TAKARA 实验室常规试剂配制方法
TaKaRa一步法RT-PCR提取法
*2 用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。ABI PRISM® 7000/7700 和 Applied
Biosystems® 7300 Real-Time PCR System 使用 ROX Reference Dye，7500
Real-Time PCR System 使用 ROX Reference Dye II，Thermal Cycler Dice Real
的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测
反应体系中的荧光强度，可以达到检测 PCR 产物
扩增量的目的。具体原理见右图。
-2-
● 制品内容（50 μl 反应×100 次）
1. 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ*1（2×）
840 μl ×3 支
2. TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μl）
RNase Free dH2O
7.5 μl
Total
25 μl
*1 通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.1～1.0 μM 范围 内调整引物浓度。
*2 探针浓度与所使用的 Real Time PCR 扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，使用时 请参考仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。使用 Smart Cycler® System 时， 通常探针终浓度在 0.1～0.5 μM 范围内进行调整。
Stage 2：PCR 反应 Repeat：40 times 95℃ 5 sec 60℃ 20 sec
◆特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化 学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。 如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。PCR 反应前的反转录酶的热变性失活通常设定为 95℃、10 sec。
实验室常规试剂配制
实验室常用试剂、缓冲液的配制1 M Tris-HCl(pH7.4, 7.6, 8.0)组份浓度 1 M Tris-HCl配制量 1 L配制方法 1. 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。
2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
4. 将溶液定容至1 L。
5. 高温高压灭菌后，室温保存。
度每升高组份浓度配制量配制方法10×组份浓度配制量配制方法3 M组份浓度配制量配制方法组份浓度137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4配制量 1 L配制方法 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。
2. 向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3. 滴加浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1 L。
4. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。
10 M 醋酸铵组份浓度10 M 醋酸铵配制量100 ml配制方法 1. 称量77.1 g醋酸铵置于100～200 ml烧杯中，加入约30 ml的去离子水搅拌溶解。
2. 加去离子水将溶液定容至100 ml。
3. 使用0.22 m m滤膜过滤除菌。
4. 密封瓶口于室温保存。
注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。
Tris-HCl平衡苯酚配制方法1. 使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。
但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应避免使用。
同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须在160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。
因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
2. 操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。
TaKaRa一步法RT-PCR提取法
0.5 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ
0.5 μl
PCR Forward Primer（10 μM）
0.5 μl 0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM）
0.5 μl 0.2 μM*1
TaqMan® Probe
1 μl*2
Total RNA
2 μl*3
独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 3. One Step RT-PCR Buffer III 是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，操作简单，能有效避免污染。
● 使用注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。 1） 当同时需要进行数次 Real Time One Step RT-PCR 反应时，应先配制各种试剂的混合液（Master
takara反转录试剂盒说明书
Code No. RR047A 研究用PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ● Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。
为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。
但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。
在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。
而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。
Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。
同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。
使用本制品合成的cDNA适用于SYBR® Green分析法和TaqMan®探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR Premix Ex Taq™ II（Tli RNaseH Plus）（Code No. RR820Q/A/B）、Probe qPCR Mix（Code No. RR391S/A/B）组合使用。
TAKARA植物DNA提取试剂盒说明书
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 M
1.0 kbp 0.5 kbp
2.0 kbp
PCR 反应液 4 μl，1％ Agarose 电泳，M：Wide-Range DNA Ladder（50～10,000 bp） 图 3 以提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增的电泳图
图 1 从植物组织中提取的基因组 DNA 电泳图 -2-
表 1 从植物组织中提取的基因组 DNA 纯度*
样品名称
样品量
Sample No.
A260/A280
A260/A230
20 mg
1
拟南芥幼芽
2
3
50 mg
4
2.2
1.4
2.2
1.4
2.1
1.7
2.1
1.7
20 mg
5
6
西红柿幼芽
7
50 mg
8
图 5 以提取的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增的电泳图
注：长时间存放可能会有夹杂物沉淀，尽量迅速进入 下一步操作。
12. 12,000 rpm 4℃离心 10 分钟。 13. 弃上清，注意不要吸取沉淀。
注：沉淀有时肉眼看不见。
14. 加入 1 ml 70％乙醇，清洗沉淀。 15. 12,000 rpm 4℃离心 3 分钟。 16. 弃上清，注意不要吸取沉淀。 17. 沉淀干燥，加入适量 TE Buffer（约 20 μl）溶解沉
2. 取出冻结的植物组织于室温放置 5 分钟左右，使其融解。 3. 轻微离心，将植物组织收集在 Microtube 底部。 4. 使用 Pipet Tip 尖端将植物组织按压 Microtube 底部 10 次左右，进行物理破碎。 5. 加入 400 μl 的 Extraction Solution 1，剧烈振荡 5 秒钟。如果植物组织仍滞留于 Microtube 底部，
常用试剂及缓冲液的配制
65%(V/V)甘油
配 制 量： 配制方法：
配方： 65%(V/V) 丙三醇
100ml
1. 量取 65ml 甘油（丙三醇） 2. 加入 35ml ddH2O，混匀 3. 高温高压灭菌后，4℃保存 4. 或无菌操作，用灭菌 1.5ml 离心管趁热
分装，-20℃保存
10%(V/V)甘油
1M MgCl2
配 制 量： 配制方法：
配方： 1M MgCl2
1L
1. 称取 203.3g MgCl2·6H2O 固体置于烧 杯中
2. 加入 700ml ddH2O，充分溶解 3. 定容至 1L 4. 高温高压灭菌，室温保存
2M MgCl2
配 制 量： 配制方法：
配方： 2M MgCl2
1L
1. 称取 406.6g MgCl2·6H2O 固体置于烧 杯中
100ml
1. 量取 56.9ml ddH2O 2. 加入 43.1ml 浓 HCl（11.6N），混匀 3. 室温保存 注意：先加入水，再加浓盐酸
2.5N HCl
配 制 量： 配制方法：
配方： 2.5N HCl
100ml
1. 量取 78.4ml ddH2O 2. 加入 21.6ml 浓 HCl（11.6N），混匀 3. 室温保存 注意：先加入水，再加浓盐酸
pH＝ Y
I (ml)
5.8
91.5
6.0
86.8
6.2
80.8
6.4
72.2
6.6
61.9
6.8
50.3
7.0
38.5
7.2
28.3
7.4
19.8
7.6
13.4
7.8
TAKARA实验室常规试剂配制方法
TAKARA实验室常规试剂配制方法TAKARA实验室是一家提供生命科学研究和临床诊断解决方案的公司。
其产品线包括分子生物学试剂、细胞培养耗材、蛋白质研究试剂和临床诊断试剂等。
在TAKARA实验室产品的使用过程中，常规试剂的配制方法是非常重要的一部分。
本文将介绍一些TAKARA实验室常规试剂的配制方法。
1. Tris缓冲液的配制方法Tris缓冲液可用于蛋白质电泳，DNA和RNA电泳等实验中。
配制方法如下：1）将Tris酸粉末称取至容器中。
2）加入蒸馏水溶解，并调节pH至所需值（一般为8.0）。
3）使用0.22μm的滤器进行过滤。
2.PBS缓冲液的配制方法PBS缓冲液是一种常用的生理盐水缓冲液，在细胞培养和免疫染色实验中经常使用。
配制方法如下：1）将NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4按指定比例称取至容器中。
2）加入蒸馏水溶解，并调节pH至所需值（一般为7.4）。
3）使用0.22μm的滤器进行过滤。
3.LB培养基的配制方法LB培养基是一种常用的大肠杆菌培养基，在分子生物学实验中经常使用。
配制方法如下：1）将Tryptone、Yeast Extract和NaCl按指定比例称取至容器中。
2）加入蒸馏水溶解，并使用自动调pH仪调节pH至所需值（一般为7.0）。
3）将容器密封，并在121℃高压灭菌器中高压灭菌15-20分钟。
4. RNase-Free水的制备方法RNase-Free水在RNA实验中非常重要，保证实验的可靠性和准确性。
制备方法如下：1）将蒸馏水倒入洁净的玻璃烧杯中。
2）放入微波炉中加热，每隔一段时间取出搅拌一次，直至水沸腾。
3）冷却后，使用0.22μm的滤器进行过滤。
4）将过滤后的水贮存在RNase-Free的容器中。
5.甲醛溶液的配制方法甲醛溶液可用于细胞固定和染色实验。
配制方法如下：1）将甲醛溶液称取至容器中。
2）加入蒸馏水溶解，使浓度达到所需值（一般为4%）。
3）使用0.22μm的滤器进行过滤。
TaKaRaRNAisoReagent
TaKaRa RNAiso Reagent(T otal RNA 提取试剂)2.实验样品的研磨和匀浆。
A.贴壁培养细胞①倒出培养液，用1×PBS清洗一次。
②每10cm 2生长的培养细胞中加入2ml的RNAisoReagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。
*RNAiso Reagent中含有强变性剂，应避免与皮肤、衣物等接触。
若不小心接触到眼睛或皮肤时，请立即到医院进行处理。
【试剂盒之外所需准备试剂】氯仿、异丙醇、75%乙醇（D E P C 处理水配制)、RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.01%（v/v)，过夜搅拌后，高温高压灭菌。
）■保存和运输1.RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月，为保证试剂质量，建议于2-8℃下避光保存。
2.可以在常温下运输。
■制品内容■RNA 提取实验前的准备RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。
因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。
通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。
100mlRNAiso Reagent *Code No.:D312100ml1,000元【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。
1.用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。
2.然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。
【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。
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