产有机磷农药降解酶菌株的筛选及酶学性质研究
有机磷农药残留高效降解微生物的筛选、鉴定及降解机理研究的开题报告
有机磷农药残留高效降解微生物的筛选、鉴定及降解机理研究的开题报告一、研究背景随着农业生产的发展，化学农药的使用量不断增加，有机磷农药作为一种重要的农药类型，由于其高效、低毒、广谱等特点，在现代农业中得到了广泛应用。
然而，有机磷农药具有较高的残留性，对人体健康和环境造成了一定的威胁。
因此，寻找一种高效的残留降解方法成为当前亟待解决的问题。
微生物降解是一种环境友好的残留降解方法，已被广泛应用于农药残留降解中。
因此，筛选、鉴定和研究具有高效降解有机磷农药能力的微生物，对于解决有机磷农药残留问题具有重要意义。
二、研究内容本研究旨在筛选、鉴定具有高降解有机磷农药能力的微生物，并研究其降解机理。
具体研究内容如下：1. 筛选样品的选择：采集来自不同农田土壤、水体、废水等样品，通过天然培养、微生物共培养等方法筛选出具有高降解有机磷农药能力的微生物，并对其进行初步鉴定。
2. 鉴定微生物：通过形态学、生理生化特性等方法鉴定微生物的生物学特性，并进行16S rRNA序列分析，确定微生物的分类学位置。
3. 优化降解条件：在确定具有高效降解有机磷农药能力的微生物后，通过改变培养条件如温度、pH值、培养时间等条件，优化微生物的降解效率。
4. 降解机理研究：通过检测降解前后的有机磷农药残留量、降解产物等方法，研究微生物降解有机磷农药的降解机理。
三、研究意义本研究可从以下几个方面对有机磷农药残留问题进行防治：1. 通过筛选高效降解有机磷农药能力的微生物，开发一种环境友好的降解方法，可有效减少有机磷农药残留。
2. 通过优化降解条件和研究降解机理，可以提高微生物的降解效率，并为有机磷农药残留降解提供更有针对性的方法。
3. 本研究对微生物的筛选、鉴定及降解机理研究等方面均有一定的理论与实践意义。
四、研究方法本研究主要采用以下方法：1. 采集样品：选择不同类型样品，包括土壤、水体、废水等样品，筛选具有高效降解能力的微生物。
2. 培养筛选：采用天然培养、微生物共培养等方法筛选出具有高降解有机磷农药的微生物，并对其进行初步鉴定。
有机磷农药降解方法及应用研究新进展
3、生物法
生物法利用微生物或酶的催化作用降解有机磷农药。微生物降解是通过微生 物体内的酶系统将有机磷农药分解成小分子。这种方法具有环保、经济等优点， 但需要合适的微生物种群和适宜的生长条件。酶降解是有机磷农药降解的另一种 生物法。在酶降解中，特定的酶能够催化有机磷农药的分解反应，将其分解成小 分子。这种方法具有高效、专一性强等优点，但需要寻找合适的酶源，且酶的稳 定性可能影响其应用效果。
四、应用前景
微生物降解技术具有广阔的应用前景。目前，已经开发出了一些基于微生物 降解的生物修复技术，用于治理有机磷农药污染土壤。这些技术包括：
1、生物强化技术：通过添加具有降解能力的微生物，提高土壤中有机磷农 药的降解速率；
2、生物堆肥技术：将有机废弃物与污染土壤混合堆肥，通过微生物的作用 将有机磷农药降解为无害物质；
四、结论
有机磷农药降解方法及应用研究新进展为解决环境和食品安全问题提供了新 的思路和方法。随着科学技术的发展和研究的深入，相信未来会有更多高效、环 保、经济的有机磷农药降解方法被发现和应用，为保护环境和人类健康做出更大 的贡献。
参考内容
有机磷农药（OPPs）是农业生产中广泛使用的一种合成杀虫剂，然而，它的 滥用或不合理使用可能会导致土壤污染。土壤中的有机磷农药对环境和人类健康 构成威胁，因此，研究如何有效降解土壤中的有机磷农药具有重要意义。在这篇 文章中，我们将探讨有机磷农药污染土壤的微生物降解研究进展。
1、物理法
物理法中的热分解和光分解是常见的有机磷农药降解方法。热分解通过加热 将有机磷农药分解成小分子，光分解则利用紫外线、可见光等光源照射有机磷农 药，使其分解成小分子。这两种方法均能有效地降解有机磷农药，但需要较高的 能量输入，且可能产生二次污染。
产脂肪酶菌株的筛选、鉴定以及酶学性质的研究
产脂肪酶菌株的筛选、鉴定以及酶学性质的研究段盈伊;赵淑琴;韩生义;王琨;高兴富【摘要】[Objective] To screen and identify lipase producingstrain,determine the biology activity of the enzyme produced by the strain.[Method] Lipase producing microbial in oil-rich soil were cultured in neutral red oil medium with olive oil as the sole carbon source for initial screening,the improved copper soap-photometric method was used for secondary screening;the species of the lipase producing strain was identified by morphological observation,physiology biochemistry and 16S rDNA sequence analysis;activity of the lipase was determined by improved copper soap-photometric method.Effect of metal ion,organic solvent and surfactant was assayed on activity of lipase [Result] A lipase producing strain was screened,named as LZ-5.16S rDNA sequence analysis indicated that the strain belong to Staphylococcus epidermidis.The activity of lipase produced by the strain was 4.78 U/mL.The optimum pH and temperature of the lipase were 9.0 and 40 ℃.Lipase activity was stimulated byCa2+,Mg2+ and inhibited by Fe2+,Zn2+,EDTA,SDS,methyl alcohol and ethyl alcohol.The lipase showed better tolerance to glycerol,Na+,andK+.[Conclusion] The strain LZ-5 shows a better lipase activity.%[目的] 筛选高产脂肪酶菌株并鉴定其种属,研究脂肪酶的酶学性质.[方法] 以橄榄油为唯一碳源对富含油污土壤中产脂肪酶微生物进行富集培养,用中性红平板进行初筛,结合改进铜皂分光光度计法测定酶活力;对筛选的高产脂肪酶菌株进行形态学观察和相关生理生化实验,再结合16S rDNA序列分析确定其种属;确定该菌株所产脂肪酶的最适作用温度和pH值,并研究金属离子、有机溶剂以及表面活性剂对酶活的影响.[结果] 筛选得到一株高产脂肪酶菌株LZ-5,其所产脂肪酶的酶活力为4.78 U/mL;菌种鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis).该酶最适作用温度为40 ℃,最适pH值为9.0;Ca2+、Mg2+对酶活力有促进作用,Fe2+、Zn2+、EDTA、SDS、甲醇和乙醇对酶活力有抑制作用,对Na+、K+、丙三醇的耐受力较高.[结论] 成功分离一株表皮葡萄球菌高产脂肪酶菌株.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2017(052)002【总页数】7页(P146-151,160)【关键词】脂肪酶;筛选;鉴定;酶学性质【作者】段盈伊;赵淑琴;韩生义;王琨;高兴富【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q93-331脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一类可以在油水界面上高效的将三脂酰甘油酯酯键水解，释放脂肪酸和甘油的生物酶类，广泛存在于动物、植物各种组织及微生物中，是最早研究的酶类之一[1].脂肪酶最早是从动物中发现，1834年Eberl发现了兔胰脂肪酶，1864年发现了猪胰脂肪酶，1871年在植物种子中发现了脂肪酶.微生物脂肪酶直到1901年才被发现，当时的研究人员观察到粘质沙雷氏菌、绿脓假单胞菌及荧光假单胞菌能够产生脂肪酶[2].产脂肪酶微生物种类多、来源广、繁殖周期短，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH和底物特异性，其可以在不需要辅酶的条件下催化酯类化合物的水解、醇解、酸解、酯交换及合成等反应，催化条件温和、能耗低、副产物少，具有高效性、高选择性、环境友好等特点，改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件[3]，比动物、植物脂肪酶具有更高的研究和开发利用价值.许多脂肪酶具有较宽的底物范围，因此它们被认为在进化过程中逐步形成了具备利用碳源的能力或与分解代谢途径有关[4]，这使得脂肪酶成为在许多工业加工过程中具有巨大潜力的生物催化剂，用于化学选择性、区位选择性和对映选择性的水解作用及一系列化合物的合成中，如食品调味料的合成，作为添加剂应用于洗涤剂中，并在造纸业和医药领域等相关行业具有多种工业应用价值，已成为人们普遍选择的生物催化剂之一[5].近年来随着非水酶学的不断深入，脂肪酶的应用已超出了油水界面上进行水解反应的范围，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基因保护、高聚物的合成、肽合成、生物能源的生产等方面，是继蛋白酶，淀粉酶之后上第三大工业用酶[6].目前研究发现，约有65个属的微生物可以产生脂肪酶，细菌28个属，酵母菌10个属，放线菌4个属，其它真菌23个属.微生物脂肪酶的研究主要集中于根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicilliffm)、毛霉属(Mucor)、地霉属(Geotrichum)、假丝酵母属(Candida)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)等具有工业应用价值的菌株[7].但实际上能产生脂肪酶的微生物菌种分布远不止这个数目[8]，对脂肪酶微生物资源的开发与利用，特别是低温、高温、动物肠道等一些极端环境中脂肪酶微生物资源具有重大开发潜力，因此在了解脂肪酶催化特性的基础上，筛选具有活力高、产量高等新特性的产脂肪酶菌种，并在获得产脂肪酶菌株后进一步探索其产酶的最适条件，如培养基的配方[9]、最适温度、最适pH值[10-12]等，可以使脂肪酶的应用范围得到进一步的拓展.1.1 试验材料1.1.1 样品在兰州市区餐馆、加油站周边采集被油脂污染的表层土壤样品20份.用灭菌袋子封存，分别编号LZ-1～20，带回实验室进行分离筛选.1.1.2 培养基富集培养基:蛋白胨1 g，葡萄糖1.5 g，牛肉膏0.5 g，NaCl 0.25 g，蒸馏水加至100 mL，pH值为7.5中性红油脂平板:蛋白胨5 g，牛肉膏2.5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液60 mL，NaCl 2.5 g，MgSO4 0.25 g，琼脂7.5～10 g，1.6%中性红溶液0.5 mL，蒸馏水加至500 mL，pH 7.0～7.5发酵培养基:蛋白胨1 g，酵母粉0.5 g，橄榄油聚乙烯醇乳化液12 mL，NaCl 0.25 g，(NH4)2SO4 0.2 g，k2HPO4 0.1 g，MgS04 0.05 g，蒸馏水加至100 mL，pH值为7.0～7.5.1.1.3 试剂葡萄糖、乳糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、明胶、琼脂、橄榄油、聚乙烯醇、乙醚、95%乙醇、异辛烷及其他无机盐.1.2 试验方法1.2.1 高产脂肪酶菌株的初筛将采集的土样称1 g重悬于10 mL蒸馏水中，充分搅拌使其溶解，静置20 min，吸取上清液1 mL加入有100 mL细菌富集培养基的三角瓶中，32 ℃、180 r/min摇床发酵培养2 d.用灭菌水将富集培养液分别稀释至10-4、10-5、10-6倍，涂布于中性红油脂平板上，32 ℃培养2 d左右.选取有明显红色变色圈或透明圈的菌落作为目的菌株.1.2.2 高产脂肪酶菌株的复筛将初筛出目的菌株转接入发酵培养基，放入摇床，32 ℃、180 r/min培养5 d，使用改进铜皂-分光光度计法测酶活力[13].取试管加入2.5 mL缓冲液和2 mL乳化液在40 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入0.5 mL目的菌株的发酵培养液，继续水浴恒温反应15 min，用1 mL浓盐酸和6 mL 95%的酒精终止反应，再用3 mL异辛烷萃取试管内生成的脂肪酸，将上层清液吸出移至离心管，4 000 r/min离心1 min，使有机相和水相分离澄清.取1 mL 上层清液加入1 mL显色剂和4 mL异辛烷，用分光光度计在714 nm处测D值.空白对照组为先在0.5 mL预热的发酵培养液中加入1 mL浓盐酸和6 mL95%的乙醇，振荡混匀，再将预热的底物-缓冲液加入其中，40 ℃恒温反应15 min，其他后续操作相同.根据酶活计算公式X=(D试验-D对照) ×3/(tV×0.021 )(X为脂肪酶活力U/mL，t为作用时间min,V为酶液用量mL)，计算出酶活力，筛选出酶活力较高的菌株.1.2.3 目的菌株的形态学观察及生理生化试验将分离筛选出的目的菌株接种在LB 平板上，37 ℃培养1～2 d，观察菌落形态，挑取一环细菌材料用压片法进行革兰氏染色，镜检.通过多种糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇)、精氨酸水解试验、明胶液化试验、硝酸盐试验、触酶试验、吲哚试验、淀粉酶试验和柠檬酸盐试验测定其生理生化特性，并参照《伯杰细菌鉴定手册》[14]的相关描述进行鉴定.1.2.4 目的菌株的分子学鉴定本试验采用天根生化科技(北京)有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，首先提取目的菌株的基因组DNA作为模板，再用16S rDNA保守序列的通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)作为引物，进行PCR扩增[15]，扩增条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃再延伸10 min.用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，对 PCR 扩增产物进行胶回收，将回收产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序.将测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对，选取并下载相似性99%以上的序列，用Clustal W将目的序列和已下载的序列进行多序列比对，再用MEGA5.10构建系统发育树.1.2.5 目的菌株最适温度测定取试管加入缓冲液和乳化液分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入目的菌株的发酵培养液，恒温反应15 min，在714 nm处测得D值.计算出酶活力，并以在40 ℃、pH为7条件下测出的酶活为标准酶活计算出相对酶活，确定其最适反应温度.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行F检验.1.2.6 目的菌株最适pH值测定配置柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液，按不同比例配成pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的缓冲液.配置巴比妥钠-盐酸缓冲液，按不同比例配成pH为7.0、8.0的缓冲液.配置碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，按不同比例配成pH为9.0、10.0、11.0的缓冲液.取试管加入不同pH缓冲液和乳化液在40 ℃水浴锅中水浴15 min，再加入目的菌株的发酵培养液，恒温反应15 min，在714 nm处测得OD值.计算出酶活力，并以在40 ℃、pH为7条件下测出的酶活为标准酶活计算出相对酶活，确定其最适反应pH值.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行F检验.1.2.7 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响在有底物和缓冲液的试管中，先加入目的菌株发酵培养液，再分别加入终浓度为2 mmol/L的各种金属离子(Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Zn2+)测定其酶活力，再加入EDTA至最终浓度为2 mmol/L，测定其酶活力.再分别加入各种有机溶剂(甲醇、乙醇和丙三醇)至体积分数5%，测定其酶活力.再加入表面活性剂SDS至体积分数1%，测定其酶活力[16].以不加金属离子、有机溶剂和表面活性剂的菌株发酵培养液为对照组.每个梯度设3个重复.用GraphPad Prism6作图，并用SPSS 20.0对数据进行t检验.2.1 菌株筛选通过初筛，分离筛选出5株在中性红油脂平板有变色圈或透明圈的菌株.再经过复筛测定它们水解甘油三酯的相对酶活力，其中编号为LZ-5菌株的酶活力较高，为4.78 U/ml.该菌株在中性红油脂平板上有明显的透明变色圈(图1).2.2 形态学鉴定菌株LZ-5在培养基上的菌落圆型，凸起，表面光滑或稍呈颗粒状，边缘完整.革兰氏染色后，镜检发现为阳性球菌(图2)，单个、成对排列形成不规则的堆团，染色均匀.2.3 生理生化试验结果生化试验(表1)表明，该菌株发酵葡萄糖，乳糖，麦芽糖产酸不产气，硝酸盐还原试验呈阳性，淀粉酶试验呈阴性，触酶试验呈阳性，吲哚试验呈阴性，能水解精氨酸，能液化明胶,不能利用柠檬酸盐作为碳源.2.4 分子学鉴定LZ-5菌株的16S rDNA测序结果表明其为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis strain，序列登陆号：KU950368)，BLAST比对结果表明与Staphylococcus epidermidis strain (CIFRIH-TSB-12-ZMA),Staphylococcus epidermidis strain M-T-MRS 62位于同一族群，16S rDNA序列相似性99%，系统进化树(图3)也支持了这一结论.2.5 脂肪酶最适温度环境在不同温度条件下测定该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，F检验的结果表明P<0.05，说明温度对相对酶活有显著性影响.发现该酶在30～45 ℃范围内活性较高，最适作用温度为40 ℃(图4).2.6 脂肪酶最适pH环境在不同pH值的缓冲液中测定该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，F检验的结果表明P<0.05，说明pH值对相对酶活有显著性影响.发现pH值为6.0～9.0的范围内酶活性较高，最适pH值为9.0(图5).2.7 金属离子、有机溶剂和表面活性剂对酶活的影响测定金属离子、有机溶剂和表面活性剂对该菌株产脂肪酶的相对酶活.对数据进行分析，t检验的结果表明，Ca2+、Mg2+对酶活有较明显的激活作用；Na+对酶活有微弱的刺激作用；K+对酶活的刺激作用不显著；Fe2+，Zn2+对酶活有抑制作用；EDTA则使脂肪酶基本失活；脂肪酶对甲醇、乙醇耐受力较差，但对丙三醇的耐受力较高，而SDS也使脂肪酶基本失活(图6).初筛菌株选用的是中性红油脂平板，菌落产脂肪酶可利用作为碳源的橄榄油底物生长并且水解其产生脂肪酸，使菌落周围变为酸性环境，中性红指示剂显深红色，从而在菌落周围形成红色透明圈.通过这种方法筛选目的菌株灵敏度高且操作以及观察起来较方便.在以橄榄油为底物的脂肪酶酶活检测方法中，主要是通过检测脂肪酸的生成速度来测定酶活，用铜离子对萃取出的脂肪酸显色测定脂肪酶活力的方法，避免了直接酸碱滴定法中缓冲液的缓冲性和乳液对滴定结果的影响，并在改进方法中采用无毒的异辛烷代替苯萃取乳液中的脂肪酸，由于该方法的测定不受反应体系的缓冲溶液的影响，测得的酶活力曲线更准确.改进的铜皂法具有毒性小、结果稳定、重复性好的优点.最终筛选到的产脂肪酶菌株LZ-5，经形态学观察，生理生化试验，16S rDNA分子鉴定，证实为表皮葡萄球菌.细菌类产脂肪酶的菌属种类较多，主要分为两大类：革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌.革兰氏阳性菌包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、微球菌属等，革兰氏阴性菌包括假单胞菌属、气单胞菌属等.葡萄球菌是人和动物的临床条件致病菌，目前为止，已有来自10种不同葡萄球菌种的13个胞外脂肪酶在基因水平上得到了鉴定，其中3个分离自表皮葡萄球菌，2个分离自金黄色葡萄球菌，各1个分别来自其他葡萄球菌.大多数细菌脂肪酶最适作用温度和pH范围分别为35～45 ℃和8.0～9.0，个别如洋葱伯克霍尔德菌ZYB002最适温度达65 ℃.而葡萄球菌脂肪酶最适pH高达10.0，在30～60 ℃和pH 4.0～10.0之间，具有较好的稳定性，体现其较好的耐碱性.不同细菌脂肪酶底物特异性不同，如Burkholderia cepacia对中短碳链脂肪酸(C8～C12)有特异性，而Staphylococcus epidermidis则对长链脂肪酸(C18：0)有特异性[17].表皮葡萄球菌作为近年来发现的产脂肪酶菌种，为皮肤表面条件性致病菌株来研究较多.筛选出的表皮葡萄球菌在脂肪酶研究方面具有一定的价值.表皮葡萄球菌脂肪酶具有的水解酯类特性使得其能够作为酶添加剂应用于洗涤剂中.酶添加剂相比传统合成洗涤剂，其优势在于酶能够在更广的温度范围下催化油脂的分解，除此之外还减少了对环境的污染[18].而且在造纸业中，在纤维素酶和木质纤维素酶的辅助作用下，用脂肪酶处理纸浆能够去除树脂和蜡等物质，避免纸张严重破裂，不仅减少了处理树脂所需要的化学品的用量，还能够保持纸的质量和产量[19].另外每年由于各种原因排入海中的石油达200万t，如不及时处理，不仅会造成鱼类的大量死亡，而且石油中的有害物质也会通过食物链进人人体.这时用含有脂肪酶及其它成分的复合制剂处理海中的石油，可以将石油降解成适合微生物的营养成分，为浮在油表面的细菌提供优良的养料，使得分解石油的细菌迅速繁殖，以达到快速降解石油的目的.脂肪酶生物技术应用于被污染环境的修复以及废物处理是一个新兴的领域，还需要进一步研究和开发.【相关文献】[1] Qu Yen D T,Sshimdt-Dannert C,Sxhmid R D.High-level expression of a lipase from Bacillus 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产植酸酶菌株的筛选、诱变及酶学性质初探
１ 材 料 与 方 法
１ １ 土 样采 集 ．
成 透 明圈来 初 步判 断 该 微 生 物 是 否产 植 酸酶 ， 有 但 些 产酸 菌株 也 能 降解 植 酸 钙 产 生 透 明 圈 ， 平板 透 故
在 烟 台大 学 校 园 内多 个植 被 丰 富 的环 境 中 ， 除
收 稿 日期 ： ０ ２ ５ ９ ２ １－ － ０ ０
第２ ５卷 第 ４期
２１ ０ ２年 １ ０月
烟 台大 学学 报 （ 自然 科学 与工 程版 ）
Ｊｕ ａ ｏ ａｔ ｎｖｒｉ Ｎ ｔｒ ｃ ｎｅａ ｄＥ ｇ ｅｒ ｇＥ ｉｏ ） ｏｒｌ ｆ ｎａ Ｕ ｉｅ ｔ ｎ Ｙ ｉ ｓ ｙ（ ａ ａ Ｓ ｉ ｃ ｎ ｎｉ ｅｉ ｄｔ ｎ ｕｌ ｅ ｎ ｎ ｉ
染 ， ． 一
酸酶 活性 ， 反应 灵 敏 ， 色稳 定 效 果 很好 ， 显 因此 本 研
究 采 用 了该 方法 ． 通 过对 产植 酸酶 的野 生型 菌种进 行诱 变育种 是 提 高植 酸酶 产量 的一种 有 效 方 法 ． 研 究从 土壤 中 本
筛 选产 植 酸酶 的菌 株 ， 过 紫外 线 与 亚 硝基 胍 复 合 通 诱 变提 高 了产酶 活 力 ， 进一 步 的生 产 研究 打 下 了 为
的维 生素 Ｃ一硫 酸 一钼酸铵 一 石 酸锑 钾法 测定 植 酒
农药降解微生物的筛选和鉴定
农药降解微生物的筛选和鉴定随着农业生产的不断发展和进步，农药的使用逐渐成为了提高农作物产量和品质的重要手段。
然而，长期高强度使用农药也给生态环境和人类健康带来了一定的风险和威胁。
为了减少农药对环境和人体的危害，寻找一种安全、高效的降解方法已经成为了重要的研究方向之一。
而利用微生物进行农药降解成为了一种备受关注的解决途径，因为微生物可以通过吸附、降解、转化等方式将农药降解无害物质，从而实现环境和人健康的保护。
然而，微生物降解效率的高低，直接决定了它在农药降解过程中的应用价值。
因此，寻找适合的微生物进行农药降解，成为了重要的研究点之一。
第一步要做的事情是筛选。
为了寻找适合降解农药的微生物，首先需要从自然界中的土壤、水体等样本中开展微生物的筛选研究。
一般而言，选择样本时要尽量选取与目标农药污染草地有较强的关联性和相似地理位置的样本，以期能够找到更适合的菌种。
在筛选的过程中，应该注意到不同菌种在降解效率、降解速度、生长适应条件、细胞生命等方面存在较大差异。
因此，需要针对目标农药，制定更加具体的微生物鉴定方案，设计合理的实验方案促进筛选工作的开展。
接下来，就要进行种菌和鉴定。
在筛选出适合降解农药的微生物后，需要进行种菌工作，并发展良好的微生物种质资源。
在细菌鉴定过程中，可以通过以形态、生理生化、分子生物学等方法进行鉴定，以期更加准确地判定细菌种类和特征，进一步验证其对农药的降解能力和效率。
比如，针对目标农药的种类与形式不同，可能导致微生物对其降解效率与速度差异较大，因此在进行初步筛选工作的同时，就要进行微生物的鉴定和潜力评价。
最后，就需要量化评价。
针对筛选的适合降解农药的微生物进行量化评价与实验验证，是推动微生物农药降解向工业化、标准化方向的主要应用手段。
在量化评价的过程中，主要包括解析菌株对农药的降解效率、降解速度、降解产物和适应环境等方面的具体表现。
同时，建立科学合理的微生物降解评价标准，对于促进微生物降解的推广应用也有着重要的意义。
有机氮分解菌的驯化筛选及其特性研究的开题报告
有机氮分解菌的驯化筛选及其特性研究的开题报告一、研究背景氮素作为生命活动所必需的元素之一，在土壤生态系统中起着至关重要的作用。
有机氮分解是土壤中一个重要的氮素循环过程，其主要作用是将有机氮转化为无机氮并释放出来，以供植物吸收利用。
其中，有机氮分解菌是参与这一过程的重要微生物群体之一，在土壤环境中的生物转化过程中起到了至关重要的作用。
然而，有机氮分解菌的驯化筛选及其特性研究却是目前国内外研究的重要课题之一。
目前尚无较完整的有机氮分解菌驯化筛选体系，也没有对于有机氮分解菌的种类和特性进行深入的研究。
因此，本研究旨在为有机氮分解菌的驯化筛选及特性研究提供一定的理论与实践基础。
二、研究内容及方法1.研究内容本研究将着重从以下三个方面展开：（1）有机氮分解菌的筛选与驯化优化通过土壤样品的采集、处理和分离培养等方法，利用琼脂平板法、液体培养基发酵法等技术筛选出有机氮分解菌，并通过改变不同环境条件进行驯化与优化，如pH值、温度、碳源、氮源等。
（2）有机氮分解菌的种类鉴定与分类通过分子生物学技术，如16S rDNA序列测定等，鉴定已筛选出的有机氮分解菌的分类属及系统发育地位。
（3）有机氮分解菌的生理生化特性研究对已鉴定到的有机氮分解菌进行生理生化特性的研究，如生长速率、代谢途径、酶活性以及代谢产物等研究。
2.研究方法本研究采用如下方法：（1）土壤样品的采集、处理和分离培养；（2）琼脂平板法、液体培养基发酵法等技术进行有机氮分解菌的筛选与驯化优化；（3）16S rDNA序列测定等分子生物学技术对已筛选出的有机氮分解菌进行分类鉴定；（4）生理生化特性的研究，如生长速率、代谢途径、酶活性以及代谢产物等。
三、研究意义本研究的意义主要体现在以下几个方面：（1）对有机氮分解菌的种类及特性的研究可为土壤中氮素循环过程的进一步研究提供基础，有利于了解土壤的生物地球化学循环机制。
（2）有机氮分解菌的驯化及优化技术可为生产上有机废弃物的处理及再利用提供技术支撑，有利于环境保护与可持续发展。
有机磷农药生物降解研究进展
有机磷农药生物降解研究进展
有机磷农药生物降解研究进展
有机磷农药是目前我国使用量最大的农药,对农业的发展有重要的作用,但同时造成了严重的环境污染.利用微生物或微生物源酶制剂来降解农药是近年来的一个主要努力方向.至今,已经陆续分离到许多有机磷降解菌,并对其相应的降解酶的生化性质进行了鉴定,相关的基因也被克隆、鉴定和改造.另外,基因工程及生物技术方面的进展为开发微生物或酶制品奠定了基础.本文综述了有机磷农药降解菌、降解酶以及有机磷农药生物降解技术等方面的研究现状. 表1 参61
作者：柏文琴何凤琴邱星辉作者单位：中国科学院动物研究所农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080 刊名：应用与环境生物学报ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF APPLIED & ENVIRONMENTAL BIOLOGY 年，卷(期)：2004 10(5) 分类号：X592 关键词：有机磷农药水解酶微生物降解。
多氯联苯降解菌的筛选、菌株性质研究及其活性酶的性质分析的开题报告
多氯联苯降解菌的筛选、菌株性质研究及其活性酶
的性质分析的开题报告
【选题背景】
多氯联苯（PCBs）是一类高毒性、难降解的有机污染物，具有强烈
的环境毒性和对人体健康的危害。
其主要来源为工业化生产工艺中产生
的废弃物、废水和废气，还包括电子产品、润滑油和塑料等。
PCBs几乎
无法通过常规的物理和化学方法完全分解，因此寻找高效降解PCBs的微生物具有重要的意义。
目前，已经发现了一些能够降解PCBs的微生物菌株，但是这些菌株的降解效率低，不能满足实际应用的需要。
【选题目的】
本研究旨在筛选出能够高效降解PCBs的菌株，并对其降解机制、生长条件以及活性酶的性质进行研究，以期开发出一种高效、经济、环保
的降解技术。
【选题内容】
1.筛选PCBs降解菌株：选取土壤、水样等环境样品，通过PCBs的
富集、分离和纯化技术，筛选出能够降解PCBs的菌株。
2.菌株性质研究：对筛选出的菌株进行生物学、生理学和遗传学等
方面的研究，包括菌株的鉴定、形态学特征、生长条件、生长动力学、
代谢产物等方面的分析。
3.降解机制研究：通过对PCBs降解过程和代谢产物的分析，探讨降解机理。
4.活性酶的性质分析：从目标菌株中提取和纯化PCBs降解相关的酶，分析其催化机理、底物特异性、催化能力、稳定性等方面的性质。
【研究意义】
1.寻找高效降解PCBs的微生物菌株，为PCBs的治理提供一种新的途径。
2.深入探究PCBs的降解机理和降解酶的特性，对开发高效的PCBs 降解技术具有重要的理论和应用价值。
3.为建立环境友好型、高效的PCBs降解技术奠定基础。
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从 中提取降解酶的方法 ， 当前 生物学家首先要解决 的重要任 是
们 的身体健康圆 因此 ， 。 当前迫切需 要建立一种用于治理环境污
染、 去除农产 品的农药残 留的有 效方 法 。 目前最有潜 力的有效
液即 方法之一是生物技术的方法： 剁用能够降解农药的微生物桌治 清 粗酶液。
理受农药 污染 的环境 ， 利用农 药降解酶来清 除表面农 药残 留超
１６ 乙酰胆碱酯酶活性测定 ．
富集培养 基 ） ：Ｎａ Ｏ３， Ｃ ０５ Ｃ Ｃ ２． Ｋ Ｐ １ Ｎ ２ Ｋ １．， ａ Ｉ ０ ０ ５， Ｈ２Ｏ４， Ｍｇ Ｏ ・ Ｈ ００５ ｐ ．使用前加入适量 敌敌畏浓缩液。 Ｓ ．７ ： ．，Ｈ７ ， ０ 分离培养 基 ） Ｈ：Ｏ ０５ （ Ｈ， Ｏ ０ ， ｅ Ｏ．．０ ｇ ：Ｋ Ｐ ．．， ） ．． Ｆ Ｓ ００ Ｉ ， Ｎ Ｓ ５ Ｋ ＨＰ ０２ Ｃ Ｃ１０ ０ ， Ｓ Ｈ２ ．， 用前加入 适量 敌 ： Ｏ．．， ａ ’． ５ Ｍｇ Ｏ ７ ０ ０２ 使 ０ 敌畏浓缩 液。 发酵培养基 ） ：蛋 白胨 １ ， ． 酵母 粉 ０５ Ｎ Ｃ Ｉ ， Ｈ ．。 ０ ．， ａ Ｉ． ｐ ７０ ０ １４菌株的富集、 ． 驯化和筛选
维普资讯
２０ ０ ７年 ４月
广 西 轻 工 业
Ｇ Ａ Ｇ Ｉ Ｏ Ｒ Ａ ＦＬ Ｈ Ｄ ＳＲ Ｕ Ｎ Ｘ Ｕ Ｎ ＬＯ Ｉ ＴＩ Ｕ Ｔ Ｙ Ｊ Ｇ Ｎ 食 品 与 生 物
第 ４期（ 总第 １ １ ） ０ 期
产有机磷农 药降解酶菌株 的筛选及酶学性质研究
【 关键词 】敌敌畏； 有机磷农药降解酶； 性质 酶学 【 中图分类号 】 Ｑ３ 【 献标识码 】 Ａ ９３ 文
【 文章编号 】１０—６３ ０７ ４ ０２ — ２ ０３２７（ ０）ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ— ０５ ０ ２ ０
次。 将富集所得 菌液适 当稀释 ， 涂布于分 离平板 ， 观察是否有菌 落生长 ， 选择生长旺盛的菌落进行纯化 。
解决农药残 留所造成的危害问题 提供 生物学基础。
１ 材料 与方 法
１１ 土壤的来源 ．
土壤取 自农药厂的排污水沟和附近的农 田。
１２ 乙酰胆碱醋酶从家蝇头部提取 ． １３培养基 ．
９ ％乙醇终止反应 ， ０ 鲫。计算酶 的抑 制率 ， ５ 测 Ｄ 以农药浓度的
对数为横坐标 、 抑制率为纵坐标作 出标准曲线。
罗永侦 ， 董桂清 ， 余钧池 ， 谢庆武
（ 西大学生命科学与技术学院， 广 广西 南宁 ５ ０ ０ ） ３ ０ ４
【 摘 要】通过用乙 碱酯 酰胆 酶抑制法检测有机磷农药， 壤中 从土 分离筛 能降解敌敌畏的７ 选出 个茵株， 从其中降解能力
较强的茵株 ＯＰ 提取胞 内酶 ， Ｄ７ 并进行酶 学性质 的研 究。结果表明 ， 该酶分解敌敌畏的最适 ｐ 为 ７０ 最适 温度 为 ４ ￣ ｐ 稳定 Ｈ ．， ２ Ｃ，Ｈ 范围为 ６ 。 －８在低 于 ４ ￣ ７Ｃ时稳定 ； 该酶也 能降解 乙酰甲胺磷 、 甲胺磷 、 乐果和氧化乐果。
抑制率的计算 公式为：
Ｉ Ｏ — Ｕ）Ｕ ０ ％ ＝Ｃ ｏ Ｊ ｏＸ１ ０ ／
其中Ｕ ： ｏ 未受抑制 的酶活力 ，
ｕ ：受农药抑制 的酶活力 。 。 １ 有机磷农药降解酶酶活力的测定 ． ８ 取 ４ ０ Ｌ粗 酶 液 ，加 敌敌 畏 至 １ ０ ｇＬ ３ ｏ 反 应 ７￣ ０ ０ｍ ／ ， ７ｃ ３ ｍｉ ，沸水 中加热 ５ ｉ ０ ｎ ａ ｒ ｎ终止 反应 ，然后用酶 抑制法测定农 药残 留。 酶活力单位定义 ：在 ３ ℃， Ｈ７ ７ ｐ ． ０的条件下 ， 每分钟分解 ０１ ． ｇ敌敌畏所需 的酶量 为一个酶活单位（） Ｕ。
１５ 敌敌畏降解酶粗酶液的提取 ．
有机磷农 药（ ｒａ ｏ ｈ ｓ ｈ ｔｓ 简称 ＯＰ ） 有杀虫 效率 ０ ｇｎ ｐ ｏｐ ａｅ ， Ｓ具 高、 防治范围广、 成本低等特点 ， 在保护农作 物免受病虫草害侵
染、 高粮 食产量等方 面发挥 了巨大作 用 ， 大促进 了农 业生 提 大 产【但同时它们也对人类赖 以生存 的环境造成 了严重 的污染 ， ｎ ，
务。 本文 旨在探索一种分离筛选能高效 降解有机磷农药的微生 物 的简单 、 快捷 的方法 ， 同时对有机磷 降解 酶进行初步研究 ， 为
应 ５ ｉ， ｍｎ 加入 ５ ０ Ｌ ９ ％乙醇终止反应 ， Ｏ ６， 酶活 ０ ￣ ５ 测 Ｄ０计算 ，
力。 １ 乙酰胆碱酯酶抑制法检测农药残留 ． ７ 在试 管 中加入 ４ ０ｔ 同浓度 的有 机磷农 药 （ 照管加 ７１ ． 坏 对 ｄ ０）１ ｐ Ｈ２ ， ０ ． Ｌ乙酰胆碱酯酶 ， 混匀 ， ３ ℃水浴 中反应 １ ｒｉ ， 于 ７ ０ ｎ ａ 加入 ２ ｐ ０ ． 酚 乙酸 酯 ，混 匀 ，７ Ｌ靛 ３ ℃反应 ５ ｎ ｍｉ ，加 入 ５ ０ １ ０ ￣
标 的农产品口其前 提是培育 出能高效 降解农药 的菌株 和制备 】 ，
出高效 的农药降解酶 。 了实现用生物学方法来解决农药残 留 为 危害的 目标 ， 建立 一种快速 、 简便 、 成本低 的筛选农 药降解菌并
乙酰胆碱酯酶能分解 靛酚 乙酸酯（ 红色） 为靛 酚（ 色） 乙 蓝 和
酸 ， 的吸收峰在 ６ ５ ｍ， 以可以通过 吸光度变化值来测 靛酚 ０ｎ 所
而且经常导致蔬菜和水果等农产品农药残 留超标 ， 接危害人 直
用发酵培养基 培养菌体 ，离心收集菌体 ，用 ０ ２ ｏ， ， ． ｌＬ ０ｔ ｏ ｐ ７ 的磷酸缓冲液洗涤后再离 心 ， Ｈ． ０ 用适量磷 酸缓冲液悬浮所
得 菌体 ， Ｊ ２ Ｉ 型超 声波细胞粉碎 机破碎 细胞 （ 用 Ｙ９ 一 Ｉ 工作 电压 ２ ０ 工作 时间 １ Ｓ 间隔 时间 １ Ｓ １ ０个循环 ）离心所得上 ２ Ｖ， ０， ５ ，２ ，