抗菌实验方法
抗菌实验规范操作
抗菌实验具体实验步骤一、共培养及换液1.开灯，开风扇，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，点酒精灯2.取出4根10ml的管子3.往管子中分别加入1ml的样品药液：（（在超净台中用0.22um的绿色滤膜与10ml针筒过滤5ml团簇银，并用pbs稀释药物）注：绝大多数细菌的直径大小在0.5μm之间.所以用一张0.22um的滤膜,把样品倒入一次性针管中,在超净工作台中过滤.容器也要注意灭菌）AgNCS：1# Co 、2# 1/2 、3#1/4 、4# 1/8，5#PBS4.先用震荡器摇菌10S（管子均水平放置震荡，以下震荡与此一样）再往这4个管子中分别加入100微升的（P）金葡菌液5.再往这4个管子中分别加入5mlLB,写上标记6.最后用封口膜封好肉汤和共培养的样品7.把共培养的样品拿去摇菌（摇菌参数：37度，6h，150rpm）8.清理桌面，拿走自己的样品和垃圾，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面二、涂板（晚上7点开始涂板子）1.开灯，开风扇，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，点酒精灯；后分别把PBS和样液拿进超净工作台2.放好两个架子的位置（左边放样液，前方放小型试管架）3.把三角涂板器在火焰上灼烧（每个顶点，每条边，均来回灼烧3次）4.取2ml的管子放好，每组样品3个，共12个5.每组管子命名为A,B,C号管子，先往A,B管中加入990ulPBS，再往C管中加入900ulPBS6.摇菌，取10微升菌液，先加入到A中，盖上盖子震荡10S，再取A管10微升液体加入到B中，震荡10S，最后取B管100微升液体到C中7.取C管中50微升液体均匀地滴加到板子的四个正方形顶点位置上，后用三角涂板器顺时针涂100次以上（应涂到干透为止），同时板子也要不停地转动，最后再标记好姓名，日期，菌名，封口，调节移液枪量程至最大，收拾桌面，取出所有相关物品，倒掉大烧杯中垃圾并在喷酒精后放回，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，开半小时紫外，之后务必关闭，后将板子一个一个地倒放在生化培养箱里8.等待12—16h,取出板子观察，数菌，拍照9.清理板子：板子拉开一个口子，并喷上酒精，倒入垃圾桶三、换液（菌落培养24h后换液）1.开灯，开风扇，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面，点酒精灯2.将昨天培养的菌落震荡10S3.取出一只10ml管子，加入100ul菌液4.再加入5mlLB5.封口，标记日期，姓名，菌名6.清理桌面，拿走自己的样品和垃圾，用浸过酒精的纸巾擦次超净工作台台面备注一、倒板子用500ml的锥形瓶装配好LB溶液（配琼脂，500ml超纯水+12.5g肉汤粉+10g琼脂：2瓶；1000ml超纯水+25g肉汤粉+20g琼脂：1瓶）1.先用铝箔纸盖上瓶口，再放入铁篮子里，之后放入高压灭菌锅里（121摄氏度，升温1h，恒温0.5h，降温1h），两个小时之后取出样品2.最后在超净工作台上将琼脂用锥形瓶倒满板子表面二、制LB1.将配好的LB aq （10gLB+400ml水）装进80ml的瓶子，瓶子的盖子半松开状态，之后放入高压灭菌锅中（121摄氏度，升温1h，恒温0.5h，降温1h）,两个小时之后取出样品，之后等降到室温时，在锅内把盖子拧紧，封口，放入冰箱。
抗菌测试检测标准
抗菌测试检测标准
抗菌测试是评价物质抑制或杀灭细菌或其他微生物能力的方法。
下面是常见的抗菌测试方法和相关的标准：
1. 纸片扩散法（Disk diffusion method）：根据CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）标准进行抗菌活性测试。
该
标准包括了对不同细菌株和药物的测试方法和结果解读标准。
2. 最小抑菌浓度法（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）：根据CLSI或欧洲常用测试方法（EUCAST，European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing）进行细菌的
药敏性测试。
该测试可以确定药物对细菌的最低有效抑制浓度。
3. K-B法（Kirby-Bauer method）：也是一种常用的纸片扩散法，测定细菌对抗生素的药敏感性。
除了上述各种抗菌测试方法外，还有许多其他的标准和指南可供参考，例如：
- 美国药典（USP，United States Pharmacopeia）中的相关方法
规范。
- 欧洲抗菌药物开发委员会（EUCAST）的药敏性测试指南。
- 中国药典（ChP，Chinese Pharmacopoeia）中的抗菌药物相关标准。
这些标准和指南提供了在实验室中进行抗菌测试的具体步骤和结果的解释。
根据不同的应用领域和目的，选择合适的标准进行抗菌测试非常重要。
抗菌性实验报告
抗菌性实验报告引言：抗菌性是指一种物质对抑制或杀灭细菌的能力。
抗菌性实验是一项重要的生物学实验，旨在评估不同物质的抗菌能力和效果。
本次实验通过对不同物质在抗菌培养基上的生长情况观察，探究不同物质对细菌生长的影响。
实验方法：1. 准备实验材料：抗菌培养基、细菌培养物、试验物质（例如抗生素、植物提取物等）。
2. 实验前的准备工作：消毒实验器材、制备抗菌培养基。
3. 制备培养皿：将抗菌培养基倒入培养皿中，待其凝固成平坦的琼脂状后，开始实验。
实验步骤：1. 在培养皿上均匀地涂布细菌培养物，用灭菌的铂铁棒将其划成4个等份，建立4个对照组。
2. 在各自对照组中滴加不同浓度的试验物质，确保每个对照组的试验物质浓度一致。
3. 将试验培养皿放置在恒温培养箱中，以37℃恒温培养24小时。
4. 24小时后，观察每个培养皿上的菌落形成情况，并记录结果。
结果与分析：根据实验结果，我们可以针对不同试验物质的抗菌活性进行评估并对其进行分类。
一般来说，物质的抗菌活性可以分为以下三类：1. 高度抗菌活性：这类物质在培养皿上呈现出清晰的抑菌区，菌落无法在该区域生长。
高度抗菌活性物质具有强大的抑制或杀灭细菌的能力，可以作为潜在的抗菌剂。
例子包括某些抗生素。
2. 中度抗菌活性：这类物质在培养皿上呈现出部分抑菌区，菌落生长受到一定程度的抑制。
中度抗菌活性物质的抗菌效果较弱，可能需要更高的浓度才能达到有效抑菌效果。
例子包括一些植物提取物。
3. 低度或无抗菌活性：这类物质在培养皿上没有明显的抑菌区，菌落可以自由地生长。
这可能是由于该物质无抗菌效应，或浓度过低无法发挥抗菌作用。
例子包括一些普通溶液。
实验结果的分析有助于我们评估不同物质对细菌的抑制效果，并进一步探究其中的机制。
结论：通过本次实验的结果分析，我们可以得出以下结论：1. 不同物质对细菌的抗菌效果存在差异，有的具有较强的抑菌作用，有的抑菌效果较弱甚至无抑菌作用。
2. 抗菌物质的抑菌效果可能与其浓度、种类以及作用机制有关。
抗菌实验步骤方法
抑菌实验：待测菌金色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌；绿脓杆菌菌种活化：菌种，进行活化，可以划线，也可以涂布，划线：直接用接种环在酒精灯上烧过之后，等之冷却，蘸取进行划线！涂布：用枪头吸取100ul的菌液涂布既可！本实验采用涂布法1.金色葡萄球菌最佳生长条件(过夜培养一般为12h)2. 枯草芽孢杆菌培养条件（过夜培养）3.绿脓杆菌最佳培养条件（14-17h）培养基MH（A）培养基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；琼脂 12.5gMH液体培养基配制方法：称取本品36.5克，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟备用。
牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，琼脂15g，NaCl 5 g，双蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨液体培养基：不加琼脂，其他同牛肉膏蛋白胨固体培养基。
菌悬液的配制将冰箱保存的大肠杆菌移接到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，置于37℃恒温培养箱中培养24 h ，用接种环挑取少许菌体与装有无菌生理盐水的试管中，震荡均匀，制成菌悬液。
具体为用接种环挑取一环（本实验是吸取100uL 菌悬液）于5 mL 的无菌生理盐水中，每10倍稀释一次地逐级稀释，取（10-8、10-9、10-10 、10-11）的浓度100μL 做涂布实验，每个梯度平行三组，加100μL 药品溶剂（二甲基亚砜）的空白对照3个平板，完全不加任何样品即只是LB 培养基的完全空白对照1个平板，调整菌悬液浓度，用平板菌落法测定其菌液浓度，使其含菌体数为103 cfu/mL ，即为供试菌悬液。
抑菌作用初步筛选将灭菌固体培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每20ml 培养基倒入无菌培养皿中。
待平板自然晾干后，分别移取0.1ml 待测药品，0.1 mL 供试菌悬液，均匀涂布于加药平板上，每个处理3次重复。
抗菌测试检测标准
抗菌测试检测标准摘要：1.抗菌测试的背景和意义2.抗菌测试的主要方法3.我国对抗菌测试的标准要求4.抗菌测试在实际应用中的重要性5.未来抗菌测试的发展趋势正文：抗菌测试是在医学、卫生、日用品、建筑材料等领域中广泛应用的一种检测技术。
它可以用于检测物品或材料是否具有抗菌性能，为产品研发、生产、质量控制等提供科学依据。
目前，抗菌测试的主要方法有抑菌圈法、滤膜法、琼脂平板法等。
抑菌圈法是通过测定测试物质在平板培养基上形成的抑菌圈的大小来判断其抗菌活性。
滤膜法则是将测试物质涂布在滤膜上，通过测定滤膜对细菌的阻拦效果来评价其抗菌性能。
琼脂平板法则是将测试物质加入培养基中，观察细菌在含有测试物质的培养基上的生长情况，从而判断其抗菌效果。
我国对抗菌测试的标准要求非常严格，我国相关标准规定了各种测试方法的实验步骤、评价指标、实验条件等，确保了测试结果的科学性和准确性。
同时，我国还积极参与国际标准的制定，为国际抗菌测试领域的发展做出贡献。
抗菌测试在实际应用中具有重要意义。
例如，在医疗卫生领域，抗菌药物的合理使用对于治疗感染性疾病至关重要。
在日用品领域，抗菌性能是许多产品的重要卖点，如抗菌毛巾、抗菌餐具等。
在建筑材料领域，抗菌性能可以有效防止建筑物内部的细菌滋生，提高居住者的生活质量。
未来，随着科技的发展，抗菌测试将更加精确、快速、便捷。
例如，基于生物传感技术的抗菌测试方法已经取得了突破性进展，有望在不久的将来投入实际应用。
此外，随着大数据和人工智能技术的发展，抗菌测试的数据处理和分析也将更加智能化。
总之，抗菌测试作为一项重要的检测技术，在各个领域具有广泛的应用前景。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
中草药抗菌实验实验报告
一、实验目的1. 了解中草药的抗菌作用；2. 探究不同中草药对细菌的抑制作用；3. 分析中草药抗菌成分及其作用机制。
二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌；2. 中草药：金银花、黄连、大蒜、黄芩、板蓝根等；3. 试剂与仪器：营养肉汤、生理盐水、细菌接种环、无菌试管、培养箱、显微镜、电热恒温水浴锅等。
三、实验方法1. 中草药提取：将中草药洗净、晾干，用粉碎机粉碎成粉末。
取适量粉末，加入一定量的蒸馏水，煮沸30分钟，过滤，浓缩至一定浓度。
2. 菌株培养：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌分别接种于营养肉汤中，37℃培养箱中培养18小时。
3. 中草药抗菌实验：将培养好的菌株分别用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液。
取无菌试管若干，每管加入0.1mL菌悬液，再加入不同浓度的中草药提取液，对照管加入等量的生理盐水。
37℃培养箱中培养24小时。
4. 观察结果：观察各试管中菌落生长情况，以无菌生理盐水为对照，记录菌落数。
5. 数据处理：对实验数据进行统计分析，比较不同中草药对细菌的抑制作用。
四、实验结果1. 金银花提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。
2. 黄连提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。
3. 大蒜提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。
4. 黄芩提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。
5. 板蓝根提取液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。
五、实验结论1. 金银花、黄连、大蒜、黄芩、板蓝根等中草药具有抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等细菌均有抑制作用。
2. 不同中草药对细菌的抑制作用存在差异，其中金银花、黄连、大蒜、黄芩、板蓝根等对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。
抗菌药物敏感试验实验
无菌试管、刻稀释法
K-B法操作方法
操作注意事项：
菌液应在15分钟内接种完毕 接种后，平板放置时间不要超过5min 注意纸片距离
肉汤稀释法操作方法
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M-H肉汤(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
抗生素(ml) 菌液(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
2弃 －
去
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
35℃孵育16~18h，观察结果
实验内容
第二次 1.观察K-B法的结果 2.观察肉汤稀释法的结果
K-B法结果解释
测量抑菌圈直径，参照CLSI的标准解释结果。
20mm
金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验结果判断
大肠埃希菌抗菌药物敏感性试验结果判断
实验目的 1.掌握纸片扩散法（K-B法）和肉汤稀释法
的原理、操作方法、结果的判读及其临床 意义。 2.掌握纸片扩散法和肉汤稀释法的质量控制。
实验内容 纸片琼脂扩散法（K-B法） 肉汤稀释法
实验器材
1. 菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 2. 培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、MH肉汤 3. 抗菌纸片：青霉素（PEN）、庆大霉素（GEN）、
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一、抗菌实验
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(一) 体外抗菌实验
1. 实验前的准备工作
(1) 培养基的准备：肉汤琼脂培养基、真菌琼脂培养基等均可按药典规定的方法配制。
(2) 药液的准备：一般采用中草药水煎液，经滤过浓缩成1：10～1：1的浓度，试验前的药液需灭菌，以免污染影响结果。
(3) 试验菌株的选择及制备：一般使用典型的菌株，或从临床分离经鉴定后取得的菌株，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、链球菌、肺炎双球菌、白色念珠菌、酵母菌及真菌等。
细菌菌液的制备：将斜面菌种接种于普通肉汤培养基中，肺炎双球菌及溶血性链球菌须在上述培养基中加入5%～10%血清，或加入25%(V/V)或20%猪血水，37℃培养6～8小时或16～18小时。
真菌菌液的制备：将菌种接种于大试管中，并在22℃～25℃培养24小时或7天(视菌种及生长速度而定)，然后用灭菌生理盐水10mL洗脱制成混悬液。
菌液的浓度一般先采用培养液，如不显示抗菌作用，可再稀释成一定浓度。
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌可用1：1000浓度，肺炎双球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、酵母菌可用1：10或1：100浓度。
2. 实验方法
(1) 平碟法：取熔化后的培养基，每平碟(培养皿)倒入15mL，待凝固后，在培养基表面划线接种试验菌株，在划线的中间位置安放一个灭菌的不锈钢圈，在圈内滴入试验药液。
也可采用打洞法，即在凝固的培养基上用已灭菌的打孔器打孔挖去琼脂块，将药液滴在洞内。
用灭菌陶盖盖好，细菌在37℃、真菌在22℃～25℃培养18～20小时，观察细菌生长情况，如全线生长则认为该浓度的药液无抗菌作用，如细菌或真菌划线为药液所切断，则认为该浓度药液有抗菌作用。
(2) 平碟稀释法：先将中药药液2mL加入平碟内，再加入已溶化的培养基8mL，充分摇匀，待凝固后，划线接种菌株，同时用水2mL代替药液制作空白对照平碟，方法同样，接种后，将平碟倒置，在37℃(真菌在22℃～25℃) 培养18～20小时，观察结果。
如对照碟长菌、药液碟不长菌，则认为有抗菌作用。
(3) 试管法：取试管12支，在每一试管中加入培养基5mL，于第1管中加被试药液5mL，混合均匀，吸出5mL加到第2管中，混合均匀，再吸5mL加到第3管中，依次操作，直到第10管，将第10管混合均匀后吸出5mL弃去，其药液稀释依次为1：2，1：4，1：8，……1：1024，再于前11管中各加入适当浓度的菌液0.1mL，第11管作为菌液对照，第12管不加菌液，加被试药液0.1mL，作为药液对照。
将其全部在37℃(真菌22℃～25℃)培养16～24小时(真菌24～72小时)，观察各管菌株生长情况。
如菌液对照管浑浊，表示菌株生长良好;药液对照管澄明，表示药液没有染菌。
再将试验管与对照
管比较，以溶液澄明无菌生长为有抗菌作用，其中以药液稀释度最大管的药液浓度为最小抗菌浓度。
如欲了解药液的抗菌作用是抑菌（MIC）还是杀菌（MBC），可将上述不长菌试管中的溶液，用接种环转种到肉汤培养基中，经37℃培养16～20小时(真菌则在22℃～25℃培养24～72小时)，如仍不长菌，表示药液有杀菌作用。
(？)
(二) 动物体内抗菌实验
1. 实验前的准备工作
(1) 菌液的制备：将选定的菌种，用接种环从斜面培养基上接种于肉汤培养基中，在37℃培养18小时后，再用培养基转种一次，培养18小时后，取出备用。
将上述菌液用生理盐水按10倍顺序稀释成不同浓度，每一浓度菌液分别注射给5只小白鼠，观察4天，以能使80% ～100%小鼠感染死亡的菌液供正式实验用。
(2) 药物的配制及选择剂量：先将药物配成一定浓度的溶液，再用二倍稀释法配成三种浓度的溶液，通过动物毒性预试，确定其半数致死量和最大耐受量。
以LD50的1/3～1/5或最大耐受量的1/2为实验治疗剂量的起点，可再选2～3个剂量，同时分组实验。
例如某药物的LD50药为500mg/kg，则实验治疗剂量可选用100、50、25mg/kg三个剂量。
2. 实验治疗
(1) 小鼠腹腔感染：取小鼠分4组，每组10只(体重17～20g)，一组给生理盐水做对照，其他组分别给几种浓度的药液，1小时后，各组小鼠均腹腔注射适当稀释的菌液0.5mL，感染后1小时及6小时，必要时在24小时再给药液或生理盐水1次，观察4天，记录各组小鼠死亡的时间和死亡率。
(2) 小鼠静脉感染：取小鼠分为5组，每组10只，一组为生理盐水对照，一组为已知药物对照，其余三组为实验药物组，各组小鼠由尾静脉注射适当稀释的菌液0.2mL，然后每天给药2次，共给7天，观察3周，记录各组小鼠死亡数，计算死亡率。
实验结果分析在腹腔或静脉感染时，如果对照组死亡率达80%～100%，实验组死亡率比对照组少25%以上，表示该药有抗菌作用;如实验组与对照组死亡率相近似，说明该药在现用剂量下无抗菌作用，可适当增加剂量重试; 如实验组死亡率大于对照组，且死亡时间也快，说明药物的毒性影响疗效观察，应适当降低药物剂量后再试;如对照组死亡率低于50%，表示感染菌株毒力太小，应增加感染菌液量或另选毒力大的菌株。
，将装入试管内的称为“斜面琼脂培养基”，一般用于菌种的培养或保藏；将装入锥形烧瓶或培养皿内的称为“平板琼脂培养基”，多用于菌种分离。
培养皿倒放，可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落。