 着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩增用引物可以使用BcaBESTTM Sequencing Primers，可以对菌体直接进行PCR扩增。
40.2
0
* 效率是指白色菌落中的目的 DNA Insert 片段的连入效率。
■一般DNA片段的克隆实验
1）在微量离心管中配制下列 DNA 溶液，全量为 5 μl。
pMDTM19-T Vector*1
1 μl
Insert DNA*3
0.1 pmol～0.3 pmol
dH2O
up to 5 μl
-2-
*1 pMDTM19-T Vector的使用量 取 0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMDTM19-T Vector 1 μl（50 ng）的摩尔数约为 0.03 pmol。
*2 Control Insert Control Insert 为 500 bp 的 3′末端带有 A 碱基的 PCR 产物，Control Insert 1 μl（50 ng）的摩 尔数约为 0.15 pmol。
2）加入 5 μl（等量）的 Solution I。 3）16℃反应 30 分钟。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ③ 长片段 PCR 产物（2 kbp 以上）进行 DNA 克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMDTM18-T Vector连接转化后，一般要经 37℃过夜培养，然后 再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能明显呈色。而pMDTM19-T Vector涂板培养后一般 只需 10 个小时（37℃）便可以呈色。因此，pMDTM19-T Vector比pMDTM18-T Vector更适合于蓝 白菌落的筛选。
杂质。进行切胶回收时可以使用 TaKaRa 凝胶回收试剂盒（TaKaRa Code：D301 或 DV805A）。 3. 请使用转化效率大于 108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。 4. DNA 片段的立体结构、DNA 片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段 DNA 的克隆
效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。 5. 进行切胶回收纯化 DNA 片段时，不要使 DNA 片段在紫外线下暴露时间过长。 6. Solution I 应尽量避免反复冻融。 7. 建议使用新配制的平板培养基。
●使用注意
1. Solution I 请于冰中融解。 2. 克隆时使用的 Insert DNA 片段（PCR 产物）建议进行切胶回收纯化，否则 PCR 产物中的短片段
DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响 TA 克隆效率。 3. 按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过 20 μl。当要转化的 DNA 量较大或