稳恒磁场照射对人鼻咽癌CNE-2细胞生长与凋亡的影响

关键词：稳恒磁场；鼻咽癌细胞株；生长抑制；细胞凋亡 中图分类号：Ｒ１１２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１１）５１－００１６－０４
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔｅａｄｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ＣＮＥ－２ ｃｅｌｌｓ
半导体器件厂生产，量程０～２ Ｔ，分辨率０．１～ｌ ｍＴ，经检测在误差范围内理论值与实验值一致，为７ ｍＴ）；酶标仪（美国ＢＩＯ－ＰＡＤ公司）；Ｃ０２细胞培养 箱（美国Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ公司）；ＲＰＭＩ １６４０培养基 （美国Ｇｉｂｃｏ公司）；新生牛血清（美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司）；噻唑蓝（ＭＹｒ）（美国Ｓｉｇｍａ公司），倒置显微镜 ＩＸ７０（１３本ＯＬＹＭＰＵＳ公司）。其他常用仪器均为国 内生产。ＣＮＥ－２细胞（桂林医学院科学实验中心提 供，本室培养于含有１０％胎牛血清的ＰＲＭｌｌ６４０培 养基中，添加１００ ＩＵ／ｍｌ青霉素及链霉素，３７℃、 １００％湿度、５％Ｃ０２条件下常规培养。以０．２％台 盼蓝拒染法确定活细胞数，每次实验细胞活率在 ９５％以上）。 １．２ ＣＮＥ－２细胞筛选及磁场照射取对数生长期 ＣＮＥ－２细胞，调整密度（ｃｅｌｌｓ／ｍ１）为１×１０４、２×１０４、 ５×１０４、１×１０５、２×１０５、５×１０５共６个等级梯度，分 别于０、１２、２４、３６、４８、６０、７２ ｈ接种于４８孔培养板 中，每孔补足０．２ ｍｌ细胞培养液，每组设６复孔，置 ＣＯ：培养箱培养，共培养７２ ｈ，用酶标仪在５７０ ｎｍ 处测定各孔吸光度值（ＯＤ），应用Ｍ，Ｉ－Ｉ’法检测其生 长情况【６ Ｊ，以空白培养基为实验对照组。结果密度 为２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ接种时，在实验期间细胞处于对 数生长期，而低于或高于此密度接种时，细胞的生长 或处于潜伏期或过早进入衰退期，因此采用２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ作为初始接种密度进行磁场照射：将经培 养的ＣＮＥ－２细胞连同培养板一起放人通电螺线管 中段的纸质平台上进行磁场照射处理，按１、３、９、 １２、２４、３６、４８、６０、７２ ｈ分别于３７℃、７ ｍＴ稳恒磁场 中、磁感线沿水平方向照射细胞Ｍ廿Ｊ，每次照射１５ ｍｉｎ，照射过程中螺线管放人ＣＯ：恒温培养箱中以 维持温度在３６—３７℃【６ Ｊ。照射结束后将细胞悬液 接种于４８孔培养板，进行相关指标观察。 １．３ ＣＮＥ－２细胞形态学观察 收集磁场照射后１２ ｈ的细胞，ＰＢＳ清洗２次，余０．３ ｍｌ ＰＢＳ重悬细胞， 滴片，自然干燥，甲醇固定１０ ｍｉｎ，蒸馏水浸润，用苏 木精染色１５ ｍｉｎ一流水冲洗－＋酸乙醇分色，自来水 蓝化一梯度乙醇脱水（３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、 ９５％）－＋伊红染色１０ ｓ一１００％乙醇２次，每次５ ｍｉｎ ＿ｌ／２无水乙醇＋１／２二甲苯５ ｍｉｎ一二甲苯２次， 每次５ ｍｉｎ一中性树脂封片，普通光学显微镜观察细 胞形态学变化，数码相机采集图像。 １．４ ＣＮＥ－２细胞增殖抑制情况采用ＭＴｒ法。设 正常对照孔及空白调零孔，吸弃陈旧培养基，每孑Ｌ加 新鲜配制的ＭＹｒ（５ ｍｇ／ｍ１）２０“ｌ再次孵育４ ｈ，弃 去ＭＴＹ液，每孔加ＤＭＳＯ １５０山，振荡１５ ｒａｉｎ，酶联
ｓｕｉｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ９ ｈ（Ｐ＜Ｏ．０５），ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ
ｏｆ ＣＮＥ－２ ｃｅｌｌｓ ｈａｄ ｇｏｏｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ＭＴＹ ｒｅｓｕｌｔ．Ａｆｔｅｒ ７２ ｈ ｉｎｓｏｌａｔｉｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｓｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｓｈｏｗｅｄ ｍｏｒ－ ｐｈｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ，ｂｕｔ ｈａｄ ｎｏ ＤＮＡ ｂｒｅａｋａｇｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ７ ｍＴ ｓｔｅａｄｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄｓ ｈａｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｔｏ ＣＮＥ－２．ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｎｅｅｄ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｓｔｅａｄｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ；ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ；ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
鼻咽癌是严重影响我国人民群众身体健康的恶 性肿瘤之一，在华南地区尤其以两广地区高发，广西 人群鼻咽癌检出率高于世界标准¨ｏ。目前治疗鼻 咽癌的主要手段为放射治疗，５年生存率较低；化学 治疗在鼻咽癌患者尤其晚期病例中占有重要地位， 但其毒副作用大，影响治疗效果。张卓立等旧１、杨 逢瑜∞１发现强稳恒磁场照射对体外培养的肿瘤细 胞生长有抑制作用，张小云Ｍ１发现稳恒磁场照射对 细胞由ｓ期进入Ｇ，期具有延缓作用，从而抑制细
注：与对照组比较，’Ｐ＜０，０５，△Ｐ＜０．０１
４ ２ Ｏ ８ ６ ４ ２ Ｏ —Ｔｕｌ／ｓｒｌ８ｂ＿×）＼越锫霉器
图２ ＣＮＥ－２细胞０—７２ ｈ曝磁过程中的生长曲线 ２．４ 细胞凋亡情况 电泳检测结果未见明显的
ｌａｄｄｅｒ ＤＮＡ条带（见图３），即在本实验条件的处理 下，细胞的凋亡作用导致ＤＮＡ断裂的效果不明显。
ｆｉｅｌｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ７ ｍＴ，ａｆｔｅｒ １，３，９，１２，２４，３６，４８，６０，７２ ｈ ｏｆ ｉｎｓｏｌａｔｉｏｎ ｍａｇｎｅｔｉｓｍ ｐｒｏ— ｃｅｓｓｉｎｇ，Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ，ＭＴＩ＂ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｅｌｌｓ； ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＨＥ，ＤＮＡ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｒｅ－
１７
表１ ＣＮＥ－２细胞照射后增殖情况（刀＝７。ｉ±ｊ）
组别 实验组ຫໍສະໝຸດ 细胞培养时间（ｈ）１ ３ ９ １２ ２４ ３６ ４８ ６０ ７２
对照组
ＯＤ值
Ｏ ３１９３ ± Ｏ３５１ Ｏ ２８６７ ± Ｏ ｌ ２５
．
Ｏ ２Ｏ７ ｌ 士 Ｏ ｌ ５６
．
Ｏ ２Ｏ １ ２ ± Ｏ２７４
．
Ｏ ｌ９７９ ± Ｏ３２６ Ｏ ｌ ８２７ ± Ｏ ｌ７５ ． Ｏ ｌ６９７ ± ０３ ｌ ６ △ ０ ｌ ｌ ３２ ± Ｏ２７３ △ Ｏ Ｏ９９５ ± Ｑ３３ｌ △ Ｏ ２９７８ ± ０Ｏ９８
图１细胞未照射（左图）与照射１２ ｈ（右图） 形态观察（ｘ５倍）
２．２磁场照射后ＣＮＥ．２细胞增殖抑制情况ｌ一８ ｈ内磁场对细胞的生长抑制作用不明显，９—３６ ｈ磁 场开始表现出对ＣＮＥ－２细胞明显的抑制作用，磁场 作用时间进入４８ ｈ后抑制作用进一步加剧，表现出 ７ ｍＴ稳恒磁场作用时间对ＣＮＥ－２细胞生长抑制作 用呈时间依赖性关系，见表１。 ２．３磁场处理过程中ＣＮＥ－２细胞的生长曲线 见 图２。
５００ ｂｐ ２５０ ｂｐ
图３ ＣＮＥ－２细胞凋亡电泳检测图 注：Ｍ：１ ｋｂ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；１：经曝磁处理；２ｔ未经曝磁处理 ３讨论
ＪＩＡＮＧ Ｌｉｎ—ｂｉｎｌ，ＹＥ Ｍｅｎｇ—ｌｉｎｇ，ＬＩ Ｌｅｉ，ＹＡＯ Ｈｕｉ—ｌｉｎｇ （１ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ Ｍｅｄｗａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｅａｄｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｓｏｐｈａ— ｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ＣＮＥ－２．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＣＮＥ－２ ｃｅｌｌｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｅｒｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｌｆ－ｍａｄｅ ｓｔｅａｄｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ
万方数据
免疫检测仪于５７０ ｔｉｍ波长测定吸光度。重复３遍， 记录数据并应用ＳＰＳＳｌ６．０软件进行统计学分析。 １．５ ＣＮＥ－２细胞生长曲线绘制 照射后ｌ、３、９、 １２、２４、３６、４８、６０、７２ ｈ分别取实验组和对照组样品 一份，台盼蓝拒染法进行活细胞计数。以照射时间 为横坐标，细胞密度为纵坐标绘制细胞生长曲线。 １．６细胞凋亡情况离心收集１０５一１０６磁场照射 ７２ ｈ后的细胞（１ ５００ ｒｐｍ，５ ｍｉｎ）于１．５ ｍｌ ＥＰ管 中，用Ｈａｎｋｓ液洗涤细胞２次（１ ５００ ｒｐｍ，５ ｍｉｎ），弃 上清；于沉淀的细胞中加入５００¨ｌ裂解液０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ（ｐＨ ７．５ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、５００斗ｇ／ｍｌ蛋白酶Ｋ）消化３７℃３０ ｍｉｎ。加等 体积ｐＨ ８．０的酚：氯仿（１：１），颠倒混匀，４℃１０ ０００ ｒｐｍ １０ ｒａｉｎ，吸取上层水相重复抽提１次。４℃ １０ ０００ ｒｐｍ １０ ｍｉｎ，吸取上层水相，加１／１０体积３ Ｍ ＮａＡｃ和２倍体积无水乙醇。颠倒混匀后至一２０℃ 过夜，４℃１２ ０００ ｒｐｍ ３０ ｒａｉｎ，小心弃去上清，用 ７５％乙醇洗涤１次，４℃１２ ０００ ｒｐｍ ３０ ｒａｉｎ，弃上 清，ＤＮＡ沉淀于室温干燥１０ ｍｉｎ后，加入含有 Ｒｎａｓｅ ２ ０００斗ｓ／ｍｌ的ＴＥ缓冲液１５“，溶解ＤＮＡ。 取５一样品用于电泳。配制１．５％琼脂糖凝胶，０．５ ×ＴＢＥ，电压为１０Ｖ／ｃｍ。当溴酚蓝走到凝胶的３／４ 处停止电泳，凝胶成像仪中观察检测电泳的情况并 拍照。 ２结果 ２．１磁场照射后的ＣＮＥ－２细胞形态学细胞经照 射１２ ｈ后，倒置显微镜下观察，细胞生长状态受到 明显影响（见图１）。ＨＥ染色观察示部分细胞形态 改变，细胞表面出现突起，细胞膜不完整，胞质内空 泡增多，部分细胞解体。