takara 胶回收试剂盒说明书
TAKARA公司pMD19-T说明书
出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
Q-3 欲对克隆 DNA 片段进行测序时，使用何种引物？ A-3 本载体来源于 pUC19 载体。因此，用于 pUC19 载体测序的通用引物都可以使用。 Q-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比有何不同？ A-4 pMDTM19-T Vector与pMDTM18-T Vector相比，β -半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的
B）结 果 使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108 cfu/μg pUC19 DNA。
Control Insert
连接/转化效率 （cfu/μg Vector）
白色菌落比率（%）
效率（%）*
＋
2.8×106
96.3
90 以上
－
2.2×105
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
注） ① 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ② 5 分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至 100 μl JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 5）42℃加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 6）加入 890 μl SOC 培养基，37℃振荡培养 60 分钟。 7）在含有 X-Gal、IPTG、Amp 的 L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8）挑选白色菌落，使用 PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。
takara反转录试剂盒说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。
E.Z.N.A Gel Extraction Kit 琼脂糖凝胶回收试剂盒 中文 说明书
琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit适合于D2501-**,D2500-**&D2502-**准备工作1. 浓缩的SPW Buffer需用乙醇按如下稀释:D2500-00&D2501-00&D2502-00 加入20ml 100%的乙醇;D2500-01/02&D2501-01/02&D2502-01/02 每瓶加入100ml 100%的乙醇;注意:稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存;所有步骤必须在室温下进行.操作方案配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段.任何类型或等级的琼脂糖都可以使用.我们强烈的推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量;2. 电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来.并尽量去除多余的凝胶.注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒,同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜.3.称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积.一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化,其间每隔2-3分钟混匀一次;重要提醒:在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-Binding Buffer混合物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少.观察混合物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5μl 浓度为5 M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值.经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.一般情况下,使用新鲜的电泳缓冲液,凝胶-Binding buffer混合物的PH值的不会升高;4.转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10,000×g离心1min,弃去液体.一个HiBind DNA柱子最多可容纳700μl的溶液,如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl,可先转移700μl溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上.但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μg DNA.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中.5. 将柱子重新套回收集管中,加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中;室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;这一步相当关键,不要忽略此步.6.将柱子重新套回收集管中,加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;注:SPW Wash buffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释.7. 将柱子重新套回收集管中,重复加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟, 弃去滤出液;,将空柱子重新套回收集管中,10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体.这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的.8. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,10,000×g离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度.如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低.DNA的产量及质量:把纯化产物的样品稀释一定的倍数后,分别在260nm和280nm下测其光吸收值,回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算: DNA浓度=光吸收260×50×稀释倍数μg/ml长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量. 而50bp~500bp的带则可达到55%~80%的回收率.(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸纯度的一个标记.如果此值1.8,则意味着核酸的纯度>90%.另一方面,如果纯化产物的产量较低时,可以用琼脂糖EB电泳估算产物的浓度.载体。
pMD19-T载体说明书
TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。
本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。
因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。
TAKARA植物DNA提取试剂盒说明书
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 M
1.0 kbp 0.5 kbp
2.0 kbp
PCR 反应液 4 μl，1％ Agarose 电泳，M：Wide-Range DNA Ladder（50～10,000 bp） 图 3 以提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增的电泳图
图 1 从植物组织中提取的基因组 DNA 电泳图 -2-
表 1 从植物组织中提取的基因组 DNA 纯度*
样品名称
样品量
Sample No.
A260/A280
A260/A230
20 mg
1
拟南芥幼芽
2
3
50 mg
4
2.2
1.4
2.2
1.4
2.1
1.7
2.1
1.7
20 mg
5
6
西红柿幼芽
7
50 mg
8
图 5 以提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增的电泳图
注：长时间存放可能会有夹杂物沉淀，尽量迅速进入 下一步操作。
12. 12,000 rpm 4℃离心 10 分钟。 13. 弃上清，注意不要吸取沉淀。
注：沉淀有时肉眼看不见。
14. 加入 1 ml 70％乙醇，清洗沉淀。 15. 12,000 rpm 4℃离心 3 分钟。 16. 弃上清，注意不要吸取沉淀。 17. 沉淀干燥，加入适量 TE Buffer（约 20 μl）溶解沉
2. 取出冻结的植物组织于室温放置 5 分钟左右，使其融解。 3. 轻微离心，将植物组织收集在 Microtube 底部。 4. 使用 Pipet Tip 尖端将植物组织按压 Microtube 底部 10 次左右，进行物理破碎。 5. 加入 400 μl 的 Extraction Solution 1，剧烈振荡 5 秒钟。如果植物组织仍滞留于 Microtube 底部，
基因工程实验-biochemlab
实验二 基因组总ＤＮＡ提取
一、实验目的
掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。
生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。
生物化学资料网
五、思考题
生物化学资料网
如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？
01
实验目的
02
掌握重组质粒的转化方法
03
生物化学资料网
实验六 重组质粒的转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。
化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。
生物化学资料网
ＤＮＡ重组、转化 ＭＨＣ与pMD18-T连接 DH5a感受态细胞制备
转化、平板涂布、培养
筛选与鉴定 抗生素抗性筛选 挑单菌落培养 提取质粒 质粒酶切、电泳检测
2.微量移液器的使用
将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否则液体进入吸头太快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头
TaKaRa Virall RNA 抽提说明书9766
-1-
● 操作方法
操作流程见图 1，分为病毒裂解、RNA 或 DNA 与膜结合、RNA 或 DNA 纯化等步骤，病毒裂解后的操作约需 20 分钟（如果起 始材料为感染病毒的组织则需要经过液氮研磨），详细说明如 下：
1. 病毒的裂解： 使用不同的实验材料需采用不同的裂解步骤，具体说明如下：
◆ 血浆、血清、无细胞体液、病毒原液中病毒的裂解： ① 取 10～200 μl 的血浆、血清、无细胞体液、病毒原液，
10~100 μl 的全血，如果起始量不足 200 μl，用 PBS 溶液 或 RNase free dH2O 补足至 200 μl。 ② 加入 200 μl 的 Buffer VGB、20 μl 的 Proteinase K 和 1.0 μl 的 Carrier RNA，充分混匀于 56℃水浴温浴 10 分钟。 ③ 向裂解液中加入 200 μl 无水乙醇，充分吸打混匀。
RNA 或 DNA 溶液
7. 将 Spin Column 安置于新的 1.5 ml RNase free collection
tube 上，在 Spin Column 膜的中央处加入 30～50 μl 的 RNase free dH2O，室温静置 5 分钟。
图 1. 操作流程简图
注）洗脱制备膜上的 RNA 时，请使用 RNase free dH2O。
1.0E+05 copies 的 Flury 株狂犬病毒。
Q2. 本试剂盒的应用范围如何？ A2. 本试剂盒应用范围较广，可进行血浆、全血、无细胞体液、病毒原液和感染病毒组织的 DNA/RNA 提
取。
Q3. 提取的核酸反应性能差，为什么？ A3. ① 提取的核酸中盐份浓度过高。在使用 Buffer RWA 和 Buffer RWB 进行核酸制备膜的清洗时，请沿
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理
PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。
【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。
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操作流程
1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。
胶块超过300 mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。
注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。
3. 切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表：
凝胶浓度Buffer GM使用量
1.0％3个凝胶体积量
1.0％～1.5％4个凝胶体积量
1.5％～
2.0％5个凝胶体积量
6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。
此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5～10分钟）。
7. 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液（pH5.2）10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。
当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。
8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。
注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。
10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。
注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11. 重复操作步骤10。
12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。
13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30 μl 灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。
注）将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。