高通量测序用于发现严重感染病原体研究进展

中国病原生物学杂志　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２０１６年９月第１１卷第９期　

Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１６，Ｖｏ１．１１，Ｎｏ．９　附页１　

ＤＯＩ：１０．１３３５０／ｊ．４Ｐｂ．１６０９２４　・综述・　高通量测序用于发现严重感染病原体研究进展　任翊¨，宋营改。，张湘莉兰。，童贻刚。　（１．首都医科大学附属北京友谊医院，北京热带医学研究所，热带病防治研究北京市重点实验室，北京１０００５０；　２．北京大学第一医院，北京１０００３４；３．中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，北京１０００７１）　

【摘要】如何能在海量的高通量测序数据中去除噪音、发现致病微生物是一个重要的研究课题。临床信息指导下的高　通量测序能减少对于高通量测序海量数据的生物信息学分析工作量，高通量测序指导下的病原体致病性判断又减少了　临床撒网式筛查病原体的工作量。高通量测序的临床应用可能使得严重感染的临床治疗更为精准并有效降低死亡率。　【关键词】高通量测序；严重感染；病原体；综述　【中图分类号】Ｒ３７　【文献标识码】Ａ　【文章编号】　１６７３—５２３４（２０１６）０９一附页１一Ｏ３　

［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６　Ｓｅｐ；１ｌ（９）：ｉｎｓｅｒｔ　１—３．］　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｉｎ　ｓｅｐｓｉｓ　ＲＥＮ　Ｙｉ　，ＳＯＮＧ　Ｙｉｎｇ—ｇａｉ。，ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｎｇ—ｌｉｌａｎ。，ＴＯＮＧ　Ｙｉ—ｇａｎｇ。　（１．Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ　，Ｂｅｉ—　ｊｉｎｇ　Ｆｒｉｅｎｄｓｈｉｐ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ｐｒｅ—　ｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１０００５０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ；３．Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ）　

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ　ａｇｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂｉｇ　ｄａｔａ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｓ　ａｎ　ｉｍｐｏｒ—　ｔａｎｔ　ｆｉｅｌｄ　ｏｆ　ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｗｏｒｋｌｏａｄ　ｏｆ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ—　ｉｃｓ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｄｅｃｒｅａｓｅｓ　ｔｈｅ　ｗｏｒｋｌｏａｄ　ｏｆ　ｂｒｏａｄｌｙ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｆｏｒ　ｐａｔｈｏ—　ｇｅｎｓ．Ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｏｕｌｄ　ｍａｋｅ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｅｐｓｉｓ　ｍｏｒｅ　ｐｒｅｃｉｓｅ　ａｎｄ　ｍｏｒｅ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｉｔ　ｍａｙ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｆｒｏｍ　ｓｅｐｓｉｓ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｓｅｐｓｉｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎ，ｒｅｖｉｅｗ　

在探讨临床病因中，常见的临床思维考虑四个方面：遗传性　疾病、自身免疫或炎症性疾病、感染和肿瘤，其中感染的概念不　断在更新，脓毒血症（Ｓｅｐｓｉｓ）是指感染引起的临床疾病状态＿１］，　存在系统炎症反应综合征（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＳＩＲＳ）阴性的感染＿２］。临床中四大类致病因素常常　混杂在一起，但以一元论解释病因，其中最可能的致病因素是　本次疾病状态的病因。然而，有效区分四大类病因的标识至今　没有找到。由于严重感染能够快速致死，早期判定感染并采取　有效抗病原体治疗能够挽救生命，所以快速鉴别出感染及其可　能病原体是临床关键。高通量测序可以获取海量核酸序列信　息，这种信息不丢失的检验方法在寻找可能病原体中有很大优　势。高通量测序临床应用的劣势有：１）测序成本，尤其是海量　数据的计算机辅助分析速度及成本；２）人体标本及标本处理过　程均不是无菌状态，难以区分健康携带和污染信号，尤其是条　件病原体；３）难以确定高通量测序锁定的可能病原体和目前疾　病状态的因果关系。随着高通量测序成本的下降和云计算在　线分析软件的使用，高通量测序正在逐步进入临床应用，而临　床指导下的高通量测序和高通量测序指导下的病原体致病性　判断是有效的临床应用路径。　１临床指导下的高通量测序　”脐带结肠炎综合征（Ｃｏｒｄ　ｃｏｌｉｔｉｓ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＣＣＳ）是发生　于脐带造血干细胞移植后３～１１月的病因不明性疾病，患者表　现为非血性腹泻，结肠黏膜活检显示慢性活动性结肠炎、上皮　样肉芽肿形成、没有病原微生物感染的镜下表现（菌体）、没有　病毒感染的细胞学改变、没有移植物抗宿主疾病（Ｇｒａｆｔ—ｖｅｒｓｕｓ—　ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）的特征性病理表现，但患者抗菌素治疗　（甲硝唑或喹诺酮类药物）有效，部分患者停药后复发，再次用　药能够缓解。基于上述临床表现，Ｂｈａｔｔ等［３　设计了高通量测　序，对结肠黏膜活检标本进行鸟枪法测序（Ｓｈｏｔｇｕｎ　ｓｅｑｕｅｎ－　ｅｉｎｇ），在计算机辅助剔除人类基因后，把已知病毒、细菌基因序　列及未知序列（Ｎｏｎｈｕｍａｎ　ｒｅａｄｓ）列入候选，用抗菌素治疗前后　的检测结果对比，寻找可能病原体。结果发现在４个样本中，　肠慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｅｎｔｅｒｉｃａ）的命中次数为：　６３１　２７６次、１１９　１２２次、１　６６９　０８７次和１　３６０　４２２次排在首位，　第二位的代尔夫特食酸菌（Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）为５　００６次、　７　５１７次、１３７次和３９次，第三位的嗜麦芽寡养单胞菌　（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）为２　７４０次、２　９７５次、３７１次和　１１３次，及其他２３个有意义的潜在病原体，其中Ｂ．ｅｎｔｅｒｉｃａ命　中率最高，而且抗菌素治疗前后有命中次数下降的趋势，分别　下降了８４．４　和６０．５　，这与临床抗菌素治疗效果一致，因此　判别为首选的疑似病原体。根据Ｂ．ｅｎｔｅｒｉｃａ基因序列设计特　异性引物及荧光探针，在ＣＣＳ组和非ＣＣＳ组患者中检测发现，　ＣＣＳ组有特异性ＰＣＲ扩增产物，而对照组包括健康结肠黏膜、　

＊【通讯作者】任翊，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｅｎ７０１６＠ｍＳＦＩ．ｃｏｍ；　童贻刚，Ｅ—ｍａｉｌ：ｔｏｎｇ．ｙｉｇａｎｇ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ　【作者简介】任翊（１９７０一），男，北京人，博士，主任医师。研　究方向：高通量测序临床应用。　附页２　中国病原生物学杂志　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２０１６年９月　第１１卷第９期　

Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１６，Ｖｏ１．１１，Ｎｏ．９　

结肠癌旁黏膜和ＧＶＨＤ结肠黏膜标本都没有Ｂ．ｅｎｔｅｒｉｃａ特异　性基因片段ＰＣＲ扩增产物产生。　这项研究显示了临床信息对于高通量测序进行病原体识　别的指导意义。该方法首先利用临床特点，采用肠黏膜标本进　行高通量测序；其次利用在线ＰａｔｈＳｅｑ软件（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉ—　ｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐａｔｈｓｅｑ）ｌ４］排除人类核酸片段，利用Ｖｅｌｖｅｔ　软件＿５　和ＡＬＬＰＡＴＨＳ软件　］在无参考序列的情况下，通过核　酸片段重叠区拼接出更长的基因组序列；利用ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏ１）中的ＢＬＡＳＴＮ（ＢＬＡＳＴ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏ—　ｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）和ＢＬＡＳＴＸ（ＢＬＡＳＴ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）与美国国　家生物信息中心（Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　ｂｉ０ｔｅｃｈｎｏｌ０ｇｙ　ｉｎｆｏｒｍａ—　ｔｉｏｎ，ＮＣＢＩ）数据库进行比对，获得人类、非人类真核、原核和病　毒的核酸序列；第三，通过命中核酸序列次数排序和治疗前后　的自身比较动态变化，确定候选病原体；第四，针对候选病原体　建立特异性ＰＣＲ和荧光探针，利用肠黏膜组织标本的显微镜　下病理表现，如有无可见病原体，有无病毒感染的细胞表现，有　无肉芽肿形成，结合特异性荧光探针定位，展示候选病原体的　致病状态；第五，通过更大人群的疾病组和对照组验证，通过特　异性ＰＣＲ扩增再次说明候选病原体的致病可能。作者在临床　信息的指导下，如抗菌素治疗有效、病理表现不符合病毒感染，　真菌寄生虫感染证据太少等迅速锁定细菌感染，再利用高通量　测序一步步验证可能病原体，每一步判断都紧密结合ｌ临床去剔　除不必要的信息。　２高通量测序指导下的病原体致病性判断　Ｐａｌａｃｉｏｓ等［７］通过高通量测序寻找系列移植后死亡病例的　可能病因，供者（脑出血死亡）提供了１个肝脏和２个肾脏分别　移植给了３个受者，受者在移植后出现发热、中枢神经受累症　状，分别于移植后３６　ｄ、３０　ｄ和２９　ｄ死亡。实验室检测排除了　已知病原体感染。为了探讨是否为未知病原体感染致死，作者　提取了受者的脑组织、脑脊液、血清、肝组织、肾组织标本，提取　ＲＮＡ进行随机引物ＲＴ－ＰＣＲ和高通量测序，在计算机辅助下　排除引物序列、低质量噪音序列和无意义的简单重复序列＿８］，　与ＮＣＢＩ基因库进行比对，排除人类序列，确定可能病原体为　沙粒病毒Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ　Ｂｕｒｄｅｎ。针对这个新发现的沙粒病毒，建　立特异性引物的Ｓｙｂｒ　Ｇｒｅｅｎ定量ＰＣＲ；通过Ｖｅｔｏ　Ｅ６细胞培养　患者组织中提取的病毒标本，利用病毒感染的Ｖｅｒｏ　Ｅ６细胞建　立检测患者特异性ＩｇＧ、ＩｇＭ抗体的免疫荧光试验。结果３位　受者的组织、体液标本中均能发现该沙粒病毒的特异性核酸片　段，其中受者１的尿液中拷贝数达到８．８×１Ｏ　拷贝／ｍｌ，受者２　支气管灌洗液中１．２×１０　拷贝／ｍｌ，受者３血清中５．７×１Ｏ　拷　贝／ｍｌ；２位受者的特异性抗体阴性，１位受者出现抗体阴性到　阳性的转变过程；供者虽然没有发现新型沙粒病毒的特异性核　酸片段（ＰＣＲ阴性），但特异性抗体滴度分别达到ＩｇＧ１：８０和　ＩｇＭ１：２０；利用已知沙粒病毒保守抗原片段制备的兔多克隆　抗体，免疫组织化学方法也能在受者组织标本中检测到沙粒病　毒抗原的存在。　这项研究显示了高通量测序用于临床病原体诊断的指导　价值。作者通过高通量测序锁定了Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ　Ｂｕｒｄｅｎ后，通　过建立特异性定量ＰＣＲ检测病原体核酸、免疫组织化学方法　检测特异性抗原、免疫荧光方法检测特异性抗体，多角度论证　了该病毒导致患者发病的因果关系。实际临床操作中，高通量　测序可能锁定若干病原体，需要建立每个病原体的相应分析方　法，通过特异性核酸、抗原和抗体多方面检测验证致病因果关　系。一般认为：特异性定量ＰＣＲ结果阳性或动态变化与临床　表现变化一致，宿主特异性ＩｇＭ抗体由阴性转为阳性或特异性　ＩｇＧ抗体滴度４倍增加都具有临床意义。此外，利用病变组织　的病理表现，结合核酸探针原位杂交，显示病原体在病变组织　中的位置，也是验证病原体致病性的可靠方法。　３高通量测序在Ｓｅｐｓｉｓ治疗中的潜在应用价值　Ｓｅｐｓｉｓ的概念一直在改变，脓毒血症的翻译除了危及生命　和严重感染的内在含义外，不再局限于化脓菌感染和毒素血　症。目前普遍认为，Ｓｅｐｓｉｓ是有ＳＩＲＳ临床表现的感染，而严重　感染（Ｓｅｖｅｒｅ　ｓｅｐｓｉｓ）是有重要脏器功能障碍并可能危及生命的　感染。ＳＩＲＳ和Ｓｅｖｅｒｅ　ｓｅｐｓｉｓ的临床意义目前尚有争论　］。　Ｓｉｎｇｅｒ等［】　认为Ｓｅｐｓｉｓ是人体对感染的反应调节失常，导致危　及生命的器官功能障碍，临床上表现为序贯器官衰竭评估（Ｓｅ—　ｑｕｅｎｔｉａｌ　ｏｒｇａｎ　ｆａｉｌｕｒｅ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，ＳＯＦＡ）评分增高≥２分（ＳＯ—　ＦＡ评分，Ｏ～２４，分数越大器官功能障碍程度越大），临床预期　死亡率＞１０　。为了减少感染性休克（Ｓｅｐｓｉｓ　ｓｈｏｃｋ）的死亡率，　临床采用早期目标指导治疗（Ｅａｒｌｙ　ｇｏａｌ—ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｔｈｅｒａｐｙ，　ＥＧＤＴ）。Ｍｏｕｎｃｅｙ等　１］观察了ＥＧＤＴ组６３０例和常规治疗组　６３０例，ＥＧＤＴ组９０　ｄ死亡率为２９．５　（１８４／６２３），常规治疗组　为２９．２　（１８１／６２０），两组相比差异无统计学意义（Ｐ一０．９０）。　作者认为与补液、及时经验性使用抗生素（覆盖革兰氏阴性菌、　阳性菌和联合抗真菌的常规治疗）相比，ＥＧＤＴ没有明显降低　死亡率，反而增加了治疗费用和治疗强度。　因此，在严重感染治疗中，除了补液和可能病原体全覆盖　的经验治疗外，还能做什么？高通量测序指导临床抗感染治疗　可能是出路之一。高通量测序可以获得耐药基因、毒力基因等　全部信息，这可能使高通量测序辅助下的临床判断和治疗更为　精准和有效。　４小结　在海量的高通量测序数据中，如何能在大量的噪音中提取　有临床意义的信号还需要不断探索，其中计算机辅助和临床判　断是不可缺少的两个环节，临床信息指导下的高通量测序能降　低生物信息学的工作量，高通量测序指导下的病原体致病性判　断又减少了临床撒网式筛查病原体的工作量。随着高通量测　序成本的下降，一个患者的不同部位标本或不同时期标本可能　反复测序，而云计算可以在短期内给出统计数据供临床医师判　断，使得严重感染的临床治疗更为精准有效。