抑菌试验方案
抑菌试验方案
（一）病虫害的制备
1、病虫害的采集
本实验所用材料分病原菌及害虫两类。
其中病原菌分别从宣木瓜和丹皮两种地道药材植物上采集。宣木瓜的病原菌本实验室已有，并且提取了单一菌种。丹皮方面需要我们查阅资料以及请教师姐，把握最佳采集时间和采集类型，然后我们进行实地考察以及集采。采集丹皮根部，连同根部泥土带回。
（二）抑菌实验———滤纸片法（细菌）
1、 菌悬液制备
将供试菌种在各自适合的斜面培养基上和适宜的温度条件下(细菌37℃,霉菌28℃)于培养箱中培养活化(细菌24 h,霉菌48 h),备用。将活化后的供试斜面培养基用10 mL无菌生理盐水稀释制成含菌量为106～108个/ mL的菌悬液。
2、丝瓜伤流液滤纸片的制备及处理
0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。
2.3划线法分离
2.3.1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。
2.3.2、划线
细滤纸,用钢笔套按一个圆印,剪下(一次剪4个),尽量剪圆。置于三角瓶中,塞上棉塞,高压蒸汽灭菌后浸泡于丝瓜伤流液中, 2 h后用无菌镊子夹出,在瓶口沥去多余丝瓜伤流液,即可贴入刚接种的器皿上。贴入时标记起始位置,按顺时针或逆时针方向将滤纸片顺序贴入。
3、抑菌试验
分别将配制好并已经灭菌的各种固体培养基趁热分别倒入无菌培养皿中,每皿15～20 mL(各皿量要相同),冷却凝固后用吸管吸取0.3 mL被试菌液,加到平皿上,用涂布棒涂布均匀。将灭菌的丝瓜伤流液滤纸片用无菌镊子夹取风干,放在含菌平板上,每皿3片,每种处理丝瓜伤流液做3次重复。细菌置于37℃培养24 h,霉菌置28℃培养48 h,测定滤纸片的抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。
抑菌实验
一、菌种(一)、细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；(二)、真菌：啤酒酵母（Saccgaromyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillusoryzae）3402、黑曲霉（Aspergillus niger）、叶点霉（Phyllosticta maydis ）和刺盘孢霉（Colletotrichum musae）二、培养基（一）细菌培养液：LB液体：胰蛋白胨10.0g酵母提取物 5.0gNaCl 10.0g10mol/LNaOH 100μL蒸馏水定溶至1.0LpH 7.0~7.4如要配置固体LB培养基，加15.0g琼脂糖/L(二)、真菌培养液：马铃薯培养基(PDA)马铃薯(去皮切块) 200.0g葡萄糖 20.0g琼脂 18.0g，蒸馏水 1000mLpH 自然三、器材培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤(一)、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，细菌置30℃，温箱培养1d，霉菌置27℃，温箱培养3d，备抗菌实验用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃，置旋涡混合器混匀。
3、倒平板在超净台里将培养基倒入平板，每板约15mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中，2d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。
4、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。
5、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
抑菌实验程序
抑菌实验程序2 抑菌实验基本程序，先确定抑菌性，后确定最小抑菌浓度(活性)2(1 抑菌性实验:在灭菌平皿中加入牛肉汤培养基后，中间划一线，两侧点接药物和细菌，35?孵育16~20h，看菌与药物接触处菌落是否变形，若变形即为有抑菌性，可进行下面的实验 2(2 最小抑菌活性确定:思路:菌种准备—抗菌培养基(不同梯度剂量)—温育—观察生长情况—确定最小浓度方法:2(2(1 菌种准备:准备10支试管，排成1排，内置去离子水配成的生理盐水(0.8%), 除第1管加入10 ml外，其余每管加入肉汤9ml，在第1管加入活化的菌1-2环，混匀振荡后，吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管中吸取1ml弃去，(使用时可通过预实验数菌落数，也可以直接选用其中的第7，8管)即为浓度为104 CFU,一般可直接用于接种测试。
2(2(2 培养基制备:牛肉浸膏琼脂培养基，以1NNaOH或HCl调pH7.2~7.4,灭菌后备用2(2(3 梯度药物浓度培养基制备:准备十支灭菌水的试管，排成一排，除第1管加入1.6ml无菌水外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取1ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。
根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50?水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1?9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
2(2(4 含药平板上接种:将1中的菌点接在准备好的药物琼脂培养基3中，每点直径可以用灭菌的打孔器打孔，直径5-8mm,接好后置35?孵育16~20h，观察2(2(5 结果评定:将平板置于白色底衬下，确定抑制细菌生长的最低药物浓度，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
实验十二 抑菌实验
2.细菌接种 2.细菌接种
0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第 含菌量相当于麦氏比浊管第1 1/2的 每管加入 0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第1管1/2的 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 1.5
思考题
1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项 2.试述药敏试验的意义 试述药敏试验的意义。 2.试述药敏试验的意义。
操作程序 （以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 1.青霉素稀释 1.青霉素稀释
将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1 将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1～9的管号， 1ml肉汤的试管排成一列 的管号， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml 1ml， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml，混匀后吸取 1ml到第 到第2 混匀，再取1ml至第3 1ml至第 依次类推到第8 1ml到第2管，混匀，再取1ml至第3管，依次类推到第8管。 管不含青霉素的肉汤作对照管。 第9管不含青霉素的肉汤作对照管。
实表1 实表1 细菌对不同抗菌药物敏感度标准
药物名称 抑菌圈直径（mm）
无抑菌圈 ＜10 11～26 ＞26 无抑菌圈 ＜10 11～15 ＞15 无抑菌圈 ＜10 11～25 ＞25
敏感度
不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感
青霉素（50μg/ml）
链霉素（500μg/ml）
新霉素（300μg/ml）
（二）最低抑菌浓度试验
原理：将抗菌药物作倍比稀释， 原理：将抗菌药物作倍比稀释，在不同浓度的稀释 管内接种被检细菌，定量测定抗菌药物的最 管内接种被检细菌， 低浓度。 低浓度。本结论可作为其他药物敏感性试 验的标准方法。 验的标准方法。 实验材料： 实验材料： • • • • • 金黄色葡萄球菌肉汤培养物 普通肉汤 含青霉素64IU/ml 含青霉素64IU/ml 的普通肉汤各一管 麦氏比浊管 灭菌1ml 1ml刻度吸管 灭菌1ml刻度吸管
几种常用抑菌试验方法的评价及比较
几种常用抑菌试验方法的评价及比较
在生物医学研究中，常需要对各种物质的抑菌效果进行评价。
为此，人们开发了多种常用的抑菌试验方法，以便比较不同物质的抑菌效果。
本文将对几种常用抑菌试验方法进行评价及比较。
1. 纸片扩散法
纸片扩散法是一种常见的抑菌试验方法。
在该方法中，将待测物质涂敷在纸片上，然后将纸片放在含有细菌的琼脂平板上，观察细菌生长情况以评价抑菌效果。
该方法具有操作简便、试剂消耗少等优点。
但是，由于涂敷纸片的方法、纸片的大小和厚度等因素可能会影响试验结果，因此需要进行标准化操作以提高试验的准确性。
2. 微量稀释法
微量稀释法是一种通过测定物质最低抑菌浓度来评价抑菌效果的方法。
在该方法中，将待测物质加入不同浓度的液体培养基中，然后加入一定量的细菌。
经过一定时间后观察细菌生长情况，以确定最低抑菌浓度。
该方法具有操作简便、结果可靠等优点。
但是，由于需要进行多次稀释以确定最低抑菌浓度，因此需要耗费大量试剂和时间。
3. 光密度法
光密度法是一种通过测定细菌生长的光学密度来评价抑菌效果的方法。
在该方法中，将待测物质加入液体培养基中，然后加入一定量的细菌。
经过一定时间后，使用光学密度计测定细菌培养液的光学
密度，以确定抑菌效果。
该方法具有准确度高、操作简便等优点。
但是，由于需要使用光学密度计，因此设备要求较高。
综上所述，不同的抑菌试验方法各有优缺点，选择合适的试验方法应根据实际需要和试验条件进行综合考虑。
抑菌效力试验方案
抑菌效力试验方案以下是 8 条主题为“抑菌效力试验方案”的内容：1. 想知道怎么检测那些小细菌是不是能被有效抑制吗？那就得好好设计这个抑菌效力试验方案啦！比如可以先准备不同的抑菌剂，就像给小细菌们准备不同的挑战。
然后把它们放到培养皿这个小战场上，看看哪种抑菌剂能大获全胜！这多有意思呀！2. 嘿，你难道不想搞清楚哪种方法对抑菌最有效吗？来看看这个抑菌效力试验方案呗！就好比一场细菌和抑菌剂的激烈比赛，我们得设置好各种规则和条件。
用不同的浓度、不同的时间去试探小细菌，这不就是在寻找最佳抑菌策略嘛！3. 咱来说说抑菌效力试验方案哈，这可关系到能不能真正把细菌给拿捏住呢！可以像排兵布阵一样安排不同的实验组，不就是和细菌斗智斗勇嘛。
比如一组用这个温度，另一组用那个环境，看谁能把抑菌这件事做得最漂亮！是不是很吸引人？4. 你说说，抑菌效力试验方案是不是超级重要呀！要不怎么知道哪种东西能强力抑菌呢！就好像玩游戏打怪兽，得有策略有方法呀。
选取合适的细菌样本，就像挑对手一样，然后用各种手段去挑战它们，这过程多带劲啊！5. 哎呀呀，抑菌效力试验方案可得好好弄啊！这就好像一场和细菌的赛跑，我们得规划好路线。
比如选择不同的培养基，就如同给细菌准备不同的跑道，看它们在什么样的条件下最容易被抑制，你不想知道结果吗？6. 抑菌效力试验方案，听起来就很有挑战性呢！就像搭积木一样，一层一层地构建。
先确定好试验的步骤，一步一步地来，这多像在小心翼翼地搭建一个城堡呀，最后能不能成功抵御细菌，可就看这方案啦，是不是很想参与进来？7. 快来看这个抑菌效力试验方案呀！是不是感觉就像要开启一场神秘的探险？把各种因素都考虑进去，就像是准备好探险的装备。
然后勇敢地去面对细菌，看谁能笑到最后，难道你不想见证这个刺激的过程？8. 抑菌效力试验方案真的很关键耶！。
抑菌试验
1.O/129抑菌试验（1）原理：0／129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制作用。
（2）培养基：碱性琼脂平板。
（3）方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0／129纸片（含药40μg）贴于平板上，35℃培养l8～24h 观察结果。
（4）结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。
（5）应用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对0／129敏感，而气单胞菌属耐药。
2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍于后贴上0.04U／片的杆菌肽纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径>lOmm为敏感，抑菌环直径<lOmm为耐药。
（5）应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。
3.奥普托欣（Optochin）试验（1）原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径：>14mm为敏感，若抑菌环直径≤14mm，对此菌株应再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。
（5）应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。
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利用吸附法测定壳聚糖无纺布抑菌性能试验方案
一、实验原理：本实验参考了国标GB/T20944方法，根据我们的材料特性进行了微调。
即：选取革兰氏阴性菌（大肠杆菌（25922））和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌（25923））两类代表性指示微生物。
将测试材料浸泡在活化好的菌悬液（浓度控制为107CFU/ml）中，设置不同处理时间，稀释涂布，平板单菌落计数，计算无纺布材料的抑菌性能。
二、实验方法：
2.1试验菌种的活化
1）冻干粉接种至大豆蛋白肉汤(TSB)培养基，37℃培养24h。
一部分用于抑菌试验，另一部分用于划线接种至斜面或平皿冷藏保藏（可保藏1个月）。
2）培养液稀释。
活化好的菌悬液用稀释液稀释20倍，取1ml培养液添加到19ml稀释液（应提前灭菌）中。
3）式样预处理。
大小合适的试样饱和吸水，灭菌处理。
（周教授负责）
4）菌悬液洗涤。
将稀释好的菌悬液转移到试样中，分别震荡15min 和30min，为防止微生物传代，影响试验结果，立即放入冰箱冷藏。
5）洗涤液梯度稀释。
处理后的洗涤液立即梯度稀释到10-1, 10-2,10-3,10-4和10-5。
具体方法：取1ml洗涤原液加入9ml稀释液此时为10-1梯度；取1ml稀释后的10-1菌液加入到9ml稀释液，此时为
10-2梯度；······。
6）涂布。
分别取10-3,10-4和10-5的稀释液200ul涂布到平板（计数培养基，简称EA），每个处理做2个平行，37℃，培养24-48h，计数。
7）抑菌效果评价。
参照GB/T20944。
三、试验简易流程
注：如果活化后的菌液浓度较高，可取10-4、10-5和10-6梯度稀释液涂布。
四：所需准备耗材：
1、大豆蛋白液体培养基（7.1，TSB）
250ml培养瓶装100ml 3瓶，2瓶分别接种，1瓶备用；
2、大豆蛋白固体培养基,（7.2，TSA）
250ml培养瓶装100ml 1瓶，到平板后用于菌种保藏；
3、稀释液（7.5）
15或18ml试管装9ml 50支，42支稀释，8支备用；4、计数固体培养基（7.6，EA）
250ml培养瓶装160ml 6瓶，准备50皿。
5、枪头5ml，1ml，200ml枪头各1盒。
6、75%酒精及棉球若干，玻璃棒15支
7、记号笔，标签纸若干。