抗内毒素治疗研究进展
LPS和抗LPS治疗的研究及应用进展
LPS和抗LPS治疗的研究及应用进展靖学芳 综述;安云庆 审校(首都医科大学免疫系,北京 100054)摘 要:细菌脂多糖LPS是革兰阴性菌致病的关键因子,可作为抗感染药物治疗的作用靶位。
本文主要对LPS结构和功能及致病机制和抗LPS治疗策略的研究和应用进行综述,为临床上内毒素介导的感染性疾病的防治提供一定的依据。
关键词:G NB;LPS;败血症(Septicemia);内毒素血症(Endotoxemia);感染性休克(In fectious shock)中图分类号:R392.1 文献标识码:A 文章编号:100525673(2004)022******* 革兰阴性菌(G ram2negative bacteria,G NB)感染败血症、内毒素血症及其休克的临床病死率很高,是抗感染治疗中一大难题。
G NB感染时,细菌和/或脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)即内毒素(Endotoxin)进入血循环,激活多种炎症细胞释放炎性介质,引起炎症反应,严重时会导致多器官功能衰竭。
LPS是G NB致病的启动因子,可作为药物治疗的作用靶位。
1 LPS的结构和功能LPS是G NB外膜的主要成分,由类脂A、核心寡聚糖和O2特异性多糖侧链三部分组成。
最内层的类脂A是LPS的主要生物活性部分,其结构是由焦磷酸键连接而成的葡糖胺聚二糖链,链上结合有多种中长链脂肪酸,高度保守,无种属特异性,不同G NB引起的毒性作用大致相同。
核心寡聚糖位于类脂A外层,由22酮232脱氧甘露辛酮糖酸、磷酸乙醇胺、庚酸等组成,结构易变,有种属特异性。
LPS 最外层是若干重复的多糖侧链,组成完整的O抗原,G NB不同则组成例链的单糖种类、排列顺序也不同,决定了G NB的种型特异性〔1〕。
LPS在G NB外膜渗透性和流动性的维持及其致病过程中起主要作用。
LPS释放入血循称为内毒素,是激发机体非特异性免疫功能的重要分子。
LPS 有双重作用,低浓度时可刺激机体免疫系统,增强固有免疫功能,如LPS可直接激活补体的旁路途径等;高浓度时会引起广泛而强烈的炎症反应,激活单核2吞噬细胞、内皮细胞等,释放T NF2α、I L21、I L26、I L28、氧自由基、NO、组胺等炎症介质,诱发全身炎症反应综合症(包括休克),严重时会引起弥漫性血管内凝血,导致多脏器功能衰竭。
抗内毒素药物的研究进展
收稿日期: 2007- 11- 19 作者 简介: 张含飞 ( 1977—) , 女 , 助 理兽医师 , 主要 研 究方 向 为 兽 用 生物 制 品 。
摘要 : 目 前 , 国 内 外 尚 无 一 种 疗 效 显 著 、不 良反 应低 、 价格 低 廉的 治 疗内 毒 素感 染 的 比 较 理想 的 药物 。 该文 针 对目 前 研究 的 抗 内 毒 素药 物 , 在 其 作用 环 节和 机 制等 方 面 作 一 综述 , 以 期 能对 今 后研 制 高亲 和 力、能 中 和 内毒 素 且毒 性 低的 药 物起 到 积极 的 作 用。
学
Steven 等 报 道 了 一 种 胞 苷 酸 - 2- 酮 基 - 3- 脱 氧 辛
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酸 ( CMP- KDO) 合 成 酶 ( 类 脂 A 合 成 酶 中 的 一 种 酶 ) 抑 制 剂 可 阻 断 KDO, 从 而 导 致 类 脂 A 前 体 积
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累而 产 生 抗菌 作 用 , 体 内 试 验表 明, 其可 杀灭 血 液
嘧啶 - 3- O- ( R- 羟 基 十 四 酰) - N- 乙 酰 葡 萄 糖 胺 合 成 类脂 A。L- 573665 是 一 种 异 羟 亏酸 , 有 抑 制 脱 ●
乙 酰酶 的 作 用, 在 浓度 100 mg /L 时 可 抑制 80 %～
90 %内 毒 素的 合 成 。Merck 公 司 合 成了 20埃 希氏 菌〔7〕。 1.2 类 脂 A 结构颉 颃剂
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肝硬化肠源性内毒素血症的研究进展
２ 肠源 性 内毒素 血症 的治 疗
２ １ 改善肝功能、 ． 降低 门静脉压力 改善肝功能可提 高 Ｋ ｐ ｅ 细胞 的功能 ， ｕｆｒ ｆ 加强其对肠源性 内毒素 的吞噬 及清除作用。降低门静脉 压力可减 轻肠 道淤血、 缺氧、 水肿 ， 改善 肠 道屏 障功 能 ， 少 内毒 素吸 收 － 。 减 ８ Ｊ 起肝 脏 持续 性损 害 ， 速 肝病 的恶 化 。现 就 肝 硬化 肠 源 加 ２ ２ 减 少肠 道 内毒素 的产 生和 吸收 ． 性内毒素血症的研究进展综述如下。 ２ ２ １ 促肠动力药 促肠动力药可恢 复肠动力 ， ．． 减少 １ 肝硬 化 患者 肠源 性 内毒素 血症 发 生的机 制 促进肠道细菌及其毒素排 １ １ 肠道通透性增加 肝硬化患者 因肝 内门静脉血流 肠道细菌 的过度生长及异位 ， ． 出， 减轻肠源性内毒素血症的产生 。 受阻及血流量增多 ， 常伴有门静脉高压 ， 胃肠道淤血 ， 黏 ．． 膜充血 ， 组织水肿、 糜烂 ， 部分上皮细胞脱落 ， 肠黏膜上 ２ ２２ 微生态 制剂 当肠道 内病原菌群异常增生时 ， 即微生态制剂通过与肠黏膜上皮细胞紧 皮细胞及其相互之间紧密连接 ， 使细胞紧密连接变得松 外源性有益菌 ， 与乳酸杆菌形成生物屏障 ， 且其代谢过程 中产 弛 而导 致肠 黏膜 通透 性增 高 Ｊ肠 腔 内细菌 、 ， 内毒 素 通 密结合 ， 生酸 眭物质 ， 降低肠道 ｐ Ｈ值 ， 抑制革 兰阴性腐败菌 ， 使 过通 透性 增 高 的肠壁 渗透 至 血液循 环 。 其不能定植存活和繁殖 ， 促进 ｓ Ａ分泌 ， ｔ ｇ 增加外周血细 １２ 肠道菌群失调 肠道是革兰阴性杆菌的内毒素池 ， ． 增加肠道局部免疫力 ， 内毒素 使 细菌能不断产生毒素 ， 肠道菌群构成的屏障， 能将肠内毒 胞非特异性吞噬功能 ， 益生 菌能促进和维持 素局 限于肠 腔 内， 并且正 常菌 群对 肠道 有 免疫激 活 作用 ， 生成和吸收减少 。研究 显示 ， 纠正肠道菌群失调 ， 明显 降低肝硬化患 产生分 泌型 ＩＡ、 ｇ 激活肠壁组 织 中免 疫活 性细胞 形成 免疫 肠道菌群平衡 ， 者血浆内毒素血症水平 。 屏 障 。由于 胃肠 道长 期 淤 血缺 氧 ， 胃肠 道 平 滑 肌 间神 经 ．． 元功能受损 ， 直接影响神经递质 的传递 ， 导致肠蠕动减 ２ ２３ 谷 氨 酰胺 谷 氨酰胺 是 肠 黏膜 上皮 重 要 的 能源 对肠道黏膜损伤 的修复起重要作用 ， 可保持肠组 慢、 延迟 ， 肠道清除能力降低 ， 为过路菌提供了接触、 粘附 物质 ， 增强肠黏膜屏障功能 ， 降低肠黏膜 的 黏膜的机会 ， 造成肠腔内微生态环境破坏 ， 肠道菌群严重 织结构的完整性 ， 有效提高肠黏膜中产 Ｉ ｇ Ａ的浆细胞 ， 促进 ｓ Ｉ — 紊乱 ， 肠道原籍菌如双歧杆菌减少 ， 肠球菌、 肠杆菌显著 通透性 ， ｇ Ａ的合成和分泌 ， 阻止或减少肠道 内细菌及毒素人血 。 增多， 释放内毒素增加 ， 从而导致内毒素血症＿ 。 ４ Ｊ ２ ２４ 乳果 糖 乳 果 糖 在 结 肠 内被 乳 酸 菌 、 氧 菌 等 ．． 厌 １３ 肠黏膜免疫屏障功能紊乱 肠黏膜免疫屏障是 由 ． 分解 为乳 酸 和醋 酸 ， 提 供 结 肠 上 皮 细 胞 代 谢 的能 量 ， 可 肠 黏膜 淋 巴组织 及其 分 泌 的免疫 球蛋 白 ｓ Ａ组成 ，ｌＡ ｌ ｇ ｓ ｇ 维持肠道黏膜 的完整性 ； 降低肠道 内 ｐ 促进肠蠕动 ， Ｈ， 可选择性包裹细菌或内毒素 ， 形成抗原 一 抗体免疫复合 抑制 、 清除外籍菌 ， 减少 内毒素的产生 ； 乳果糖亦可在肠 物， 防止细菌粘 附于肠黏膜 ， 而且这种免疫复合物可 以 腔中直接灭活内毒素¨ ” 。 刺激黏液分泌 ， 加速黏液层流动 ， 有利于细菌和 内毒素 ２ ２５ 中药 由大黄组成的复方制剂如大承气汤及承 ．． 排出。肝硬化时存在全身系统免疫异常 ， 局部肠黏膜免 气合剂、 泻热汤 ， 一方面能增 强肠道蠕 动 ， 加速 毒物排 疫屏障也会发生 相应改变 ， Ｊ肠黏膜 淋 巴细胞 产生 的 出， 遏制肠道细菌 和 内毒素移位 ， 少 内毒素吸收 ； 减 ｓ Ａ明显减少 ， ｌ ｇ 从而导致 内毒素血症的发生 。 另一 方 面通 过免 疫 调 节 ， 强 肝 脏 对 内毒 素 的清 除 ， 增 降 １４ 肠道 内毒 索 的清 除 作 用 减 弱 正 常 肝 细 胞 、 窦 ． 肝 低血浆 内毒素水平。 内皮细胞、 内 Ｋ ｐｅ 细胞及 中性粒细胞 等表 面有 多 肝 ｕｆｒ 肝硬化时常常存在不同程度的肠源性内毒素血症 ， 种 内毒素结合蛋 白受体 ， 可识别、 结合 、 清除 内毒素 Ｊ 。 其发生率与肝病的严重程度呈正相关 ， 内毒素可引起肝 肝硬化时 由于上述细胞 功能受损 、 门体循环短路 ， 网状 脏 多种 损伤 ， 肝硬化 的发 展 和 预后 产 生 重要 影 响 ， 对 内皮系统活性多有下降 ， 不能有效清除肠道细菌产生的 早期诊断治疗有望降低肝硬化患者并发症的发生率 ， 提 内毒素。此外 ， 肝硬化时 内毒素结合蛋 白增加 ， 高水平 高生存率。 目 前有多种治疗方案 ， 尚处 于探索 阶段 ， 但 的内毒素结合蛋 白可促使极低浓 度的内毒素对机体发 针对内毒素的特异性疗法有待于进一步研究。 挥 生 物学 效应 。 参 考 文献 １５ 淋 巴液 生成 增 加 肝 硬 化 门脉 高 压 时 肝 脏 、 系 ． 肠 １ 陶林 ， ］ 陈东风 ． 肝硬化 患者肠源性 内毒素 血症 发生 的机制及 干预 膜淋巴液增加 ， 内毒素通过腹腔淋 巴管 一 胸导管进入 方法［ ］ 重庆医学 ， ０ １４ （４ ： ０ １ １ ． Ｊ． ２ １ ， １ ） １ ９— ４ １ ０ ４ 体循环。 （ 下转 第 ３ ６页 ） １
人参二醇皂苷抗内毒素休克的研究进展
内毒素休 克 （ ｎ ｏｏ ｉ ｓ ｏ ｋ Ｅ ） 由于病 灶 或 血 流 中革 兰 氏 阴性 Ｅ ｄ ｔ ｘ ｈ ｃ ， Ｓ 是 ｅ 病 原菌 大量死 亡 ， 放 出 大 量 内 毒 素 （ ｏ ｏｙａ ｃ ｒｒ ｅ Ｌ Ｓ 进 入 血 释 “ｐ ｐ ｌｓ ｃｈ ａｉ ， Ｐ ） ｄ 液循 环 ， 活体 内的 各种 细胞 和体 液系 统 ， 激 产生 细胞 因子 、 内源性 介 质 、 自 由基和 过氧化 物 ， 用 于机体 各种 器 官及 系统 ， 响其 灌 注 ， 致 组织 细 作 影 导 胞 缺血 缺氧 、 谢紊 乱 、 代 功能 障碍 ， 至 多器 官 功 能衰 竭 而 死 亡 。但 由于 甚 Ｅ Ｓ确切 的发 病机制 尚未明 了 ， 然而 临床 救治 较为 困难 ＿ １。近 年来 据文 献 １ ＿ 报 道ｌ ｊ 人 参二 醇皂 苷 （ ｉｓ ｎｐ ｎ ｘ ｄ ｌ ａ ｏ ｉｓ Ｐ ） Ｅ ＿ ２ ， Ｇ ｎ ｅ ａ ａ ａ ｉ ｐ ｎｎ ， Ｄｓ 对 Ｓ具 有很 ｏｓ 好 的疗 效 ， 主要通 过提 高超 氧化 岐化 酶 （ ｕ ｅｏ ｉｅｄｓ ｔｓ ，ＯＤ 活 其 Ｓ ｐ ｒ ｘ ｉ ｄ ｍｕ ａ ｅＳ ） 力 而减 少过氧 化脂 质 ，． ｉ ｐ ｒ ｘ ｅ Ｌ Ｏ） 自由基产 生 ， 而稳 定细 胞 『ｐｄ ｅｏ ｉ ， Ｐ 和 ｉ ｄ 从 膜 。 同时通过 抑制 致炎 因子 生 成 ， 降低 了 Ｌ Ｓ对 组 织 器 官 的 损伤 ， 到 Ｐ 达 治疗 Ｅ Ｓ的作用 。本 文从 Ｐ ｓ对 Ｌ Ｓ 致 休克 引 起 心 、 、 、 损伤 的 Ｄ Ｐ 所 脑 肺 肝 保 护作 用进行 面赘 述 ， Ｐ Ｓ抗休 克 的研究 和应 用提 供一 点参 考 。 为 Ｄ １ Ｐ Ｓ对 Ｅ Ｄ Ｓ心损 伤保 护作 用 Ｐ 能 降低 Ｅ 心 肌组 织 中 Ｌ Ｏ、 清谷 草 转 氨酶 （ ｐ ｒａ ｍｉ— ＤＳ Ｓ Ｐ 血 Ａｓａ ｔｔ ａ ｎ ｅ ｏｒ ｎ ｆ ａ ｅ Ａ Ｔ） 肌 酸激 酶 （ ｒａｉｅｋｎ ｓ ， Ｋ） ｔ ｓ ｒｓ ， Ｓ 、 ａ ｅ Ｃ ｅ ｔ ｉａｅ Ｃ 与乳 酸 脱 氢 酶 （ ａ — ｎ Ｌ ｃ ｔｒ ｄ ｈ ｄ ｏ ｅ ａ ｅ Ｌ ｛ 活力 、 液粘 度 ， ａｅ ｅ ｙ ｒｇ ｎ ｓ ， Ｄｔ） 血 增加 心 肌纤 维 问开 放 的毛 细 血 管数 目， 保护 心肌纤 维及 其结 构 ， 现保 护心 肌细胞 乃 至脏 器功 能与 结 实 构 。刘嫒 嫒等 ］ 通过 Ｐ Ｓ对 Ｅ Ｄ Ｓ鼠组织 过 氧化 脂 质 的研 究 发 现 ， Ｄ Ｐ Ｓ能 减轻 心脏 肿胀 ， 能 降低组 织 中 Ｌ Ｏ 的含量 ， 明 Ｐ Ｓ能减轻 Ｌ Ｓ对 细 并 Ｐ 说 Ｄ Ｐ 胞 的直 接损伤 ， 定 细胞膜 ， 稳 降低 重 要脏 器 中 Ｌ Ｏ 的 含量 ， Ｅ Ｐ 对 Ｓ有 一 定 的对 抗作 用 。张键 ｌ 研究 了人 参 二醇皂 苷对 Ｅ ＿ ５ Ｊ Ｓ大 鼠心 肺 坝 ｆ 保 护作 用 ， ｊ 及分 子 机制 ， 现 Ｐ Ｓ能 降低 血 清 Ａ Ｔ、 Ｋ 与 Ｌ 发 Ｄ Ｓ ｃ ＤＨ 活性 ， 明 Ｐ Ｓ对 表 Ｄ 心肌 细胞 膜 的保护 作用 ； 低不 同切 率血 液粘 度 ， 降 增加 心 肌纤维 间 开放 的 毛细 血管 数 目， 示 Ｐ 可 降低 血液 粘度 ， 提 ＤＳ 明显 地 改善 微循 环 灌 流 ， 增加 心肌 供血 ； 能降低 心 肌 纤维 排 列 紊 乱 和断 裂 ， 灶 性 出血 与 心 肌 纤 维 变 局 性 ， 现保 护心脏 功能 与结 构 。 实 ２ Ｐ Ｓ Ｅ Ｄ 对 Ｓ脑 损伤 保护 作用 Ｐ Ｓ降低 Ｅ Ｄ Ｓ脑 组织 中一 氧化氮 合 酶（ ｉ ｉ ｏ ｉ ｙ ｔａ ｅ Ｎ ） Ｎ ｔ ｃ ｘｄ ｓ ｎｈ ｓ ， Ｏｓ 活 ｒ ｅ 性、 一氧 化氮 （ ｉ ｉ ｏ ｉｅ Ｎｏ） 量 ， Ｎｔ ｃ ｘ ， ｒ ｄ 含 增强 ｓ ｏＤ活 力 ， 降低 Ｌ ０含 量 ， Ｐ 从 而降低 Ｌ Ｓ对 大脑 的损伤 。其 作用 机 制 可 能与 下 调脑 皮 质 中 Ｔｏ 样受 Ｐ ｌ ｌ 体 ４（ Ｌ ４ Ｔ Ｒ ）ｍＲ ＮＡ、 因子 Ｋ 核 Ｂ抑制 蛋 白 ａ １Ｋ ａ （ Ｂ ）ｍＲ ＮＡ、 白细胞 分化 抗原 ｌ （ Ｄ ４ 、 Ｌ ４ Ｔ ｌ样受 体 ４（ Ｒ ） ４ Ｃ １ ） Ｔ Ｒ ／ ｏｌ ＴＬ ２ 的表 达 ， 高钙 离子 转运蛋 增 白 （ ａ １ Ｔ Ｐ ６ 、３ Ｃ Ｔ ／ Ｒ Ｖ ） ｐ ８蛋 白激酶 （ ３ ＭＡ Ｋ） ｐ ８ Ｐ 表达 及 Ｂ细 胞 淋 巴瘤 ／ 白 血病 （ ｃ ） ｃ一２相关 ｘ蛋 白 （ ａ ） 白表 达 水 平 的 比值 有关 。孙连 Ｂ ｌ ／Ｂ ｌ ２ Ｂｘ蛋 坤等 ｌ 认为 Ｐ Ｓ通过 降低 脑细 胞 Ｃ ４ Ｔ Ｒ ／ Ｒ２的表 达 ， 制 核转 ＿ ６ ］ Ｄ Ｄ１ 、 Ｌ ４ ＴＬ 抑 录 因子 一Ｋ （ － ｇ ） Ｄ Ｂ ＮＦ Ｂ 的 ＮＡ结 合 活性 ， 示 Ｐ Ｓ对 大 脑 有保 护 作 用 。 提 Ｄ 王健 春等 ｌ 发现 Ｐ Ｓ能 明显降 低脑 组 织 中 ＮＯ ＿ ７ ］ Ｄ Ｓ活 性 、 ＮＯ 含量 ， 对脑 组 织具有 保 护作用 ， 可 能与 Ｐ Ｓ下 调脑 组 织 中 Ｔ Ｒ ＮＡ表 达 ， 轻 其 Ｄ Ｌ ４ ｍＲ 减 Ｌ Ｓ对机 体的损 伤作 用有 关 。王皓 等Ｉ 认 为 Ｐ Ｓ能减 轻 Ｌ Ｓ诱 导 的脑 Ｐ ｓ ］ Ｄ Ｐ 损伤 ， 由于 它能 明显增 高脑 皮 质 中 ＴＲ Ｖ６的 蛋 白表 达 水 平 、 ｅ ／ ａ 是 Ｐ Ｂｌ Ｂｘ ２ 比值 。孙 际童等 Ｌ Ｐ 通 过 降低 脑 皮 质 中 Ｎｏ ９ ＤＳ Ｊ ｓ活性 、 Ｏ 含 量 有关 ， Ｎ 从 而减 轻 Ｌ Ｓ 机体 的损 伤作用 ， ｐ ８ Ｐ ｓ 号转 导通 路可 能是 Ｐ Ｐ 对 而 ３ ＭＡ Ｋ 信 ＤＳ 发挥作 用 的靶点 。此外 Ｐ Ｓ可 明 显降 低 脑组 织 中 Ｌ Ｏ含 量 ， 高 Ｓ Ｄ Ｐ 提 ＯＤ 活力 ， 对脑 组织 具有 保护 作用 ， 机制 可能 与人 参二 醇组 皂苷 抑制 组织 脂 其 质过 氧化反 应 ， 上调 脑 组织 中 Ｉ ａ表 达 ， 轻 Ｌ Ｓ对 机 体 的损 伤 作 用 Ｂ 减 Ｐ
甘氨酸保护心肌细胞防止内毒素性损伤的作用和机制研究
甘氨酸保护心肌细胞防止内毒素性损伤的作用和机制研究硕士学位论文甘氨酸保护心肌细胞防止内毒素性损伤的作用和机制研究?中文摘要尽管抗生素能有效死亡率极高。
感染性休克是临床常见的全身性危重病症,- -地控制 G 但其杀死菌血症, G 引起内毒素血症, 菌的同时释放出大量内毒素,因内毒素性休克常伴有心肌细胞损伤和心功能不全, 严重者引起内毒素性休克。
此防治内毒素性心功能障碍对改善内毒素血症患者的预后具有重要意义。
本研究用内毒素诱导的心肌细胞损伤模型,观察甘氨酸对内毒素所致心肌实验分为三个为甘氨酸防治内毒素性心肌损伤提供实验依据。
损伤的拮抗作用,部分进行:第一部分:采用 MTT 法观察 Gly 对不同浓度 LPS 性心肌损伤细胞活力的影响,结果显示药物作用 48 可见随着小时后, LPS 浓度增高, Gly 的保护作用随( 之降低 P0.05 且呈一定浓度依赖关系; , ) Gly 对照组 1.720±0.105 与正常心肌细胞 1.791±0.124 ( 无明显差异 P0.05 示 Gly 能拮抗 LPS 的活性,提高心肌细胞活力,效果呈浓度依赖性。
第二部分:采用 Annexin V/ PI 流式细胞术观察 Gly 对 LPS 性心肌损伤细胞凋亡率的影响,结果证实: Gly+LPS 组的心肌细胞凋亡率均高于空白对照组P0.01 ; 4mmol/LGly 和 8mmol/LGly+LPS 凋亡率均低于 LPS 组 P0.01 , 呈浓度依赖性; 8mmol/LGly 组凋亡率与空白对照组无显著差异 P0.05示甘氨酸能明显抑制内毒素所致心肌细胞凋亡,效果呈浓度依赖性。
第三部分: Gly 拮抗 LPS 诱导心肌细胞凋亡的机制研究:( 1)?采用 DIOC 3 Gly 对 LPS 性心肌损伤细胞线粒体膜6结果证实: 电位的影响, Gly+LPS 空白对照组和组、 Gly 组的线粒体膜电位值均高于脂多糖组 P ? 0.05 ;同时 Gly 组高于空白对照组 P ? 0.05 。
细菌内毒素检查法及应用进展
细菌内毒素检查法及应⽤进展临床经验药品注射剂的热原检查时保证药品安全的重要检验项⽬。
家兔法（PT 法）检查热原的⽅法因耗时长、不经济、难以标准化等很多局限性使越来越多品种的热原检查项被细菌内毒素检查法（BET 法）所取代。
BET 是⼀种体外热原实验法，该法因其快速、灵敏、经济、重现性好等优点在国内外得到了⼴泛的应⽤。
因此检测细菌内毒素在药品质量控制、制药⼯艺和临床治疗监测中具有重要意义。
本⽂就细菌内毒素检查法及其应⽤进展作⼀综述。
1细菌内毒素检查法的国内外发展简述BET 最早由美国学者Dr.Levin 和Bang ⾸先建⽴，作为法定的检查⽅法。
1968年Dr.Levin 和Bang 发现阿⽶巴样⾎细胞含有⼀种物质，当和极⼩量的内毒素混合时就变成胶质，这个发现发展⾄今形成了现在的鲎试验法。
最早在1980年被美国药典20版（USPXX ）第⼀次正式收载，随后EP （1987版）BP Ⅷ1990年增补本，JP1991年改正版相续收载了此法。
到USPXXⅣ（2000版）已有580多种注射⽤药品采⽤了此法，仅有30余种药品因⼲扰因素难以排除⽽采⽤传统的热原法。
与国外相⽐，我国在这⽅⾯的研究还存在着较⼤的差距，发展较慢。
最早于1988年卫⽣部颁布《细菌内毒素检查法》和鲎试剂标准，中国药典（1995版）正式收载，规定13个品种使⽤BET 法。
到中国药典（2005版）细菌内毒素检查品种增⾄168种，BET 法正式收载光度测定法。
随着2010版中国药典的颁布和实施，它将被更⼴泛的应⽤于各种药品的质量控制。
2细菌内毒素检查的⽅法2.1鲎试验法鲎试验法⽬前有凝胶法，浊度法（⽐浊法），显⾊基质法(⽐⾊法)2.1.1半定量测定-凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产⽣凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的⽅法，是⼀种限量法，是各国药典细菌内毒素检查的⾸选⽅法。
此法操作简单，经济，不需要专⽤测定设备，结果可靠，重复性好。
其缺陷为特异性不强，精密度、定量性较差，不能直接反映药品中内毒素量值。
细菌内毒素检查法研究进展
细菌内毒素检查法研究进展摘要：细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖，在极微量（1-5ng/kg体重）的情况下便可引起人体发热、白细胞减少、微循环障碍、全身炎症反应及多器官功能衰竭等严重不良反应，所以在药物生产中，尤其是注射剂的生产中，细菌内毒素的控制与检测非常重要，关乎人们的生命安全。
本文对细菌内毒素检查法研究进展进行探讨。
关键词：细菌内毒素检查法；鲎试剂；微量凝胶法；重组C因子法引言：细菌内毒素广泛存在于人们的生活中，可引起人体发热、白细胞减少、微循环障碍、内毒素休克、弥散性血管内凝血等症状，在药品生产过程中不可避免地会引入细菌内毒素，所以药品质量控制中对内毒素的检测尤为重要。
目前，细菌内毒素的检测方法有家兔热原试验法、鲎试剂法、微量凝胶法、重组C因子法、酶联免疫法等检测方法。
文章对这几种检测方法进行综述，比较各自的优缺点，以期为内毒素的检测提供更合理有效的方法。
概述细菌内毒素的检测方法：家兔热原试验法、鲎试剂法、微量凝胶法、重组C因子法、酶联免疫法等检测方法。
《中华人民共和国药典》（2015版）规定细菌内毒素的检测采用鲎试剂检测法。
鲎试剂是由美洲鲎或东方鲎的血液中变形细胞的溶解物提取而成。
我国每年对鲎试剂的需求为1000万支，使我国鲎资源面临着巨大压力。
由于近些年浅海环境的恶化，人们肆意地捕食，我国的鲎资源急剧减少，所以，寻找细菌内毒素检查法的替代方法和补充方法已经迫在眉睫。
二、细菌内毒素检查方法分析1、家兔法由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以，采用家兔耳缘静脉注射的方式，监测家兔体温，用来定性检测热原。
但是家兔法存在很多缺点，如：不能定量检测热原、使用动物实验、检测周期长、灵敏度低等，因此家兔法正在逐步被取代。
2、鲎试剂法鲎试剂法是目前检查细菌内毒素的常用标准，鲎试剂主要含有：C因子、B因子、G因子、凝固蛋白酶原等物质，其反应原理是：首先C因子与细菌内毒素结合被激活为酶活性形式，然后活化的C因子将B因子活化，活化的B因子将凝固蛋白酶原活化为凝固蛋白酶，凝固蛋白酶将凝固蛋白原转化为凝固蛋白形成凝胶。
内毒素抑制剂的研究进展
杆菌 ． 早期 给 予 小 剂 量 的 Ｅ ５ ４能 降 低 小 鼠死 Ｉ率 １ ５６ 。
３ 抗 内毒 索抗 体
近 来 研 究 的 抗 内毒 素抗 体 主要 有 抗 类 酯 Ａ单 克 隆 抗 体 、
抗核心结构单克隆抗体 、 核心结构 多克隆抗体 及多克隆 （ 抗 ）
特 异 性 抗 体 ， 是 研 究 的 结 果 和 ｌ 试 验 并 不 令 人满 意 ， 但 ｆ 缶床 所
抗 内毒 素 抑 制措 施 的研 究 尤 为 重要 本 丈从 分 子 生 物 学 和 免 疫 学 角度பைடு நூலகம்． 近 年 来 内毒 素 抑 制 剂的 研 究作 一 综 述 对
关 键 词 ：内毒 素 ． 多糖 脂
内 毒 素 （ｎｏｏ ｉ） 革 兰 氏 ｌ 性 细 菌 （ｒｍ ｎｇ ｔ ｅ ｅｄｔｘｎ 是 ５ Ｊ 】 ｇａ ｅａｉ ｖ ｂｃｌ ， Ｎ ） 长 时 释 放 或 死 亡 时 裂 解 出来 的 细 胞 壁 脂 多 ａｉ ｓ Ｇ Ｂ 生 ｌ ｕ 糖 （ｐｐｌ ａｃ『ｉ Ｌ Ｓ 成 分 。 Ｌ Ｓ的 基 本 结 构 由 三 部 分 【００ｙ ｃｈｒｋ， Ｐ ） ｉ ｓ １（ Ｐ 共 价 键 连 接 而成 ， ０－特 异 性 抗 原 多 糖 （ —ｓｅｉｃａｔ ｅ 即 一 Ｏ ｐｃ ｉ ｎｉ ｎ ｆ ｇ ｐ ｂ ａｃａｉ ）核 心 多 糖 （ｏｅｐｌ ａｃａｉ ） 类 脂 Ａ（ｉｄ ｏ ， ｃｈｒ ｅ 、 ｓ ｄ ｃｒ ｏ ｓｃｈｒ ｅ 和 ｙ ｄ １ｉ ｐ Ａ） 其 中类 脂 Ａ 是 内毒 素 的 生 物 学 活 性 主 器 毒性 成 分 内 ， 毒 素 主 要有 两 方 面 的作 用 ”。一 方 面 ， Ｐ ： ｌ Ｓ在 细 菌 周 围 形 成 稳 固 的保 护屏 障 来 逃 避 抗 生 素 的 作 用 ； 一 方 面 ， ｌ 另 Ｉ ｓ作 用 丁靶 细 胞 ， 导 肿 瘤 坏 死 因 于 （＇Ｆ） 白 介 素 （Ｌ 和 氧 自由 诱 Ｎ 、 ｔ Ｉ） 基 （ Ｆ 等细 胞 因 子 的 释 放 ， 而 导 致 多 种 炎 症 介 质参 与 的 Ｏ Ｒ） 从
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抗内毒素治疗研究进展摘要自德国学者Richard Pfeiffer(1892年)发现细菌内毒素至今已有一个多世纪，人们对其生物化学特性及生物学作用已有较深入认识，它不仅是决定革兰氏阴性细菌感染（如脓毒症和感染性休克）的主要致病因子，也是至今仍在危及人类及动物健康的重要病原菌相关模式分子之一。
因此抗内毒素治疗的研究尤为重要。
本文主要从分子生物学和免疫学角度出发，对近年来研制开发的抗内毒素药物作一综述，并对其应用前景作了展望。
关键词内毒素；抗体治疗；类脂A结构；拮抗剂内毒素（endotoxin, ET）是革兰氏阴性细菌（GNB）细胞壁外膜的最外层脂多糖(LPS)成分，由O—特异性侧链，核心多糖和类脂A组成，其中类脂A 是内毒素的主要毒性成分。
内毒素多在细菌死亡后自溶释出，也可在代谢过程中释出，特别是当体内的GNB不断产生大量内毒素，在许多病理生理过程中越过肠粘膜屏障入血，形成内毒素血症（endotoxeamia, ETM），在内毒素性休克（即感染性休克）、弥漫性血管内凝血、多系统器官功能衰竭等临床危症的发病机制中起重要作用。
内毒素毒性作用机理除本身的直接作用外，主要是作用靶细胞诱导释放肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）、干扰素（TNF）和氧自由基（OFR）等一系列细胞因子，从而导致多种炎性介质参与的级联反应。
抗内毒素药物研究已是近十多年来国际医药学界研究最为活跃的领域之一。
1 限制内毒素生成1.1 减少内毒素的释放清除病原菌是治疗感染性休克的关键，使用有效抗生素能清除或抑制细菌繁殖，实际上也就减少了内毒素释放。
但自1977年Hopkin首次发表抗生素可以诱导内毒素释放的观点以来，这一现象越来越引起广大临床工作者的注意。
体外研究发现，在用有效抗菌药物处理的培养基中，细菌计数降低，但同时伴有内毒素总量或游离内毒素水平的升高。
实验性菌血症动物抗菌药物治疗后血中内毒素水平高于未治疗者，且内毒素释放增加与细菌计数降低相关。
国内周向东等研究了不同杀菌性抗菌药杀菌过程中致细菌内毒素释放的特点，发现各种抗菌药依据其致内毒素释放能力大小可分为高、中、低三群：β-内酰胺类抗菌药物内部各品种之间差别显著，氨曲喃、头孢他啶、头孢唑啉、头孢呋辛、氨苄西林属高释放品种，阿莫西林/克拉维酸、亚胺培南属低释放品种，氨基糖甙类各品种均属于中等释放品种，喹诺酮类的环丙沙星属高释放品种，氧氟沙星属中等释放品种，而多粘菌素B则属低释放品种。
因此，治疗GNB感染，在杀菌效能及其他情况（如药物浓度及作用时间）相同时，选用诱导内毒素释放少的抗菌药值得广大医务工作者注意，同时开发新一代高效杀菌、低毒的抗菌药物有较大的实用价值。
1.2 抑制内毒素的合成细菌类脂A是内毒素的最主要毒性成分。
有研究表明，通过对大肠杆菌类脂A乙酰葡糖胺转酰酶编码基因的诱变，细菌活性及类脂A合成下降10倍以上。
亦有研究证实，细菌类脂A的生物合成需要酶的参与，包括乙酰葡糖胺转酰酶、乙酰葡糖胺脱酰酶、葡糖胺转酰酶以及CMP-KDO(2-酮基-3脱氧-D-甘露辛酮糖酸)合成酶等。
如乙酰葡糖胺脱酰酶抑制剂L-573655和L-161240能竞争抑制细菌80%-90%的LPS合成，并在4小时内即可快速杀灭细菌。
体外实验还表明经CMP-KDO合成酶抑制剂处理后，细菌的通透性明显增加，对抗生素的敏感性上升10%。
2抗内毒素特异性抗体内毒素侵入体内后，首先与血浆中的内毒素结合蛋白（LBP）结合，再与单核细胞、巨噬细胞等髓源性细胞表面的脂多糖受体CD14（mCD14）或血浆中的可溶性受体CD14（sCD14）结合，激活单核细胞、巨噬细胞等释放一系列高生物活性的细胞因子，引起组织损伤及休克的发生。
随着分子免疫学的发展及对内毒素休克发病机理的深入研究，相继出现了许多针对发病过程各阶段的抗体阻断治疗。
2.1 抗核心糖脂抗体2.1.1 多克隆抗体早期人们用加热灭活的大肠杆菌J5免疫兔，产生抗内毒素多克隆抗血清，分别用于拮抗大肠杆菌、绿脓杆菌的攻击，结果动物的存活率远高于对照组。
后来人们又用大肠杆菌J5株免疫健康志愿者，将获得的免疫血清预防性地给予腹部大手术后病人，结果发现他们感染性休克的发病率显著下降。
但是，由于志愿者无再次应答能力，而且抗体滴度又无法控制，所以此类抗体没能在临床推广。
2.1.2 单克隆抗体抗核心糖脂的单克隆抗体有两种：一种是鼠源性的IgM单抗E5，是由煮沸J5疫苗免疫获得；另一种是人源性IgM单隆抗HA-1A，也由加热灭活的J5疫苗产生。
E5和HA-1A曾一度在部分西方国家被推荐使用，但由于治疗效果的不一致及其费用昂贵使人们有必要对其疗效及安全性做进一步的观察和评价。
2.2 抗CD14/LBP的抗体2.2.1 抗CD14的抗体CD14是LPS的受体，以sCD14和mCD14两种形式存在。
sCD14控制内皮和上皮细胞对LPS的应答，mCD14在单核细胞、巨噬细胞应答LPS中起重要作用。
Triantafilou等研究发现LPS在100ng/ml以内对内皮细胞的结合依赖CD14/LBP，抗CD14的单抗可阻断这种结合，但超过该剂量则不依赖CD14/LBP。
目前普遍认为LPS是多种分子的多聚体，而CD14只是其中配基结合亚单位，当LPS超过一定剂量时可通过其它亚单位来传递LPS的信号刺激而发挥作用。
2.2.2抗LBP的抗体LBP是肝脏合成的一种急性期血清蛋白，LPS在体内的作用依赖于LBP的存在。
1986年Tobias首次从兔急性反应血清中分离、纯化出LBP，并证明LPS通过类脂A与LBP结合形成LPS-LBP复合物，与CD14结合激发细胞应答。
Schutt通过实验发现LBP在GNB感染的生理及病理生理学起着重要作用。
动物实验证实预防性给予抗LBP抗体能保护小剂量内毒素的损害，但不能改善大剂量内毒素造成的损伤，同样说明LPS在大剂量时通过非依赖LBP 途径刺激细胞应答。
关于LBP抗体的保护作用，目前尚处于探索阶段，有待于进一步研究。
2.3抗CD11/18抗体CD11/18复合体是一种粘附分子，是调节中性粒细胞粘附到内皮细胞的细胞表面受体，也是中性粒细胞进入炎症部位的第一步。
抗CD11/18抗体抑制了中性粒细胞的粘附及向血管外迁移，说明抗CD11/18抗体在早期应用时有一定的保护作用。
Gardinali等在兔腹膜炎模型中预先给予抗CD11/18抗体的家兔死亡率要比对照组低40%，但此疗效并不持久。
目前，关于CD11/18的抗体治疗正在进一步研究中。
2.4鸡卵黄抗体用特定的抗原免疫产蛋母鸡后，其蛋黄中富含大量的IgY，而该抗体又来源于同一个体，在抗体的均一性上类似于单克隆抗体。
IgY对酸、酶、温度具有较高的稳定性，为口服应用提供了可能。
国外学者用IgY在抗轮状病毒腹泻及抗白色念珠菌感染治疗方面取得了满意疗效。
用大肠杆菌J5株作抗原免疫鸡制备抗内毒素的特异性IgY，通过口服直接从肠道拮抗内毒素有可能成为治疗内毒素休克的新途径。
3 内毒素拮抗剂3.1 类脂A结构类似物Loppnow等研究发现，类脂A的生物合成前体物质及无毒类脂A均能与内毒素竞争结合LBP，从而抑制了巨噬细胞、嗜中性粒细胞活性。
类脂X是大肠杆菌类脂A的单糖前体分子，也是第一个证实对内毒素有拮抗作用的分子。
此后以类脂X为先导化合物进行结构修饰，得到一系列类似物，但总的看来其拮抗作用相对较低，效果也有限，不过大肠杆菌双糖前体分子类脂IV A对内毒素的拮抗作用更强。
E5531是以荚膜红细菌类脂A为先导化合物，经结构修饰得到的类似物，其作用机理是通过阻断内毒素与细胞相互作用进而抑制内毒素引起的细胞活性，可抑制TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及NO等的释放，同时E5531及E5531-LBP复合物能竞争性抑制LPS与CD14受体结合。
E5531的抗内毒素活性比类脂X大大增强，现已进入Ⅱ期临床实验阶段，用于内毒素引起的发热和感染性休克的治疗。
3.2抗内毒素蛋白及多肽类抗内毒素蛋白及多肽具有杀菌、中和内毒素、抑制免疫细胞活性的作用。
杀菌性/通透性增加蛋白（BPI）是多形核白细胞（PMN）的嗜天青颗粒中带正电荷的蛋白质，由456个氨基酸组成，在PMN吞噬过程中释放到吞噬泡内。
BPI与内毒素有高度亲和性，能中和内毒素活性，增加细菌壁的通透性，并杀死细菌，而且瑞典Lund大学最近的一项研究表明BPI能抑制LPS诱导诱生型一氧化氮（iNO）的合成，减少NO含量，恢复血管对收缩剂的反应，预防ETM。
目前研制出的人重组BPI21和BPI23已被美国FDA批准进入Ⅲ期临床实验。
作为一种“超级抗生素”，BPI被认为是一种存在巨大潜力的抗内毒素和GNB感染的药物，已成为研究热点。
鲎抗LPS因子（LALF）是从美洲鲎中提取得到的单链多肽，体外能抑制LPS诱导人内皮细胞和鼠脾细胞的生物活性。
晶体学研究发现，LALF 分子中存在的β折叠反平行结构可能就是LPS的结合位点。
根据BPI和LALF 中LPS的结合部位以合成结构与功能和该部位相似的多肽物质是当前的研究重点。
BG38就是根据BPI中82-108位氨基酸（与内毒素结合部位）片段合成的分子多肽。
将BG38与钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）载体连接，可稳定GB38结构，增强BG38对LPS的亲和力，同时克服了BG38体内生物半衰期短的缺点。
在小鼠ETM模型中，BG38-KLH（350μg）几乎完全中和了血浆中内毒素（10μg），TNF-α水平也明显低于内毒素组。
BU3是在合成BPI中LPS结合部位的基础上，通过分子杂交技术融合IL-8中β折叠结构，得到的含33个氨基酸序列的小分子多肽，其空间结构更近似于BPI和LALE中的LPS连接部位，因而BU3体内、体外抗内毒素活性明显强于BG38-KLH，但BU3体内中和内毒素，抑制TNF-α分泌的能力不及BPI。
3.3 多阳离子结构拮抗剂内毒素分子含有大量磷酸基，带负电荷，而维持这种负电荷的存在可能就是内毒素发挥生物活性的必要条件之一。
Dand等对在内毒素拮抗剂的研究中发现，带有正电荷基团的药物就是通过其正电荷基团与内毒素类脂A上的PO4-结合，从而破坏了内毒素的结构而起到拮抗效果。
国内外学者对多阳离子结构拮抗剂作了大量研究。
阳离子抗菌肽的研究方面：多粘菌素B（PMB）为一种多价阳离子环肽抗生素，可直接与携带阴离子的类脂A部分特异性结合而使其失去活性，同时作为一种蛋白激酶C抑制剂,PMB能改善内毒素诱导胰岛素分泌过多的状况，但由于该药物抗菌谱窄，且对神经系统和肾脏均有毒副作用而限制了它的使用，而多粘菌素B九肽是采用酶裂解多粘菌素B而得到的，与前者相比，九肽衍生物具有毒性低，且保留抗内毒素活性的特点，很有希望使用于临床。