pull-down
pull-down蛋白质鉴定流程
pull-down蛋白质鉴定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!1. 样品制备：细胞裂解：将细胞培养至适当密度，收集细胞并使用裂解缓冲液裂解细胞，以释放蛋白质。
pull down和免疫共沉淀的区别
百泰派克生物科技
pull down和免疫共沉淀的区别
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）可在体外检测两种蛋白质之间特
定相互作用的存在。
Co-IP在非变性条件下裂解细胞，保留了许多细胞内蛋白质相
互作用。
如果蛋白质 X 能与抗体特异结合，那么与蛋白X相互结合的蛋白Y会通
过蛋白X与抗体的特异性识别一起沉淀下来。
通过研究蛋白质 Y，可以确认蛋白质X 和 Y 之间的相互作用。
在Co-IP分析中，诱饵蛋白和猎物蛋白呈天然构象状态，其相互作用发生在体内，受外部影响较少，且不需要克隆和异源表达，只需要选择合适的抗体即可开始实验。
Pull Down是一种利用诱饵蛋白富集与诱饵蛋白相互作用的蛋白质的体外亲和纯化
方法。
免疫共沉淀利用抗体蛋白识别并结合相互作用的蛋白X和Y，而Pull Down
将目标蛋白作为诱饵蛋白直接识别并结合能与其相互作用靶蛋白，具有纯化低丰度蛋白质复合物的能力，通常用于体内外的转录系统。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，提供基于Pull Down和Co-IP的蛋白质相互作用分析服务技术包裹，可
以鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用、寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，欢迎免费咨询。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。
这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。
最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。
其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。
（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF））实验方法：方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。
离心机12,000g在4℃离心2min。
将上清转移至新的离心管中。
2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。
在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。
pull-down方法及蛋白表达纯化
3. Pull-down方法LB培养基成分：Tryptone 10 g/LY east Extract 5 g/LNaCl 10 g/L加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，继续滴加去离子水定容至1 L，高温高压灭菌后，冷却至室温。
固体培养基灭菌前加入Agar（15 g/L），含抗生素的LB灭菌后加入1 ml卡那霉素（Kanamycin,100mg/ml）或者1 ml氨苄青霉素后（Ampicillin,100mg/ml）混匀，4℃保存备用。
3.1 诱导融合蛋白方法（1）吸100μl菌液于5ml LB液体培养基中，37℃，230rpm过夜培养。
（2）按1:50的比例转接至20ml LB中，37℃，230rpm培养2-3h至OD600达到0.6-0.8之间。
（3）加IPTG（终浓度1mM）进行诱导。
（4）继续培养1-2h。
（5）将菌液转移至50ml离心管中，4000rpm 离心10min。
（6）弃上清，将离心管倒置在吸水纸上吸干。
（7）按1ml 菌液加50μl PBS溶液的比例悬浮细胞，吸打均匀。
（8）按100:1的比例加入裂解酶（25ml 细胞悬浮液加25μl 裂解酶），混匀室温放置5min（如裂解物太粘稠，可用10μg/ml DNase处理）。
（9）把裂解的细胞悬浮液放入液氮中20s，再将其放入37℃温水中融化，反复10次。
（10）12000rpm 离心10min，吸取上清到另一离心管中。
（11）吸取部分样品中加入2×上样Buffer，混匀，SDS-PAGE电泳。
3.2 带His标签蛋白纯化（康为世纪Ni-Agarose resin for 6×His-tagged proteins）表达载体为pET28a，表达菌株为全式金公司Transetta。
大肠杆菌表达系统，可溶性蛋白的纯化：（1）收集菌体后，将菌体重悬于Binding Buffer，裂解菌体。
（2）将凝胶灌柱，依次用3倍体积的去离子水和8倍体积的Binding Buffer平衡。
蛋白相互作用Pull-Down实验
蛋白相互作用Ｐulｌ—Ｄｏwn实验实验原理：Pｕlｌ—Down技术就是通过蛋白相互作用来研究细胞通路得有力工具。
就是确定两种或更多蛋白之间相互作用得体外方法。
Pｕll—Dｏwn实验可用来检测已知得蛋白相互作用条件,并且可用来筛选未知得蛋白相互作用。
用作诱饵得蛋白就是重组蛋白，会含有一个用于纯化得亲与标签。
这个融合标签就就是用于Ｐull—Dｏｗn实验得基础.最常见得标签为谷胱甘肽S－转移酶（GＳＴ）与多组氨酸(6×His）。
其分别使用固相化得谷胱甘肽与固相化得金属螯合物亲与配体（如Ｎi2+与Ｃo2＋）。
实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达得含标签得纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：ＢindinｇBuffer/Wａｓhing Buffeｒ：４、2mM Na2ＨPO4、2ｍM KH2PＯ4、140mM ＮaＣl、10mM ＫClSDＳloaｄing Ｂｕfｆｅr：50mＭTｒｉs—Ｃl（ｐH6、８）、２％ＳＤS、0、1％溴酚蓝、1０％甘油、１0mM DTT裂解缓冲液:20mM Tris-Cｌ（pH8、０）、200mM NａCl、1mM EＤTA(pH8、0)、0、５％Noniｄｅt P－４0 使用前加入加入蛋白酶抑制剂.(蛋白酶抑制剂:2ug/uｌ抑肽酶（aprｏｔinin）、1ug／ul白胃素(ｌeupeptin）、0、７ug／ml胃酶抑素(ｐeｐｓｔatｉn）、25ug/ml苯甲磺酰氟(ＰMSF））实验方法:方法一：1、预清除细胞裂解液:将细胞裂解液与50ul得５0%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液与25ug ＧSＴ在4℃混合孵育2h。
离心机１2，00０ｇ在4℃离心２min.将上清转移至新得离心管中.2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及5０ｕl谷胱甘肽琼脂糖球珠得微量离心管.在一管中加约10ug得GST蛋白,另一管中加约1０ug得GSＴ融合探针蛋白.两个反应中加入得探针与对照蛋白质得量应该就是等摩尔得.将离心管在4℃翻转混合孵育2h。
pull-down方法步骤汇总
pull-down⽅法步骤汇总GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。
2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM(689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼管中混合均匀。
3) 加⼊1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2h。
4) 加⼊30 µl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2 h。
，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
6) 加⼊1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进⾏洗涤，然后，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
重复 5 次。
7) 加⼊40 µl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离⼼30 sec，吸取上清点样进⾏SDS-PAGE 电泳。
8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。
9) 转膜，使⽤PVDF 膜，使⽤前⽤甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2h。
10) ⽤5 %的脱脂⽜奶封闭膜，60 rpm，1 h。
11) 加⼊⼀抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl anti-His)，60 rpm，1 h。
12) 倒掉⼀抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
13) 加⼊⼆抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。
14) 倒掉⼆抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
In vitro pull down
Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。
Pull-Down实验是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。
Pull-Down实验可用来检测已知蛋白的表达和相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。
Pull-Down实验至少需要一种纯化的标签蛋白（诱饵）用来捕获和“pull-down”靶蛋白（猎物）。
Pull-Down vs.免疫沉淀Pull-Down实验是亲和纯化的一种形式，其与免疫沉淀十分类似，不同之处在于使用诱饵蛋白代替了抗体。
在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。
含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育。
如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。
如果特异结合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。
诱饵蛋白固相化策略1.依赖固相化抗体结合蛋白（例如蛋白A或蛋白G琼脂糖）的免疫沉淀形式显然对pull-down实验不是很有效。
必须使用其他亲和系统固相化诱饵蛋白（例如‘bait the hook’）。
如果有纯化的天然的诱饵蛋白，可将其用生物素进行标记或偶联一些其他小的标签，以适用于现成的亲和树脂。
即用型生物素化试剂及标记试剂盒（见目录第九节，281页），可实现使用链亲和素琼脂糖树脂进行pull-down实验。
2. 如果被用作诱饵的蛋白是重组蛋白，那么其很可能会含有一个用于纯化的亲和标签。
这个融合标签就会成为该诱饵蛋白用于pull-down实验的基础。
最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His），其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体。
pull down蛋白质谱
百泰派克生物科技
pull down蛋白质谱
Pull Down是一种利用体外亲和纯化方法确定两种或多种蛋白质之间的物理相互作
用的方法，既可用于确认由其他研究技术（例如，共免疫沉淀）预测的蛋白质-蛋
白质相互作用的存在，也可作为鉴定以前未知的蛋白质-蛋白质相互作用的初始筛
选测定法。
理解蛋白质结构和功能的第一步是确定哪些蛋白质相互作用，从而确定相关的细胞生理途径。
Pull Down已经成为通过对感兴趣的蛋白质-蛋白质相互作
用研究细胞途径的宝贵工具。
Pull Down将相互作用的蛋白从蛋白混合物中提取出来，需要进一步借助其他技术
进行定性或定量鉴定，Pull Down蛋白质谱就是利用质谱技术对Pull Down拉下的
蛋白进行后续鉴定，以验证预测的蛋白相互作用或发现新的与目的蛋白相互作用的蛋白质。
质谱技术通过分析待测物裂解离子的质荷比实现物质的鉴定，是蛋白质鉴定的强有力技术，且其灵敏度和分辨率以及准确性都具有明显优势，是Pull Down
后进行靶蛋白鉴定的首选技术。
百泰派克生物科技使用Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪结合Nano-LC，利用进口的GST pull-down 试剂盒，提供Pull down靶蛋白质谱鉴定一
站式技术服务。
您只需要将您的需求和样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括样品前处理、pull down、质谱分析、质谱原始数据分析，欢迎免费咨询。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1. Immobilize the fusion-tagged “bait” from the lysate固定裂解液中带融合标签（fusion tag）的诱饵蛋白-------Agarose bead琼脂糖小球--affinity ligand 亲和配体+Bait protein-containing solution裂解液中诱饵蛋白（带融合标签）
2. wash away unbound protein洗去为结合的诱饵蛋白
--------spin旋转
3. Bind “prey” protein to immobilized “bait” protein
---------琼脂糖小球-亲和配体-结合融合标签的诱饵蛋白+prey protein-containing lysate裂解液中的捕获蛋白
4. wash away unbound protein洗去为结合的捕获蛋白
--------spin旋转
5.Elute protein-protein interaction complex 洗脱相互作用蛋白复合物
-------- 琼脂糖小球-亲和配体-结合融合标签的诱饵蛋白-捕获蛋白-------Elution洗脱-------琼脂糖小球-亲和配体+结合融合标签的诱饵蛋白-捕获蛋白(displaced interacting complex置换相互作用复合物)
6. Analyze protein-protein interaction complex by SDS-PAGE
注：
Affinity ligand(glutathione,Co2+chelate or streptavidin)
Fusion tag(GST,polyHis or Biotin)结合在诱饵蛋白上，作为标记
亲和配体和fusion tag相结合。