发光的大肠杆菌
基于荧光光谱技术的大肠杆菌活性及灭菌效应研究
2.1 大肠杆菌荧光强度与大肠杆菌浓ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的关系 用289 nm的激发光照射配好的大肠杆菌溶液，得到大
肠杆菌的荧光光谱，如图1所示。从图中可以看出332 nm附 近有一个非常宽的强发射峰，425 nm附近有一个非常弱的 发射峰。通过查阅文献得知332 nm附近处的发射峰是由蛋 白质中氨基酸的酪氨酸和色氨酸相互叠加产生的，425 nm
（16KJB140005）资助 作者简介：吴 莹，女，1982年生，江苏师范大学物理与电子工程学院 e-mail： wuying@jsnu. edu. cn
* 通讯联系人 e-mail: liuying70@126. com
3620
光谱学与光谱分析
第39卷
suulul
1.2主要试剂 大肠杆菌(固体，ATCC25922标准菌株，5 °C保存),LB
液体培养基［干粉，Tryptone (胰蛋白胨)*柠檬酸钠(分析 纯),硝酸银(分析纯),生理盐水，和去离子水。 1.3银纳米颗粒的制备
将0.02 g柠檬酸钠溶解于2 mL去离子水中，待用。将 0.018 g硝酸银溶解于100 mL去离子水中，加热至90 C后, 逐滴滴入已配好的柠檬酸钠溶液，保持90 C, 30 min后冷 却至室温，得到均匀分布的、平均半径约为28 nm的银纳米 颗粒。 1.4大肠杆菌溶液的配制
病性大肠杆菌45*。因此，有必要对大肠杆菌的生长进行监
测！因监测大肠杆菌的过程伴随着其自身的生长及衍生！所 以需要开发一种综合监测大肠杆菌浓度和生长曲线特征的方 法"
纳米银颗粒具有安全、高效、无耐药性及广谱抗菌等特 点！可杀死数百种微生物！是最新一代的天然抗菌剂 如！纳米银可以与细胞内的线粒体作用产生具有强氧化性的 活性氧！使其失去生物活性！导致细胞凋亡⑻；纳米银可以
发光菌的生物毒性测试方法
实验原理
1 发光菌的发光机理 细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化， 将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为 FMN 及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长 为450-490nm处的蓝绿光。 2 实验原理 当发光细菌接触有毒污染物时,细菌新陈代谢则受到影 响,发光强度减弱或熄灭,发光细菌发光强度变化可用发 光检测仪测定出来。在一定浓度范围内,有毒物浓度大 小与发光细菌光强度变化成一定比例关系,因此可通过 发光细菌来监测环境中的有毒污染物。发光细菌应用最 多的是明亮发光杆菌,可以监测各种水体,对气体中可溶 性有毒物质,可先通过吸收、溶解在溶液中,再来观察其 对发光细毒性测试仪是基于毒性物质对 特殊的发光细菌的发光度的抑制作用而设 计的，它通过测定发光细菌发光度的变化， 量度被测环境样品中由重金属和其它有机 污染物所造成的急性生物毒性。
实验步骤
1 仪器的预热15min和调零 2 试管排列和滴加3%Nacl及样液
取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓿瓶和 Nacl溶液，将安瓿瓶置于含有冰块的保温 3 细菌冻干菌剂复苏 瓶中，注入Nacl溶液混匀，2min后菌即复 取2ml测试管加2mlNacl3%溶液，10μ L复苏 苏发光 发光菌液，颠倒摇匀，测试发光量，倍率 4仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 调至X2，发光量高于600mv，此冻干粉可 用 发光菌液复苏满15min，用10μ L微量注射 器准确吸取10μ L复苏菌液，逐一加入各管 5 给各测试液加复苏菌液 摇匀（精确计时，记录到秒） 拔出样品室的盖子（红指示灯亮），将待 测样品液比色管放入，盖好盖子，抓住盖 子顺时针旋转（此时只绿指示灯亮）约16 读数 2s读数，抓住盖子顺时针旋转至原处（只 红指示灯亮）向上拔出盖子，取出样品。
显色荧光方法检测牛奶或水中大肠杆菌
变化 和荧 光现象 。 有蓝 紫 色荧光 产生 的培养基 说 明大 性 酶和特 异性底 物结合 后 ， 可导致 反应 物显 色或发光 肠杆 菌 的存 在 。 牛奶和 水 中大肠 杆菌 的标 准检 测方法
［ ４ 】
。
这 个 科学原 理被 成功地 应用 到对 大肠菌 群和 大肠
Ｌ Ｓ Ｔ 肉汤
１ 十 ＋
Ｂ ＧＬ Ｂ肉汤
＋
ＥＣ肉汤
＋
Ｅ ＭＢ平板
＋
革 兰 氏染色
＋
２ ３
４ ５
＋
＋
＋
＋
＋
＋
６
＋ ＋ ＋ ຫໍສະໝຸດ ＋ ＋ ＋
附表 ２ 显色 荧 光 法和 标 准 方 法 的试 验 时 间 比较
显色 荧光 法 标准 方法 Ｌ Ｓ Ｔ 肉汤
１ ． ２ 方 法
法 进行 检测 ， 现 将结 果报道 如 下。
分 别使 用显色荧光 方法和标准方 法对稀释 牛奶和 水 样 品 中的大肠 杆菌 进行 检测 。 显色 荧光 法具 体为 ：
１材 料 和方法
附表 １显色荧光法和标准方法检测牛奶或水中大肠杆菌
样 品号 显 色荧 光法 标准 方法
分别 参 照相 关文 献进 行 。 最 后 的样 品为６ 个 分 别为 加 杆菌 的检测 中。 我们使 用的ＭＵＧ 培养基就符 合这一反
入标 准 菌株稀 释 液 的牛奶 样 品 （ １ 号样 品 ） 、 本地 不 同 应 原理［ ５ １ 。 我们 的检 测结果 显示 使用 显色荧 光法对 大 区域 的 自来 水样 品 （ ２ ， ４ ， ５ 号 样品 ） 、 加人标准 菌株稀 释 肠 杆菌检 测 的阳性率 和标准 方法相 同 。 使 用显 色荧光 液 的 自来 水样 品 （ ３ 号样 品 ） 、 标准 菌株 稀释液 （ ６ 号样 法对 牛奶 样 品进 行 的大 肠杆 菌最可 能数检 测 ， 结果 显
发光细菌
发 的光太 弱
,
肉 眼看不 见
但群 集 的发 光 细菌 若对 发光细 菌适
不 同种 的发 光 细 菌 的荧 光酶 的
“
和 日亚
却 可以 放 出足 够 强 的 可 见 光
当 培养
基相互 可以
杂交
”
,
形 成 的 杂 种 二 聚 体仍 具
“
生长到 足 够多 时
,
,
会发 出明 亮的蓝 绿
。
有 一 定 的发 光 活 性
一边
,
到 晚上 熄 灯 后
,
你多半 会 见 到 这 一 堆内
,
脏发 出幽 幽 的蓝 绿 荧 光
如 翠玉 一 般
,
,
让 你惊
。
菌 发 !光 {细 …
.
奇 不 已 ! 这 是 因 为发光 细 菌 大 量 孽 生的缘 故 不 要 以 为这是 罕 见 的
。
实际 上
这 种 细 菌发光
“
朱文 杰
。
的 现象早 在北 宋 时期 沈 括所著 的
、
不 管发 光细 菌 的种
、
属有多大差 例如
,
它 们有 自由漂 浮的 虾
、 、
,
也有腐 生
,
从 中 提 取 的荧光酶 却很相 似
,
。
。
它们
、
之 类 共生的 乌贼
。 ,
使 与之 共
a 均 为二聚体 由 两 个不 相 同的 亚 基一 一 和 日亚
鱿鱼
,
乌 贼 等发光
。
单 个发光 细菌
基 构成 活性
。
a
或日 亚 基 单独均不 具有催 化 发 光 的
MicroSnap快速检测大肠菌群和大肠杆菌技术
５小结 Ｍｉｃｒｏ．Ｓｎａｐ是一种用于特定细菌检测和计
数的新型快速检测方法。该检测方法采用了一 种新型的生物发光反应，当有特定细菌存在时 其所产生的酶会与特定底物发生反应并产生 光。产生的光信号可由配套的Ｈｙｇｉｅｎａ ＥｎＳｕｒｅ 或Ｐｉ．１０２多功能检测仪进行测定。依据所检 测的细菌水平可在ｌ至８小时里报告结果。单 个细菌一般能在８小时里被检出。Ｍｉｃｒｏ．Ｓｎａｐ 可广泛应用于生产表面监测原料及成品检验固 体、液体和过滤产品检测。
第五届中国北京国际食品安全高峰论坛
Ｍｉｃｒｏ—Ｓｎａｐ…快速检测大肠菌群和大肠杆菌技术
Ｆｒａｎｋ Ｐｅｎｇ （海净纳（上海）商贸有限公司）
传统方法的大肠菌群和大肠杆菌的检测时 间至少需要４８小时确定阴性结果，如果发生 阳性情况，时间将更长。美国Ｈｙｇｉｅｎａ公司新 近推出的Ｍｉｃｒｏ．Ｓｎａｐ是一种新颖的大肠菌群 和大肠杆菌生物发光检测方法，可以在８小时 内对大肠菌群和大肠杆菌进行测定和计数。此 技术大大缩短了对于大肠菌群和大肠杆菌的检 测时间，并且以高灵敏度和精确度给人们对于 大肠杆菌和大肠菌群检测提供福音。
为本底噪音。
４．１定量检测（４小时孵育）
ＲＬＵ的输出和原始接种和相应的细菌
（比如ＣＦＵ）成正比，所有仪器在两种方法
都表现出非常良好的相关系数（Ｒ２为０．８６－
０．９９）＞９２％。
在ＥＮＳＵＲＥ中孵育４小时后的典型大肠
菌群技术的标准曲线如图ｌ。
表１使用三种光度计大肠菌群定量试验
ＲＬＵ值
＜１０ ３０ １００ ３００ １０００ ３０００
如需对检测结果进行大肠杆菌检测，可以
方便的通过Ｍｉｃｒｏ－Ｓｎａｐ增菌拭子和Ｍｉｃｒｏ－
大肠杆菌荧光染色方法
大肠杆菌荧光染色方法1.引言1.1 概述大肠杆菌荧光染色方法是一种常用的实验技术，用于检测和观察大肠杆菌的存在和分布情况。
大肠杆菌作为一种常见的肠道细菌，对于人类和动物的健康具有重要的影响。
因此，快速、准确地检测大肠杆菌的存在是非常重要的。
荧光染色技术是一种基于分子生物学原理的方法，通过将荧光染料与目标菌株的特定成分或结构相互作用来实现细胞的染色。
相比传统的染色方法，荧光染色具有显著的优势，如高灵敏度、高特异性和直观的成像效果。
因此，荧光染色方法在大肠杆菌的检测中得到了广泛的应用。
本文的主要目的是介绍大肠杆菌荧光染色方法的原理、优点和应用前景。
首先，我们将详细阐述大肠杆菌的重要性，包括其在人类肠道和环境中的分布情况以及与人类健康相关的疾病。
接下来，我们将重点介绍荧光染色方法的原理，包括选择合适的荧光染料和适当的染色条件，以达到对大肠杆菌的准确和可靠的染色结果。
在结论部分，我们将总结荧光染色方法的优点，如高灵敏度可以提高大肠杆菌的检测效率，高特异性可避免误判，直观的成像效果方便观察和分析。
此外，我们还将展望这种方法在临床诊断、食品安全监测、环境卫生等领域的应用前景，希望能为相关研究提供参考和借鉴。
总之，本文将全面介绍大肠杆菌荧光染色方法，旨在推广和应用这一技术，在大肠杆菌相关领域的检测和研究中发挥重要作用，为保障人类健康和环境安全做出贡献。
1.2文章结构文章结构：本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分包括概述、文章结构和目的三个小节。
在概述部分，我们将介绍大肠杆菌荧光染色方法的背景和意义。
随后，在文章结构部分，我们将详细介绍本文的组织结构和各节的内容。
最后，在目的部分，我们将阐述本文的主要目的和意义。
正文部分主要分为两个小节，分别是大肠杆菌的重要性和荧光染色的原理。
在大肠杆菌的重要性部分，我们将介绍大肠杆菌在生物学研究中的重要地位和广泛应用领域。
随后，在荧光染色的原理部分，我们将详细讲解大肠杆菌荧光染色方法的原理、步骤和关键技术。
会发光的大肠杆菌
会发光的大肠杆菌
吴依繁
【期刊名称】《生物信息学》
【年(卷),期】2012(010)002
【摘要】生物光源是一种低耗环保的照明方式，并可用于标记目标物的位置。
存在于萤火虫体内的荧光素（D—luciferin）以及深海发光生物体内的发光蛋白便是两种肉眼可见的生物光源。
剑桥大学iGEM团队将编码该类蛋白的基因转入到大肠杆菌体内，制作出了会发光的大肠杆菌。
【总页数】2页(P143-144)
【作者】吴依繁
【作者单位】哈尔滨工业大学食品科学与工程学院哈尔滨150090
【正文语种】中文
【中图分类】Q5
【相关文献】
1.应用辣根过氧化物酶化学发光法检测毒素原性大肠杆菌方法的建立 [J], 林万明;徐健雄
2.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应条件优化及在大肠杆菌生物发光检测法中的应用 [J], 刘慧慧;王静雪;林洪
3.免疫磁化-电化学发光仪检测食品和环境水标本中大肠杆菌O<sub>157</sub>和鼠伤寒沙门氏菌 [J], 汪力亚
4.第12届全国发光学学术会议暨发光学相关产业研讨会第二轮通知 [J],
5.大肠杆菌的化学发光免疫测定 [J], 杨秀岑;伍莉萍;黄明清
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得到发光大肠杆菌的实验设计
得到发光大肠杆菌的实验设计20 艾珉吉pEGFP-N3载体为真核细胞表达载体。
主要有以下几个部分载体质粒PET-28a 目的基因质粒(绿色荧光蛋白)将重组质粒导入大肠杆菌体内一、实验所用质粒pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移(荧光波长较大)变异体蛋白，具有更强的荧光(在485nm激发下比野生型强35倍)和在哺乳动物细胞中有较好的表达。
激发峰在488nm，发射峰在507nmpET-28a质粒载体上面携带一个N-terminal His Tag／Thrombin／T7 tag结构以及一个可以选择的C-terminal HisTag。
克隆表达区域的编码框由T7RNA 聚合酶转录。
二、具体步骤(一)重组质粒PET-28a-GFP的构建先获取大量的目的基因，然后构建重组质粒，进而导入大肠杆菌通过对大肠杆菌的培养繁殖来让质粒扩增，以获取更多的质粒具体操作; PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒——PCR实验用品：1.材料：pEGFP-N3质粒，0.2mlEP管，取液器吸头，一次性手套。
2.试剂：ddH2O、10×Buffer、MgCl2、4×dNTP、引物、Taq酶、质粒DNA模板、琼脂糖、Gold view。
3.设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统。
注：绿色荧光蛋白引物：p1 Ndel/p2 Xhol正向引物-p1：5'-ggg cat atg gtg agc aag ggc gag gag-3'反向引物-p2：5'-ggg ctc gag tta ctt gta cag ctc gtc catg-3'PCR实验步骤：1.在0.2mL EP管内配制50μL PCR反应体系1个：ddH2O 34μL、10×Buffer 5μL、MgCl2 3μL、4×dNTP 2μL、正向引物1μL、反向引物1μL、Taq酶1μL、质粒DNA模板3μL。
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01
设计引物
04
胶回收
02
PCR
05
纯化
03
电泳
06
测序
PEGFP-N3目的基因EGF的PCR引物
•PEGFPN5’
5'TGGGAGGTCTATATAAGCAGAG3'
•PEGFPN3’
•Primer #1
5’GTCGCCGTCCAGCTCGACCA3’
•Primer 2 •Tm 68.5 °C •Molecular weight 6863.5 g/mol •Extinction coeficient 181100.0 l/(mol˙cm)
质粒的酶切
寻找pet28和pegfp-n3的酶切位点
质粒的酶切（两个质粒同时酶切）
确定的酶切位点：EcorR I、Xba I
内切酶：Not I、BamH I内切酶 Buffer：cutsmart
37℃ 温育 4hours
未酶切的质粒作对照，1%琼 脂糖凝胶电泳鉴定结果
纯化
PEGFP-N3 目的基因扩增
发光的大肠杆菌
朱静宇 张明 石卉
实验方案概述
制备感受态细胞
质粒扩增
质粒酶切
目的基因序列扩增
连接
转化
材料
•大肠杆菌
•少量PET 28质粒（既为原核质粒又为真核质粒）
•显示绿色荧光的PEGFP-N3质粒（为真核质粒）
制备大肠杆菌感受态细胞
• 挑取E.coil单菌落接种至2mlSOC 培养液，37℃摇床过夜。 •挑取0.5—1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB 中，18℃剧烈震荡，直至A600达到0.6， 取出水浴10min • 4℃ 4000rpm/min 10min.同时冰浴配置TB溶液。 •弃上清，倒置离心管于滤纸上 •1mlTB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB 溶液冰浴10-15min。4℃ 4000rpm/min 10min •去上清，沉淀重悬于4mlTB中，冰浴10min •加入280uL DMSO,混合均匀，冰浴10min •分装于EP管中，-80℃或液氮保存 •检测感受态细胞的质量（阴性对照）
•Tm 57.6 °C
•Molecular weight 6863.5 g/mol •Extinction coeficient 229700.0 l/(mol˙cm)SXJ
PCR 体系
Taka Ra Taq
•premix体系
dNTP mixture
PCR buffer
PCR反应条件
PEGFP-N3 Primer 1 Primer 2 ddH2O
摇菌+提质粒
• 将培养过夜的平板取出，用已灭菌的枪尖挑取平板上单个的较大的菌 落 •将移液枪尖打入5ml培养基内，放入37°C摇床中 rpm/min,摇菌16小时 左右 •运用Omega等品牌的试剂盒对菌液进行小提
•用浓度为1%的胶，120V 20min，用10000的marker做对照验证
•测浓度
质粒扩增
•pet28的质粒扩增 •PEGFP-N3质粒扩增
100ul感受态细胞于冰浴上融化 •加入1ul pet28质粒和1ul PEGFP-N3质粒，轻轻吹匀，冰浴30min
•将菌液放入42°C水浴热激90s，立即放入冰浴中2min
•将菌液2000rmp/min离心3min，留200ul上清液将菌体打散，均匀涂布 于含卡那抗性的琼脂平板，平板于37° C倒置培养过夜。 •同时进行阳性和阴性对照
02
加入质粒，混匀，冰浴 05
2000rpm/min 3min 涂布
03
菌液热激90s后冰浴2min
挑菌落
涂布后，适当培养，挑取单克隆大肠
杆菌菌落，进行检验。
镜检
在荧光显微镜下可看见发绿色荧光 的大肠杆菌即为实验成功。
<100ng 0.2-1.0uM 0.2-1.0uM 补足50uL
循 环 35 次
95℃ 98℃ 60℃ 72℃ 72℃ 4℃
3min 10s 30s 1min 5min ∞
连接
01
加入样品与buffer
02
混匀，短暂离心
03
孵育 22℃ 3h
质粒的转化
01
感受态细胞冰浴融化
04
加SOD，37℃摇菌