GST_pull_down试验方法(自己总结)
GST pulldown实验技术
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋 白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清 （如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌 液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
GST-pull down
GST-pull down 实验一、实验所需试剂及配制：1、LB培养基成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl（1）称取下列试剂，置于1L烧杯中：Tryptone 10 g；Y east Extract 步骤：5 g；NaCl 10 g（2）加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解（3）滴加NaOH调节PH值至7.0-7.2（注：1L培养基约需5 MNaOH 1 ml）（4）加去离子水定容至1L（5）高温高压灭菌后，4 ℃保存。
2、LB/Amp 培养基配制成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl0.1 mg/ml Amp（氨苄青霉素）步骤：（1）--（5）同上（6）高压后，温度降至60 ℃以下，加入1L Amp（100 mg/ml）后均匀混合，4 ℃保存。
（注：高压后直接加入，温度过高易使抗生素灭活）3、Amp （100 mg/ml）配制：步骤：（1）称量5 g Amp置于50 ml离心管中（2）加入40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml（3）用0.22 um过滤膜过滤除菌（4）小分分装（1 ml/分）后，-20 ℃保存。
4、LB固体培养基配制：成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl15 g/L 琼脂糖粉步骤：（1）同LB培养基称取上述试剂充分混匀后并调PH值（2）高压灭菌后，等待培养基冷却至50-60 ℃，加入抗生素，摇匀（3）超净台中均匀铺板，待冷却凝固后，4 ℃密封保存（注：每个板子大约需要25 ml培养基）二、目的质粒转化大肠杆菌、菌种挑取及保存（一）转化1、-80 ℃冰箱中取感受态细菌（15 ul），冰上解冰。
2、加入质粒DNA溶液（5 ul），轻摇匀，冰上放置30 min。
3、42 ℃水浴中热击45s，促使细菌吸收质粒，热击后迅速置于冰浴冷却2 min。
GST pull-down实验技术
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存 菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用 筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以 免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤 一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸 净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上 样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。
其鉴定蛋白纯化结果的原理如下：
- 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合；
- 融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合；
- 将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间；
- 洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。
通过观察电泳结果，可以分析出蛋白间的互作关系，从而鉴定蛋白纯化结果。
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）
GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。
GST-pulldown操作说明
GST Pulldown（研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用）1、取两只1.5mL EP管，标记为实验组和对照组，并向每支管中分别加入25μL GST-beeds 20%乙醇充分混合液。
2、加入Wash buffer 1 洗涤两次，每次500μL，5000rpm，4℃离心30s去除上清液。
Wash buffer 配比如下：Tris-HCL 50 mMNaCL 100mMTriton X 100 0.1%DTT 1mMpH 7.5注意：操作轻柔，避免beeds的损失；超纯水清洗注射器避免交叉污染。
3、分别在对照组和实验组中加入等物质量的GST（25kD）蛋白和GST-cdc48（130kD）蛋白,其中GST蛋白为20μg，GST-cdc48蛋白为20*（130/25）=104μg。
4、使用Buffer 1 调整上述反应体积为300μL，4℃慢摇孵育1h。
5、5000rpm，4℃离心30s去除上清液。
6、对照组和实验组分别加入5倍摩尔数的Rpn11蛋白，Rpn11蛋白的量为20*（51/25）*5=200μg。
7、使用Buffer 1 调整上述反应体积为300μL，4℃慢摇孵育1h。
8、5000rpm，4℃离心30s去除上清液。
9、使用Wash buffer 1 洗涤三次，每次500μL，操作如前。
换用500μL Wash buffer 2再洗涤一次，彻底吸除buffer。
Wash buffer 2 配比如下：Tris-HCL 50 mMNaCL 100mMDTT 1mMpH 7.510、再往对照组和实验组分别加入30μL 2×SDS PAGE loading buffer，混匀，沸水煮5min。
12000rpm离心三分钟，取10μL点样跑小孔聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶泳道图如下。
11、其中Input上样量为GST-pulldown 的1/5.。
GST-pull down 方案 方法 流程
GST-pull down 技术一大量制备GST蛋白1 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜2 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.63 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。
（IPTG 0.5mM，20℃,150rpm 培养10~16小时）4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。
（如需要该步沉淀能保存在-80℃）5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。
（50ul初始匀浆加入40ulPBS）三结合GST蛋白1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。
2 4℃，500g离心5min后弃上清3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS 洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)4 4℃，５00g离心5min后弃上清5 重复步骤3和4两次，共三次四预清除细胞裂解液1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。
pull-down方法步骤汇总
pull-down⽅法步骤汇总GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。
2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM(689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼管中混合均匀。
3) 加⼊1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2h。
4) 加⼊30 µl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2 h。
，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
6) 加⼊1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进⾏洗涤，然后，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。
重复 5 次。
7) 加⼊40 µl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离⼼30 sec，吸取上清点样进⾏SDS-PAGE 电泳。
8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。
9) 转膜，使⽤PVDF 膜，使⽤前⽤甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2h。
10) ⽤5 %的脱脂⽜奶封闭膜，60 rpm，1 h。
11) 加⼊⼀抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl anti-His)，60 rpm，1 h。
12) 倒掉⼀抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
13) 加⼊⼆抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。
14) 倒掉⼆抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。
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12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。
（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。
（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。
（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。
（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。
转移至5ml离心管。
（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。
破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。
（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。
（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。
12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。
（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。
（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。
反复5次。
（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。
12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。
（2) 3krpm离心5min，弃上清。
该Sepahrose上即结合了GST融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3) 在管中加入离心后的 1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。
3krpm离心5min，弃上清。
重复该步骤多次，就可以使Sepahrose 上结合6～10ml 裂解液中的GST融合蛋白。
（4) 在管中加入预冷的200μl PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3krpm离心3min，弃上清。
（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST融合蛋白的Sepharose。
（6) 如果用于检测，在Sepharose加入15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。
12krpm离心1min，取上清作SDS-PAGE电泳。
（7) 如果用于pull－down测试，参见pull－down 步骤。
14.体外蛋白质结合分析（GST-pull down）（1) 将结合有GST融合蛋白的Glutathione Sepharose 4B悬浮在500μlNETN 缓冲液中加入20～30μl含有其他蛋白的溶液，例如pET发酵的产物,细胞表达的产物等，同时采用结合有GST空蛋白的Glutathione Sepharose 4B平行操作作为对照。
（2) 在水平摇床上，4晃动4～8小时。
（3) 离心（3.6krpm,2min）。
吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose. （4) 加入200μl缓冲液H对Sepharose进行洗涤。
注意加入缓冲液H时要贴壁加，不要直接冲击Sepharose，随后轻柔晃动，使Sepharose重悬即可。
（5) 低速离心（3krpm，2min）吸去上清，注意不要扰动底层的Sepharose。
（6) 重复步骤的洗涤2～3次。
（7) 吸干Sepharose上方的水层后，加入20～30μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于－20℃。
（8) 做SDS-PAGE和Western检测另一个蛋白。
GST 试验流程（梗概）：（1） Glutathione 琼脂糖珠预处理。
（2） GST融合蛋白挂柱：取适量GST-融合蛋白与10μl已经处理过的beads 置于1.5ml离心管中，4℃, 摇床孵育过夜。
（3）孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃,500g离心5min，上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上，用1ml冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次beads。
（4）把转染目的基因的细胞（5×106）裂解在0.5ml细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心20min,收集上清液。
（5）将细胞裂解液上清加入beads中，混匀，4℃，摇床3h。
（6） 3h后，用冰冷的细胞裂解缓冲液洗三次。
（7）加15μl 2×SDS上样缓冲液，煮沸5min.（8） SDS-PAGE,Western Blot或质谱仪分析。
（9）对照（GST）同样处理。
13.pET融合蛋白的表达与纯化13.1 pET32a融合蛋白的表达（1) 将表达融合蛋白的质粒转入BL21DE3中。
（2) 挑单克隆于3ml LA培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（3) 将种子液稀释于50ml 2×YT G中，使起始OD600为0.1。
（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。
（5) 加入50μl 100mM的IPTG,22℃摇菌培养6小时。
（6）收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃5krpm离心5min，弃上清。
（7) 加入10ml Ni-lysis buffer/管，重悬菌体。
5krpm离心5min，弃上清。
（8) 加入2ml Nilysis buffer/50ml菌液，vortex重悬菌体。
转移至5ml离心管。
（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80ul蛋白酶抑制剂。
破壁参数：Frequency:100～200w,60s pause20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。
加100μl 20%TritonX100，冰上放置30min。
（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。
（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。
离心（12krpm,1min），取上清作SDS－PAGE电泳，检测表达情况。
13.2 pET32a融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl Ni-NTA珠子，4℃，摇床上摇反应30min～60min。
（2) 离心3krpm×5min，弃上清。
该珠子上即结合了pET32a融合蛋白，（如果仅仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可以只接合一次，如果要结合更多则接着往下做）（3) 在管中加入离心后的 1.5ml新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应30min～60min。
离心3krpm×5min，弃上清。
重复该步骤多次，就可以使珠子上结合6～10ml 裂解液中的pET融合蛋白。
（4) 在管中加入预冷的200μl Wash buffer（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的联接）,轻晃悬浮珠子，洗涤一次，离心3krpm×3min，弃上清。
（5) 反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余次可以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有pET融合蛋白的Ni-NTA。
（6) 加入60μl Elution buffer，不必吹打，晃动洗脱蛋白。
离心3krpmx5min，吸净上清，pET融合蛋即在上清中。
（7) 如果用于检测，取1～2μl样品，配成15～20μl 1×蛋白电泳上样缓冲液，在沸水浴中煮3min。
离心12krpm×1min，取上清作SDS-PAGE电泳。
（8) 如果用于pull down测试，参见pull down 步骤。
GST pull down与IP之间区别：Co-IP 一般来说是证明两个蛋白的相互作用，但不排除通过第三个蛋白介导的间接相互作用。
GST pull down 一般可用来证明直接的相互作用。
GST pull down也并非都是原核表达来源，真核也可以表达作为饵蛋白GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。
其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)GST:体外纯化蛋白，预测有相互作用的蛋白放在一起（EP管中）证明二者是否有直接相互作用。
体外可能相互作用，但在体内不一定相互作用。
IP：体内（细胞内证明）两种蛋白是否相互作用，但二者不一定直接作用，可能通过桥梁作用在一起（间接作用）。