抑菌试验方案
抑菌谱实验报告
一、实验目的1. 了解不同抗生素对细菌的抑菌作用。
2. 探究不同细菌对不同抗生素的敏感性差异。
3. 分析抗生素的抑菌谱，为临床用药提供参考。
二、实验原理抑菌实验是通过观察细菌在含有抗生素的培养基上的生长情况，来评估抗生素对细菌的抑制作用。
实验中，将不同浓度的抗生素分别加入培养基中，然后将接种有细菌的菌种接种于培养基上，观察细菌的生长情况，从而判断抗生素对细菌的抑菌效果。
三、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等。
2. 抗生素：青霉素、头孢菌素、红霉素、庆大霉素、氯霉素等。
3. 培养基：营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂等。
4. 仪器：培养箱、移液器、无菌操作台、显微镜等。
四、实验方法1. 将抗生素配制成不同浓度梯度的溶液。
2. 将菌株接种于营养琼脂平板上，37℃培养过夜。
3. 用无菌移液器将不同浓度的抗生素溶液分别滴加于平板中央，用无菌镊子轻轻按压平板，使抗生素溶液渗透到培养基中。
4. 将平板倒置，37℃培养24小时。
5. 观察并记录细菌在不同抗生素溶液中的生长情况，记录抑菌圈直径。
6. 根据抑菌圈直径，判断细菌对不同抗生素的敏感性。
五、实验结果1. 金黄色葡萄球菌对青霉素、头孢菌素、红霉素等抗生素敏感；对庆大霉素、氯霉素等抗生素不敏感。
2. 大肠杆菌对庆大霉素、氯霉素等抗生素敏感；对青霉素、头孢菌素、红霉素等抗生素不敏感。
3. 肺炎克雷伯菌对庆大霉素、氯霉素等抗生素敏感；对青霉素、头孢菌素、红霉素等抗生素不敏感。
4. 铜绿假单胞菌对庆大霉素、氯霉素等抗生素敏感；对青霉素、头孢菌素、红霉素等抗生素不敏感。
六、实验讨论1. 实验结果表明，不同细菌对不同抗生素的敏感性存在差异。
这可能与细菌的耐药性有关。
2. 在临床用药过程中，应根据细菌的药敏试验结果，选择合适的抗生素进行治疗，以提高治疗效果。
3. 抑菌实验是评估抗生素疗效的重要手段，对于临床用药具有重要的指导意义。
七、实验结论通过本次实验，我们了解了不同抗生素对细菌的抑菌作用，以及不同细菌对不同抗生素的敏感性差异。
抑菌试验方案
利用吸附法测定壳聚糖无纺布抑菌性能试验方案一、实验原理：本实验参考了国标GB/T20944方法，根据我们的材料特性进行了微调。
即：选取革兰氏阴性菌（大肠杆菌（25922））和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌（25923））两类代表性指示微生物。
将测试材料浸泡在活化好的菌悬液（浓度控制为107CFU/ml）中，设置不同处理时间，稀释涂布，平板单菌落计数，计算无纺布材料的抑菌性能。
二、实验方法：2.1试验菌种的活化1）冻干粉接种至大豆蛋白肉汤(TSB)培养基，37℃培养24h。
一部分用于抑菌试验，另一部分用于划线接种至斜面或平皿冷藏保藏（可保藏1个月）。
2）培养液稀释。
活化好的菌悬液用稀释液稀释20倍，取1ml培养液添加到19ml稀释液（应提前灭菌）中。
3）式样预处理。
大小合适的试样饱和吸水，灭菌处理。
（周教授负责）4）菌悬液洗涤。
将稀释好的菌悬液转移到试样中，分别震荡15min 和30min，为防止微生物传代，影响试验结果，立即放入冰箱冷藏。
5）洗涤液梯度稀释。
处理后的洗涤液立即梯度稀释到10-1, 10-2,10-3,10-4和10-5。
具体方法：取1ml洗涤原液加入9ml稀释液此时为10-1梯度；取1ml稀释后的10-1菌液加入到9ml稀释液，此时为10-2梯度；······。
6）涂布。
分别取10-3,10-4和10-5的稀释液200ul涂布到平板（计数培养基，简称EA），每个处理做2个平行，37℃，培养24-48h，计数。
7）抑菌效果评价。
参照GB/T20944。
三、试验简易流程注：如果活化后的菌液浓度较高，可取10-4、10-5和10-6梯度稀释液涂布。
四：所需准备耗材：1、大豆蛋白液体培养基（7.1，TSB）250ml培养瓶装100ml 3瓶，2瓶分别接种，1瓶备用；2、大豆蛋白固体培养基,（7.2，TSA）250ml培养瓶装100ml 1瓶，到平板后用于菌种保藏；3、稀释液（7.5）15或18ml试管装9ml 50支，42支稀释，8支备用；4、计数固体培养基（7.6，EA）250ml培养瓶装160ml 6瓶，准备50皿。
牛津杯法抑菌试验步骤
牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
抑菌活性实验方案
抑菌活性实验方案薄层层析(TLC)是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪类、糖脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。
(1) 初始发酵培养基的筛选在250 mL三角瓶装100 mL基础培养，将种子培养基以6%接种量接入各种基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养5d，测定不同培养基下发酵液对供试病原菌的抑制率，确定最佳基础培养基。
(2) 发酵时间的确定将活化的种子培养基以6%接种量接入筛选出的基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养不同时间段，测定每个时间段发酵液上清液对供试病原菌的抑制率，确定最佳发酵时间。
(3) 发酵初始pH值的初步确定将优化后碳氮源的基础培养基的pH分别调成3、5、7、9、11，然后再按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同pH培养基发酵液无菌滤液对供试病原菌的抑制率，确定初始pH范围。
(4) 发酵温度的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按 6 %接种种子培养基，分别在20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃，170 r/min培养一定时间后，测定不同温度下发酵所得发酵液对供试病原菌的抑制率，确定发酵温度范围。
(5) 发酵接种量的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，分别按2 %、4 %、6 %、8 %、10 % 接种种子培养基，在28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同接种量对发酵液抑菌活性的影响，确定发酵接种量范围。
(6) 发酵转速的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6 %接种种子培养基，28 ℃、以100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、210 r/min培养一定时间后，测定不同发酵转速对发酵液抑菌活性的影响。
(7) 发酵装液量的初步确定以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，在250 mL锥形瓶中装入50 mL、75mL、100 mL、125 mL、150 mL，按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min 培养一定时间后，测定不同发酵装液量对发酵液抑菌活性的影响。
抑菌实验
一、菌种(一)、细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；(二)、真菌：啤酒酵母（Saccgaromyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillusoryzae）3402、黑曲霉（Aspergillus niger）、叶点霉（Phyllosticta maydis ）和刺盘孢霉（Colletotrichum musae）二、培养基（一）细菌培养液：LB液体：胰蛋白胨10.0g酵母提取物 5.0gNaCl 10.0g10mol/LNaOH 100μL蒸馏水定溶至1.0LpH 7.0~7.4如要配置固体LB培养基，加15.0g琼脂糖/L(二)、真菌培养液：马铃薯培养基(PDA)马铃薯(去皮切块) 200.0g葡萄糖 20.0g琼脂 18.0g，蒸馏水 1000mLpH 自然三、器材培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤(一)、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，细菌置30℃，温箱培养1d，霉菌置27℃，温箱培养3d，备抗菌实验用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃，置旋涡混合器混匀。
3、倒平板在超净台里将培养基倒入平板，每板约15mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中，2d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。
4、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。
5、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
几种常用抑菌试验方法的评价及比较
几种常用抑菌试验方法的评价及比较
在生物医学研究中，常需要对各种物质的抑菌效果进行评价。
为此，人们开发了多种常用的抑菌试验方法，以便比较不同物质的抑菌效果。
本文将对几种常用抑菌试验方法进行评价及比较。
1. 纸片扩散法
纸片扩散法是一种常见的抑菌试验方法。
在该方法中，将待测物质涂敷在纸片上，然后将纸片放在含有细菌的琼脂平板上，观察细菌生长情况以评价抑菌效果。
该方法具有操作简便、试剂消耗少等优点。
但是，由于涂敷纸片的方法、纸片的大小和厚度等因素可能会影响试验结果，因此需要进行标准化操作以提高试验的准确性。
2. 微量稀释法
微量稀释法是一种通过测定物质最低抑菌浓度来评价抑菌效果的方法。
在该方法中，将待测物质加入不同浓度的液体培养基中，然后加入一定量的细菌。
经过一定时间后观察细菌生长情况，以确定最低抑菌浓度。
该方法具有操作简便、结果可靠等优点。
但是，由于需要进行多次稀释以确定最低抑菌浓度，因此需要耗费大量试剂和时间。
3. 光密度法
光密度法是一种通过测定细菌生长的光学密度来评价抑菌效果的方法。
在该方法中，将待测物质加入液体培养基中，然后加入一定量的细菌。
经过一定时间后，使用光学密度计测定细菌培养液的光学
密度，以确定抑菌效果。
该方法具有准确度高、操作简便等优点。
但是，由于需要使用光学密度计，因此设备要求较高。
综上所述，不同的抑菌试验方法各有优缺点，选择合适的试验方法应根据实际需要和试验条件进行综合考虑。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制.因此,药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一)稀释法(结果示教)稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。
这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示。
（二)琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内,由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长,此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片.一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法:选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液,每100张纸片加入0。
5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片.一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药.世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断.步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果打洞法（结果示教）在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔,4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品,放在37℃，12—18小时，测定其抑菌圈直径。
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（一）病虫害的制备
1、病虫害的采集
本实验所用材料分病原菌及害虫两类。
其中病原菌分别从宣木瓜和丹皮两种地道药材植物上采集。宣木瓜的病原菌本实验室已有，并且提取了单一菌种。丹皮方面需要我们查阅资料以及请教师姐，把握最佳采集时间和采集类型，然后我们进行实地考察以及集采。采集丹皮根部，连同根部泥土带回。
（二）抑菌实验———滤纸片法（细菌）
1、 菌悬液制备
将供试菌种在各自适合的斜面培养基上和适宜的温度条件下(细菌37℃,霉菌28℃)于培养箱中培养活化(细菌24 h,霉菌48 h),备用。将活化后的供试斜面培养基用10 mL无菌生理盐水稀释制成含菌量为106～108个/ mL的菌悬液。
2、丝瓜伤流液滤纸片的制备及处理
0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。
2.3划线法分离
2.3.1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。
2.3.2、划线
细滤纸,用钢笔套按一个圆印,剪下(一次剪4个),尽量剪圆。置于三角瓶中,塞上棉塞,高压蒸汽灭菌后浸泡于丝瓜伤流液中, 2 h后用无菌镊子夹出,在瓶口沥去多余丝瓜伤流液,即可贴入刚接种的器皿上。贴入时标记起始位置,按顺时针或逆时针方向将滤纸片顺序贴入。
3、抑菌试验
分别将配制好并已经灭菌的各种固体培养基趁热分别倒入无菌培养皿中,每皿15～20 mL(各皿量要相同),冷却凝固后用吸管吸取0.3 mL被试菌液,加到平皿上,用涂布棒涂布均匀。将灭菌的丝瓜伤流液滤纸片用无菌镊子夹取风干,放在含菌平板上,每皿3片,每种处理丝瓜伤流液做3次重复。细菌置于37℃培养24 h,霉菌置28℃培养48 h,测定滤纸片的抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。
常规鉴定的内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。
三、试验方法
（一）平板抑菌试验（真菌）
将丝瓜伤流液过滤除菌，定量加在PDA培养基中配制成平板，对照组分别在培养基中加入域丝瓜伤流液等量的无菌水。真菌在PDA平板上培养5d，自菌落边缘用灭菌打孔器取直径4.5mm的圆形菌块，移到制备好的含伤流液的平板中央，25℃培养，测量菌落半径，根据测量结果计算抑菌率。
2.2.4取样
用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。
2.2.5倒平板
于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取经稀释10倍的土壤悬液-环在平板上划线(图Ⅴ-3)。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：
⑴用接种环以无菌操作挑取病原菌悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图Ⅴ-4，A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
2.2.2编号
取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有9ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2.2.3稀释
用1ml无菌吸管精确地吸取1ml病原菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。
⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图Ⅴ-4，B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
（二）丝瓜伤流液的制备
丝瓜生长旺盛时选粗大健壮的植株，从离地面约80cm处剪断，插入到备好的瓶中，塞紧瓶口，将瓶绑扎固定，收集的液体过滤，放阴凉处备用。
二、病虫害的鉴定
选取长有单菌落的培养皿，接种至试管斜面培养。
害虫方面，我们将到野外筛选采集。
2、病原菌的纯种分离
2.1培养基的制备
根据实验需要制备培养病原菌所需培养基，主要为牛肉膏蛋白胨培养基（用来培养细菌）、PDA培养基（用来培养真菌）。
2.2病原菌稀释平板计数
2.2.1.制备病原菌悬液
将带有土壤的丹皮烂根放入锥形瓶中，加入9ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，静置5min.