纳豆激酶分离纯化的工艺研究 韩超
纳豆激酶分离纯化技术的研究
山 东 轻 工 业 学 院 学 报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY
文章编号 :1004 - 4280 (2008) 03 - 0024 - 04
纳豆激酶分离纯化技术的研究
0 引言
纳豆激酶 (Nattokinase ,NK) 是日本学者须见洋 行从日本食品纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓 功能的丝氨酸蛋白酶 ,它是由枯草杆菌 ———纳豆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆后所产的酶[1] 。由于 NK 作 用迅速 ,维持时间长 ; 源于食品 ,安全性好 ; 分子量 小 ,是一个单链蛋白质 ,更易被人体消化道吸收 ;对 纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶等现用于临床的 药物 ,它同其他纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白 ,同
Phenyl Sepharose 疏水柱层析 Sephadex G2150 凝胶过滤层析 Sephadex G2100 凝胶过滤层板
第 22 卷
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
—
28 28 28 和 38
纯化倍数酶率活Π回%收
①4. 75 ②1. 32
—
①74. 3 ②77. 0
—
50
40
产品的生产主要是发酵液经过一系列的分离纯化方
具有操作简便 、可规模化生产及选择性强等特点 ,广 泛应用于规模化工业生产中 。基本工艺流程是离心 除菌 →盐析 (或有机溶剂沉淀) →超滤浓缩 →凝胶过 滤层析脱盐 →离子交换层析或疏水层析 。一般是将 凝胶层析 、疏水层析 、亲和层析和离子交换层析中两 种以上的层析方法配合使用来进行酶的分离 。
膨胀床吸附分离作为一种新型的蛋白质分离纯 化方法 ,其主要原理是根据静电吸附作用 ,将带有相 反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上 。该分离方法 避免了柱层析分离过程中 ,因复杂的纯化步骤而导致 纳豆激酶失活的缺点 ,具有快速分离纯化的优点。胡 洪波等[17] 对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进 行了考察 ,发酵液中经离心得上清液 ,将粗酶溶液的 pH 值调节至低于其等电点 ,采用 Streamline SP 强离子 交换吸附剂 ,Streamline 25 膨胀床柱 ,XK16 层析柱 ,吸 附时最佳的 pH 为 6. 0 ,电导率应低于 6. 2 msΠcm。然 后进行清洗解吸 ,得到比较纯的纳豆激酶 ,整个分离 过程缩短为 8～10 h ,回收率提高了约 50 %。
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究
纳豆激酶分离纯化及体外溶栓和溶血作用研究纳豆是日本的传统大豆发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵而成，在日本已食用近千年。
1987年，须见洋行等经过对上百种食物的筛选，首次发现纳豆含有溶解血栓纤维蛋白的成分，并命名为纳豆激酶(nattokinase,NK)。
研究表明，NK 是纳豆发酵过程中纳豆芽孢杆菌分泌的一种丝氨酸蛋白酶[1]。
进一步的研究表明，NKc具有很强的体内外溶栓作用，与传统的容栓剂相比，NKc具有易提取、成本低廉和能口服吸收溶栓等优点，因而可能成为新一代的溶栓药物[2-4]。
为了对NKc的开发提供理论依据，本实验室在研究NKc纤溶活性之后，进一步对其体外溶栓和溶血作用进行研究。
1 材料与方法1.1 材料菌株：为本实验室自日本纳豆分离纯化菌种，保存于养琼脂斜面，营养琼脂配方为：细菌培养用胰蛋白胨(bacto-tryptone)，1%；细菌培养用酵母抽提物(b acto-yeast extract)，0.5%；NaCl,0.5%；细菌培养用琼脂粉(bacto-agar powd er)，1.5%PH7.2。
纳豆、纳豆提取液：按文献[5]介绍方法制备。
血平板：用生理盐水配制1%琼脂，加入新鲜脱纤兔血，混匀倾注平板，冷却凝固即成。
主要试剂：凝血酶、纤维蛋白原、标准尿激酶（中国药品生物制品检定所）；蚓激酶(30×104 U•粒-1，北京百奥药业有限责任公司)；牛血清白蛋白(上海生化试剂公司)；低相对分子质量标准蛋白质(兔磷酸化酶：Mr97.4×103,牛血清白蛋白：Mr66.2×103,兔肌动蛋白：Mr43.0×103,牛碳酸酐酶：Mr31.0×103,胰蛋白酶抑制剂：Mr20.1×103,鸡蛋清溶菌酶：Mr14.4×103)（上海生化试剂公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 NKc分离纯化纳豆提取液经35%～75%饱和度硫酸铵分段盐析，离心收集沉淀，用50mmol•L-1磷酸缓冲液（PH 7.4）溶解，充分透析后获得纳豆激酶粗酶（NKc），再经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱（1.0cm×60cm）层析，分管收集纤溶活性较高部分，脱盐，冷冻干燥后获得层析纯纳豆激酶（NKc），SDS-PAGE电泳检测纯度。
纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用
纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用纳豆激酶的发酵、纯化条件的优化及开发应用引言：纳豆激酶(Nattokinase)是一种来源于传统日本食品纳豆中的蛋白酶，具有多种生物活性，如溶栓、抗凝血、抗炎等。
在过去的几十年里，人们对纳豆激酶的研究逐渐增多。
本文将重点讨论纳豆激酶的发酵过程、纯化条件的优化以及其在医药和食品工业中的应用。
纳豆激酶发酵的条件优化：纳豆激酶产生菌株的筛选和培养基的优化是纳豆激酶发酵的首要步骤。
选择产纳豆激酶能力较高的菌株，并通过基因工程方法来提高其产酶能力，可以大大增加纳豆激酶的生产效率。
培养基的研究也是优化纳豆激酶发酵条件的重要环节。
适当调整培养基的pH值、碳源、氮源和有机酸等参数，可以显著提高纳豆激酶的产量。
纳豆激酶的纯化方法：纳豆激酶是一种具有较高分子量的蛋白酶，因此采用离子交换、凝胶层析、亲和层析等技术进行纯化是常见的方法。
离子交换层析是利用蛋白质与离子交换柱上的固定相之间的静电作用进行分离，该方法具有简便、高效的特点。
凝胶层析则是基于蛋白质在固定相的排阻效应分离的技术，可以纯化目标蛋白酶。
亲和层析则是利用目标蛋白酶与亲和基质之间的特异结合来纯化蛋白质。
综合应用这些方法，可以得到较纯的纳豆激酶。
纳豆激酶的应用前景：纳豆激酶具有多种生物活性，因此在医药、保健品和食品工业中具有广阔的市场前景。
首先，在医药领域，纳豆激酶被广泛应用于溶栓治疗，可以降低血栓形成的风险。
同时，纳豆激酶还具有抗凝血、抗炎、降低血脂等功能，因此也可以用于治疗心血管疾病。
其次，纳豆激酶可以作为保健品，用于改善心脑血管健康、抗衰老和增强免疫等作用。
此外，纳豆激酶还可以用作食品添加剂，以增加食品的营养价值和保鲜效果。
结论：纳豆激酶发酵、纯化条件的优化以及其在医药和食品工业中的应用有着巨大的潜力。
通过选择高产纳豆激酶菌株和优化培养基条件，可以提高纳豆激酶的产量。
同时，离子交换、凝胶层析和亲和层析等技术可以有效纯化纳豆激酶。
纳豆激酶分离纯化研究进展
摘 要 纳 豆 激 酶 是 枯 草 芽 孢 杆 菌 发 酵 过 程 中产 生 的 一种 碱 性 蛋 白酶 ， 具 有 较 强 的溶 栓 作 用 。 与其 他 溶 栓 剂 相
比， 纳 豆 激 酶 易被 吸 收 ， 作用迅速 ， 安全 性好 ， 可 做 为 新 型 溶 栓 剂 。 文 中概 述 了纳 豆 激 酶 的理 化 性 质 和 作 用 机 制 ， 着 重 介 绍 了纳 豆 激 酶 的几 种 常 见 的 分 离 纯 化 方 法 ， 包 括柱层析 法、 超 滤法、 萃取 法和 亲和颗粒 法 ， 以 及 集 成 化 分
进纤 维蛋 白的溶 解 。虽 然 纳 豆 激 酶 对 纤维 蛋 白原 不
敏感 ， 但是 对交 联纤 维 蛋 白裂解 起 有 效 促 进 作 用 ， 并
且 能使 纤溶 酶原 激 活物 抑 制 剂 （ Ｐ Ａ Ｉ ． １ ） 失活 ， 通 过 阻 止 血栓 素形 成来 抑制 血小 板 的聚集 … 。 在 血液 中 纳 豆 激 酶 的纤 溶 活 性 能 保 持 ３ ｈ以
的活 性 。
１ 纳 豆 激 酶 的性 质 及 溶 栓 机 制
１ ． １ 纳 豆激 酶的性 质特 点 纳 豆激酶 是纳 豆 在 发 酵 过程 中产 生 的一 种碱 性 丝氨 酸 蛋 白酶 ， 由２ ７ ５个 氨 基 酸 残基 组 成 ， 分 子 质量 为２ ７ ． ７ ｋ ｕ ， 等电点 ｐ Ｉ 值为８ ． ６ 。虽然 纳 豆 激 酶与 丝氨 酸蛋 白家 族 的许 多 枯草 杆菌 蛋 白酶 的序列相 似 ， 并 且 具有 高度 的 同源性 ， 但是 对底 物表 现 出 了明显 的
胶 囊 的涂层 材 料 后 可 提 高 纳 豆 激 酶对 温度 和 ｐ Ｈ 的 稳定 性 。经 过 ５次反 复冻 融 ， 纳豆激 酶 的活性 仍 可 以保 持 在 ９ ５ ％ 以上 ， 表 明冻 融 对 纳 豆 激 酶 的活 性 影
纳豆激酶的分离纯化及酶学性质研究
文献标识码：Ａ
文章编号：１００５—１６７８（２００９ Ｊ０５—０２９８—０４
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ ＤＯＮＧ Ｚｈｉ－ｋｕｉ，ＹＡＮＧ Ｃｈａｏ，ＹＩＮ Ｚｏｎｇ·ｎｉｎｇ，ＬＩ Ｍｅｎｇ
（Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ；ｍｉｃｈａｅｌｉｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ（Ｋｍ）
心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，其 死亡率已超过了癌症。而血栓又是心脑血管疾病中 致死率最高的疾病之一，虽然现在临床上有许多用 于治疗血栓的药物，如链激酶、尿激酶、组织纤维蛋 白溶酶原激活剂以及蛇毒栓溶剂等，但是它们大多 为注射用药，使用不便，且副作用大、半衰期短，很难 满足血栓治疗的需要。
表ｌ
Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５
纳豆激酶经Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５凝胶色谱的纯化结果
Ｔａｂ．１ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ｂｙ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５
１，纳豆激酶发酵被的租提物；２．３ｕｐｅｒｄｅｘ ７５凝股色谱纯化后峰Ｃ的 峰尖；３．ＰＡＧＥ电泳纯化后的纳豆激酶活性带的蛋白提取液；４．标 准肼，蛋白参照品
记录ＮＫ发酵液粗提物经Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５凝胶柱后 收集液在２８０ ｎｍ处的Ａ值，结果如图１所示。分别 对Ａ、Ｂ、ｃ、Ｄ、Ｅ等５个峰进行酶活测定以确定活性 峰，结果其酶活依次为３．０４４，７．５３５，１１７．９４，７．１２５，
纳豆激酶论文：纳豆激酶地优化、提取分离纯化及基因克隆
纳豆激酶论文：纳豆激酶的优化、提取分离纯化及基因克隆【中文摘要】心脑血管性疾病,具有“发病率高、致残率高、死亡率高、并发症多”等特性。
2005年,世界卫生组织(WHO)调查表明,全世界每年约有1700万人死于心脑血管疾病。
并且随着人类生活水平的提高以及生活压力的增加,而呈现年轻化的趋势,而血栓又是心脑血管疾病中致死率最高的疾病。
所以,血栓的防治已是当务之急。
虽然传统药物在心脑血管及血栓栓塞性疾病防治上疗效显著,但毒副作用严重;而传统大豆发酵食品不仅效果显著且安全无毒,可作为一种具有开发和利用价值的功能性预防保健食品。
据文献记载,纳豆源于中国的豆豉,通过佛教由中国传入日本,日本人均寿命长的原因除了与较为优良的自然环境有关外,更重要的是其膳食结构中,发酵食品特别是消费量最大的纳豆,是日本人长寿的秘方,视为国宝级食品。
寺院喜食大豆是因为其蛋白质含量高达35.3%,而由纳豆菌产出的酶,能使50%的蛋白质变为水溶性,消化率可达80%。
还含氨基酸、维生素、植物性脂肪等。
据科学研究表明,纳豆食品不仅调整胃肠功能明显,还具有治疗感冒、痢疾、胀气、胃肠炎、消化不良、残便、便秘等功效,还有防治糖尿病,抑制血栓的生成和溶解血栓的作用,是一种延年益寿、健康的美容食品。
可以说纳豆是一种自然食品,是人类生活智慧的产物。
1987年日本的Sumi博士首次从日本传统食品纳豆中分离出一种具有强烈纤溶作用的碱性蛋白酶并命名纳豆激酶(nattokinase,NK)。
它不但能直接作用交联纤维蛋白,而且还可激活体内的纤溶酶原,从而表现出很强的溶血栓作用。
据报道其制品具有水解淀粉样蛋白,降低血浆纤维蛋白原的第七因子和第八因子,降低血液粘度、降血脂、降胆固醇,降血压,改善血液循环状态,维持血细胞的正常形态和功能,有利于神经损伤的再生,抑制骨质疏松症、抑制动脉粥样硬化等多种功能。
由于NK具有安全性好、成本低、经口服后可迅速入血,作用时间长,胃肠道稳定性好,可由细菌发酵生产、也可由基因工程菌生产等优点,有望被开发为新一代的口服抗血栓药物用于血栓性疾病的预防和治疗。
产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定的开题报告
产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定的开题报告
标题：产纳豆激酶菌株的分离筛选与鉴定
背景
纳豆是一种在日本和其他国家受欢迎的膳食品，由大豆经过发酵制成。
纳豆发酵过程中，菌群会产生一种特殊的激酶酶，被称为纳豆激酶（nattokinase），具有防止血栓形成和减少高血压的作用。
因此，纳豆激酶已成为研究的热点之一，许多研究组正在寻找新的菌株或改良现有菌株以提高纳豆激酶的产量和活性。
在此背景下，分离筛选和鉴定纳豆激酶菌株将有助于发现高产菌株和优化纳豆激酶的发酵工艺。
方法
1. 分离纳豆激酶菌株：从不同来源的发酵纳豆的样品中分离菌群，并进行初步鉴定和筛选。
2. 筛选高产菌株：使用定量酶测定方法，筛选出纳豆激酶高产的菌株。
3. 鉴定菌株：通过形态学、生理生化特性和分子生物学方法对高产菌株进行确认和鉴定，比较其与已知的纳豆激酶菌株的异同。
预期结果
本项目将筛选到高产纳豆激酶菌株，并对菌株的鉴定和鉴别进行系统研究和分析，以期发现新的产纳豆激酶菌株或改良现有菌株的技术路线。
纳豆激酶集成化分离技术
［ １ ］
盐等步骤， 主要差别在于采用的层析的种类、 搭配以及 操作条件的不同。
４ ］ １ ９ ９ ３年 Ｆ ｕ ｊ ｉ ｔ ａ 等［ 首次从固体发酵纳豆中分离纯
从纳豆
中分离 出 了 一 种 丝 氨 酸 蛋 白 酶， 并命名为纳豆激酶 （ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ｋ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ， Ｎ Ｋ ） ， 它是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草 Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ ｎ ａ ｔ ｔ ｏ ） 产生的。研究发现， 纳豆激 杆菌（ 酶具有纤溶活性和溶栓能力， 可治疗和预防血栓病， 还 可刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活剂（ ｔ Ｐ Ａ ） ， 增强溶
豆激酶的常规分离纯化技术进行了分析， 并对集成化 分离技术进行了系统评述， 以体现集成化分离技术在 生物分离过程中的优势及潜力。
１ 常规分离纯化技术
生物反应的产物一般是由细胞及细胞碎片、 游离 的胞外代谢产物、 胞内代谢产物、 残存底物及惰性组分 等组成的混合液， “ 难度大， 成本高” 是生物分离过程的 显著特点。目前对于纳豆激酶的分离纯化研究很多， 工艺已较成熟。纳豆激酶是胞外酶， 发酵结束时主要 存在于发酵液中， 所以传统的分离路径为： 发酵液离心 除菌， 硫酸铵盐析或有机溶剂沉淀、 离心、 层析纯化、 脱
图 １中的流程经过了 ４次盐析， ３次层析操作。可 见， 常规纳豆激酶分离工艺的显著特点是操作步骤多， 时间长。“ 多步骤” 导致的首要问题是产品收率偏低 （ １ ８ ％～ ５ ０ ％） ， 其次是能耗、 设备投资以及劳力急剧上 升， 导致“ 成本高” 。第三个问题是操作时间长， 这对保 持生物物质的活性十分不利。这些问题使得生产效率
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• 2、把纯化液稀释20 倍点样于纤维蛋白平板，与80 U/mL 尿激酶标准品作对照，具有明显的溶纤效果。具体结果见 图1
出现明显的透明圈， 说明具有明显的溶纤 效果
• 3、按上述方法得到的纳豆激酶纯化液，经SDS-PAGE电 泳，得到一条单一色带（见图2），说明发酵液中的杂蛋 白已基本除掉；与标准蛋白比较，此单一带的分子量在 27~28 kD之间，这与有关文献报道的根据氨基酸序列结 算出的纳豆激酶精确分子量27.782 kD基本相符。
•
4、中试扩大试验按上述的试验方法作适当调
整后进行的中试扩大试验，收集OD280>0.05的 洗脱液。由此获得的纳豆激酶纯化液经广州药物 研究中心检测，纯度大于90% 。
•
5、冷冻干燥 用甘露醇和葡萄糖处理的纳豆激 酶纯化液冷冻干燥后，酶活力都比原来下降了 20~40%，使用甘氨酸处理，则冷冻干燥后的酶 活力仍能保持95% 以上，说明甘氨酸是纳豆激酶 冷冻干燥时很好的保护剂。故最终选取1%甘露醇 和2%甘氨酸作为纳豆激酶冷冻干燥的赋型剂，由 此制作出的纳豆激酶冻干制剂既有漂亮的饼形， 又基本能保持原来的酶活力。
希望大家批评指正！ 谢谢！
结论
• 1、 之前大部分文献报道的纳豆激酶分离纯化方法基本 都要经过硫酸铵沉淀、透析、阴阳离子交换层析或疏水层 析等多步层析（见表3），步骤繁复，时间长，操作工艺 复杂，且多为间歇操作，生产效率难以提高，选择性低， 从而造成纳豆激酶分离纯化的成本很高，也不适宜连续化 的大规模生产。本纯化工艺方法简单，发酵液经离心过滤 后，只需经过一步阳离子交换层析，就能获得纯度较高的 纳豆激酶纯化液。得到的纳豆激酶纯化液加入适当的赋型 剂真空冷冻干燥后，基本上就能出成品，适合在企业的大 规模连续生产中推广应用，从而真正实现科研成果向市场 产品的转化。
酸二氢钠和0~1 M NaCl的洗脱液线性梯度洗脱，流速为
5~10 mL/min 。分段收集，测酶活力、总蛋白和纯度。
3.中试扩大试验
• 上述的试验方法作适当调整进行的中试扩 大试验发酵液通过发酵罐夹层冷却至4~15 ℃，用高速管式离心机以10000~16000 r/min 的速度离心；层析柱规格扩大为内径 18 cm，高50 cm；吸附方式改为柱外搅拌 吸附后再上柱，用pH 6.8 含6 mM NaH2PO4和100 mM NaCl 溶液洗脱，洗脱 流速为40~70 mL/min。收集OD280>0.05的 洗脱液。
与之前的分离纯化方法比较
• 2、 本研究把小试方法适当改良扩大，初步 进行了中试生产，结果基本令人满意，可 继续进行深化研究，细化生产工艺，争取 早日形成完善的生产线。 • 3、进行了冻干试验，选取了一种冷冻干燥 后饼形比较好，又基本能够保持纳豆激酶 酶活性的复合赋型剂，为研制纳豆激酶的 针剂产品打下基础。 • 总结：本工艺步骤简单、回收率高、适合 大规模生产
• CM-Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析纯化凝胶
先用pH 6.8 、含6~70 mM 的磷酸盐缓冲液平衡好。调节 过滤清液的离子浓度，使其电导率为1.6~2.2 mS/cm，以 6~15 mL/min的流速加入层析柱中吸附，然后先用pH6.8 、 6 mM的磷酸盐缓冲液洗涤柱床，再用pH 6.8含6 mM 磷
2
中试扩大试验
大规模生产后酶的纯 度有没有下降
冷冻干燥
制成纳豆激酶的针剂 10 ℃下，8000~12000 r/min离 心10 min ，收集上清液，再用0.2 μm滤膜 过滤，收集过滤清液，测酶活力和总蛋白， 于4 ℃保存备用。
2、CM-Sepharose Fast Flow 阳离子 交换层析纯化
• 2、针对之前报道的纳豆激酶分离纯化步骤较为繁 复，需经透析及多步层析处理，不利于扩大生产 的缺点，本科研小组试图只通过一次层析纯化， 得到符合纯度要求的纳豆激酶纯化液，以期开发 出适合大规模生产的纳豆激酶分离纯化工艺。
分离纯化方法
纳豆激酶发酵液预处理
CM-Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析 纯化 琼脂糖—O—CH ——COO-·Na+
纳豆激酶分离纯化的工艺研究
专业：微生物 成员： 韩 超、贺 龙、梁跃斌 杨文飞、苏瑞军、景炬辉
背景调查
• 1、纳豆激酶（Nattokinase，NK）是由日本学者须见洋 行等于1987 年首次在日本的传统食品纳豆（Natto）中发 现、提取并定名的，是纳豆在发酵过程中由纳豆芽孢杆菌 （Bacillus natto ）产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。 该酶不但具有明显的溶栓活性，而且还可以激活体内的纤 溶酶原，增加内源性溶纤酶的含量，具有降血压、抗氧化、 抗肿瘤及重要的溶解血栓等医学功效，且与传统的溶栓制 剂相比，具有安全性高、作用直接迅速、易被人体吸收、 特异性强、在体内半衰期长、口服和注射均可等优点，因 而具有广阔的开发前景。
4、 冷冻干燥
把收集到的具有纳豆激酶活性的纯化液进行超 滤浓缩，添加赋型剂，调节浓度为1000 U/mL， 10mL 硼硅注射剂瓶分装，每瓶1 mL，在冷冻温 度为-40 ℃，真空干燥温度为5~10 ℃条件下冷冻 干燥30~36 h。
结果
1、将收集液进行酶活力测定，发现OD280>0.05时洗 脱液具有纳豆激酶活性，且OD值越高，酶活力越高。纳 豆激酶活性峰集中在NaCl浓度为100-150 mM 时出现，说 明最佳的NaCl洗脱浓度为100-150 mM 。从降低生产成本 的角度考虑，最终选取pH 6.8 含6 mM 磷酸二氢钠和100 mM NaCl 的洗脱液进行洗脱。 经测定，用pH 6.8 含6 mM 磷酸二氢钠和100 mM NaCl的洗脱液进行洗脱，收集 OD280>0.05的活性部分，得到的纳豆激酶纯化液比酶活 为292292 U/mg ，发酵清液的比酶活为9875 U/mg，其纯 化倍数达29.6 ，回收率达73.3% ，具体结果见表1。