抑菌试验方法总结课件
抑菌剂效力幻灯系列课件
在农业领域，抑菌剂可用于防治 植物病害和虫害，提高农作物产
量和质量。
在工业领域，抑菌剂可用于抑制 微生物生长和繁殖，保障产品质
量和安全。
02 抑菌剂效力测试方法
CHAPTER
试管稀释法
总结词
一种常用的定量测试方法
详细描述
试管稀释法是一种常用的定量测试方法，用于测定抑菌剂的最小抑菌浓度（MIC ）和最小杀菌浓度（MBC）。该方法涉及在试管中逐倍稀释抑菌剂样品，并与标 准菌株进行培养。根据培养结果，可以确定抑菌剂的效力。
能达到预期的抑菌效果。
作用时间
抑菌剂的作用时间越长，其抑菌效果通常也越好。
对于一些快速繁殖的细菌，需要连续多次使用抑菌剂才能达到预期的抑菌效果。
有些细菌可能在药物浓度高的情况下仍然可以快速繁殖，因此需要持续监测抑菌效 果并进行调整。
细菌种类
不同的细菌种类对不同的抑菌 剂敏感性不同。
对于一些特定的细菌，某些抑 菌剂可能完全无效。
02
抑菌剂可以是天然的或合成的， 可以是低毒或高毒的，取决于其 用途和浓度。
抑菌剂的分类
根据作用机制，抑菌剂可分为抗代谢 型、细胞膜破坏型、抗生物素型和抗 生长型等。
根据化学性质，抑菌剂可分为抗生素 类、合成类和其他类型等。
抑菌剂的重要性
在医疗领域，抑菌剂可用于治疗 细菌感染和真菌感染等疾病，保
详细描述
最小抑菌浓度是指能够抑制病原菌生长的最低药物浓度。这 个指标可以反映抑菌剂对不同病原菌的抑制效果。一般来说 ，最小抑菌浓度越低，说明抑菌剂对病原菌的抑制效果越好 。
最大抑制浓度
总结词
最大抑制浓度是衡量抑菌剂对病原菌生长抑制作用的另一个重要指标。
详细描述
抑菌试验方法总结==
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实验结果记录：抑菌直径（mm）
药物
细菌 青霉素 （16万 u/ml） 链霉素 （1.0万 u/ml） 磺氨嘧啶钠 (1% ) 四环素 (25 %)
金葡菌
链球菌
大肠杆菌
沙门氏杆菌
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二、试管二倍稀释法 取灭菌小试管10支，按照1至10编号， 排列于试管架上。按照无菌操作，从第一 管到第10管，分别加入牛肉膏汤1ml。用吸 管吸取256μ/ml的青霉素溶液1ml放入第一 管，并反复吹匀；接着从第一管吸出1ml放 入第二管同样吹匀后吸出1ml放入第三管， 依次逐管进行稀释到第８管，第10管不加 青霉素液，作细菌对照组，第９管只加药 物，不加菌液，作为药物对照组。
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【思考题】
• 分别以抑菌圈的大小和MIC值来比较 常见药物对金黄色葡萄球菌的作用强度。
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Careful ,then successful !
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记录实验结果
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
稀释倍数
1
1/2
1/4
1/8
1/1 6
1/3 2
1/6 4
1/1 28
1/2 56
0
稀释浓度(u/ml)
128
64
32
16
8
4
2
1
0.5
－
金色葡萄球菌
抑菌试验方法总结
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
我国药典抑菌效力检查法培训课件
手段。 • 所有抑菌剂都具有一定的毒性，制剂中抑菌剂的量
应为最低有效量。
2/26/2021
National Institutes for Food and Drug Control
我国药典抑菌效力检查法 3
我国药典抑菌效力检查法 13
原始记录
样品信息一致
细菌组原始数据、稀释级别
2/26/2021
National Institutes for Food and Drug Control
我国药典抑菌效力检查法 14
样品信息一致
真菌组原始数据 稀释级别
2/26/2021
National Institutes for Food and Drug Control
我国药典抑菌效力检查法 5
2/26/2021
菌液制备
若为琼脂培养物，加入适 量的0.9%无菌氯化钠溶液 将琼脂表面的培养物洗脱， 并将菌悬液移至无菌试管 内， 用 0.9%无菌氯化钠 溶液稀释并制成每1ml 含 菌数约为108cfu 的菌悬液
若为液体培养物，离心收 集菌体，用0.9%无菌氯化 钠溶液稀释并制成每1ml 含菌数约为108cfu 的菌 悬液。
我国药典抑菌效力检查法 9
供试品接种
细菌组
原位接种，接种菌液的体积 不得超过供试品体积的1%
108cfu/ml
106cfu/ml
Hale Waihona Puke 真菌组原位接种，接种菌液的体积 不得超过供试品体积的1%
6h or 24h 24h or 7D 28D
108cfu/ml 2/26/2021
106cfu/ml
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
抑菌实验原理
抑菌实验原理
抑菌实验原理
抑菌实验是一种常用的实验方法，用于评估化合物或制剂对细菌生长的影响。
其原理基于抗菌剂与细菌的相互作用，通过评估化合物对细菌的生长抑制能力来确定其是否具有抗菌作用。
实验步骤：
1.选取需要评估的细菌株并培养：在实验开始前需要选择优良的细菌株并进行培养。
培养条件需要与实验条件一致并注意菌群的纯化。
2.稀释细菌悬液：选择的细菌株需要用生理盐水等稀释至指定的浓度，以便更好的观察和比较细菌生长的情况。
3.加入待测化合物：将待测的化合物加入到试验瓶或板中，使其充分均匀地分布。
4.接种细菌悬液：将稀释好的细菌悬液分别分装进试验瓶或板中，在培养条件下进行生长。
5.生长评估：观察并记录细菌的生长情况。
在实验中，对于不同的细菌株和化合物，其作用机制和实验设置可能不尽相同。
但是无论是哪种情况，都需要关注细菌与化合物之间的交互关系，在实验过程中充分考虑到实验因素的影响。
此外，在实验过程中也应注意安全和环境保护问题。
实验室要做到整洁和齐全，使用化学品和试剂时避免摆放在易碎和易燃物品附近。
实验后的废弃物要做好分类处理，以免对环境造成污染。
总的来说，抑菌实验是一种简单而有效的方法，用于评估化合物的抗菌能力。
在实验过程中需要注意安全和环保问题，并在实验设计和数据处理中严谨科学，以做到准确评估化合物的抑菌能力。
抑菌试验
1.O/129抑菌试验（1）原理：0／129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制作用。
（2）培养基：碱性琼脂平板。
（3）方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0／129纸片（含药40μg）贴于平板上，35℃培养l8～24h 观察结果。
（4）结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。
（5）应用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对0／129敏感，而气单胞菌属耐药。
2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍于后贴上0.04U／片的杆菌肽纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径>lOmm为敏感，抑菌环直径<lOmm为耐药。
（5）应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。
3.奥普托欣（Optochin）试验（1）原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径：>14mm为敏感，若抑菌环直径≤14mm，对此菌株应再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。
（5）应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。
抑菌试验
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
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实验结果记录：抑菌直径（mm）
药物
细菌 青霉素 （16万 u/ml） 链霉素 （1.0万 u/ml） 磺氨嘧啶钠 (1% ) 四环素 (25 %)
金葡菌
链球菌
大肠杆菌
沙门氏杆菌
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二、试管二倍稀释法 取灭菌小试管10支，按照1至10编 号，排列于试管架上。按照无菌操作，从 第一管到第10管，分别加入牛肉膏汤1ml。 用吸管吸取256μ/ml的青霉素溶液1ml放 入第一管，并反复吹匀；接着从第一管吸 出1ml放入第二管同样吹匀后吸出1ml放入 第三管，依次逐管进行稀释到第８管，第 10管不加青霉素液，作细菌对照组，第９ 管只加药物，不加菌液，作为药物对照组。
抑菌试验方法总结
实验内容
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 影响药物作用的因素 药物代谢动力学实验 处方与药物的配伍禁忌 中毒与解救试验 药物对离体肠的影响 抗微生物药物的体外抑菌实验 生物碱的提取及其药敏实验 药物对离体心脏的影响
实验六、抗菌药物的体外抑菌实验
【实验目的】
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【试剂与器材】 细菌菌液（如金黄色葡萄球菌、链 球菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌）、药液 （青霉素、链霉素、磺胺嘧啶钠、四环 素）、碘酒、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、 氢氧化钠、高压灭菌器、小试管、试管架、 吸管、平皿等。 256μ/ml青霉素溶液： 药敏试纸的准备：
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掌握药敏试验的方法，了解药物对常 见菌的作用。 意义： 体外抗菌试验对临床用药具有参考价值。 鉴定新药是否具有抗菌活性。
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【实验原理】
抗菌作 用 耐 药 性 主 页退 出 上一张 下一张
【基本原理】
抗菌活性：是指抗菌药抑制或杀灭病原微 生物的能力。 两种测定方法：体外与体内（化学治疗实 验）； 评价指标： （1）最低抑菌浓度（MIC）： 能够抑制培养基中细菌生长的最低 浓度。 （2）最低杀菌浓度（MBC）： 能够杀灭培养基中细菌的最低浓度。
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记录实验结果
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
稀释倍数
1
1/2
1/4
1/8
1/1 6
1/3 2
1/6 4
1/1 28
1/2 56
0
稀释浓度(u/ml)
128
64
32
16
8
4
2
1
0.5
－
金色葡萄球菌
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【注意事项】
1. 接种细菌时要在无菌条件下均匀涂抹；用过的棉 签火焰烧灼后丢弃。 2. 用试管二倍稀释法测MIC值，稀释时注意 稀释的顺序；每次移液前注意清洗吸管。 3. 药敏片之间要间隔适当距离，以免抑菌圈 出现交叉。 4. 四人一组，纸片法每人一个平皿，作四种药物对 一种菌的作用，同组每人所接菌种不同，平皿上 做好记号。结果记录时将本组结果综合。
【实验步骤】
一、纸片法 以灭菌小棉签取金黄色葡萄球菌液 （每ml约含3亿个细菌），注意不宜蘸取过 多，以刚浸湿整个棉签为度，轻轻地从四 个不同方向平行交叉划线，使菌液均匀涂 布于整个琼脂平板上。同样方法，也可制 作大肠杆菌平板备用。
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二、纸片法
取已经制备好的4种药敏片：青霉素16万 u/ml 、链霉素10万u/ml 、10%磺氨嘧啶钠、四环 素0.05g / ml ，放置在已接种细菌的琼脂平板表面 的不同区域。为了位置间隔准确，最好事先在平 皿底用蜡笔作上记号。 将培养皿置37℃培养24h，观察纸片周围有 无抑菌环，并测量抑菌圈的直径，比较各药的抗 菌效力。样例如下图：
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【思考题】
分别以抑菌圈的大小和MIC值来比较 常见药物对金黄色葡萄球菌的作用强度。
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Careful ,then successful !
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Hale Waihona Puke 试管号 牛肉膏汤 （ml） 青霉素（ml） 葡萄球菌液 （ml）
1
1 1
2
1 1
3
1 1
4
1 1
5
1 1
6
1 1
7
1 1
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1 弃1
10
1 0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0
0.5
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1-8，10各加入培养18 h并用牛肉膏汤稀释至 5×107～108 cfu/ml的金黄色葡萄球菌菌液 0.5ml。放入37℃培养箱内培养24h后，取 出观察细菌生长情况。 以能抑制细菌生长的最小浓度为青霉素对该 细菌的最低抑制浓度（MIC）。 最低杀菌浓度（MBC） 结果记录于下表：