最新淋巴细胞发育进展张毓
淋巴细胞信号转导通路匍察
淋巴细胞信号转导通路匍察淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，负责识别和攻击体内的病原体。
为了实现这一功能，淋巴细胞需要通过一系列复杂的信号转导通路来传递和响应外界的信号刺激。
本文将对淋巴细胞信号转导通路进行匍察，以期更好地理解免疫系统中的免疫应答机制。
淋巴细胞信号转导通路通常被分为两条主要的信号通路：T细胞受体（TCR）信号通路和B细胞受体（BCR）信号通路。
这两条通路在淋巴细胞中起着关键的作用，通过激活一系列蛋白质和转录因子来调节细胞的增殖、分化和功能。
在TCR信号通路中，TCR与特定的抗原结合后，会引发一系列的信号传递过程。
首先，TCR与辅助蛋白共受体CD3结合，形成TCR-CD3复合物。
这一复合物激活下游的蛋白酪氨酸激酶Lck，进而磷酸化免疫受体酪氨酸激酶（ITAMs）位于CD3链上的胞内区域。
磷酸化的ITAMs再进一步结合并激活锌指蛋白ZAP70。
激活的ZAP70通过磷酸化下游信号分子，包括LAT、SOS1和PLCγ1等，最终导致细胞内信号的增强和转导。
与TCR信号通路类似，BCR信号通路也经历一系列的信号传递过程。
当BCR与特定抗原结合后，它会形成一个受体聚集簇。
这种聚集簇激活下游的酪氨酸激酶，包括Src家族激酶Lyn，进而磷酸化免疫受体聚集区域的免疫受体酪氨酸激酶（ITAMs）。
ITAMs的磷酸化激活下游的蛋白质，如Syk和Btk，最终促使细胞内的信号转导。
除了TCR和BCR信号通路外，淋巴细胞还可以通过共刺激分子和辅助细胞来调节其信号传递。
共刺激分子，如CD28和CD40，可以与淋巴细胞表面的相应配体结合，从而激活细胞内的信号转导通路。
辅助细胞，如树突状细胞和辅助T细胞，通过细胞间的接触和分泌的细胞因子来激活和调节淋巴细胞的免疫应答。
淋巴细胞信号转导通路的研究已经取得了显著的进展，并为我们理解和治疗多种免疫相关疾病提供了重要的线索。
例如，选择性抑制特定信号通路的药物已经被广泛应用于肿瘤治疗，通过抑制淋巴细胞的增殖和功能来控制肿瘤的发展。
淋巴细胞发育进展张毓
BCR刺激后，未成熟B细胞中 刺激后，未成熟 细胞中 细胞中PIP2水解和 刺激后 水解和 PKCβ活化不充分 β PKCβ持续活化令未成熟B细胞获得凋亡抗性 β持续活化令未成熟 细胞获得凋亡抗性 PKCβ功能阻断使成熟 细胞对凋亡高度敏感 β功能阻断使成熟B细胞对凋亡高度敏感
c-Rel缺陷鼠来源 细胞受BCR刺激后出现凋亡 缺陷鼠来源B细胞受 刺激后出现凋亡 缺陷鼠来源 细胞受 CD40信号挽救 细胞凋亡 信号挽救B细胞凋亡 信号挽救
Double positive
TCR CD4 CD4
TCR
CD4 SP
CD4 RTE
TSC
DN
DP
TCR CD8
TCR
CD8
β-selection
Positive selection
CD8 SP
CD8 RTE
Negative selection
Functional maturation
胸腺T细胞发育过程及主要事件 胸腺 细胞发育过程及主要事件
Aire and Negative selection
自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病-外胚层营养不良 APECED
慢性皮肤粘膜白色念珠菌病 甲状旁腺功能减退 肾上腺功能不全
Autoimmune Regulator (Aire)
Aire缺陷与自身免疫 缺陷与自身免疫
Aire驱动 驱动TSA在髓质区胸腺 驱动 在髓质区胸腺 上皮细胞中表达 OVA-specific TCR/insulin promoter-driven OVA双转 双转 基因鼠模型
Aire作用机制 作用机制
调控TSA表达 表达 调控 促进mTEC凋亡 促进 凋亡
黎衍敏树突状细胞的研究1
鼓励多学科交叉研究，利用其他学科的先进技术和方法，推动黎 衍敏树突状细胞研究的快速发展。
THANKS
感谢观看
，避免不必要的免疫反应。
04
黎衍敏树突状细胞在疾病中的作 用
在自身免疫性疾病中的作用
辅助T细胞分化
树突状细胞能够通过表达特定的 分子，辅助T细胞分化为Th1或 Th2细胞，影响自身免疫性疾病
的发展。
参与炎症反应
树突状细胞在自身免疫性疾病的 炎症反应中发挥重要作用，它们 可以分泌促炎因子，促进炎症的
分类
根据其发育来源和表型，树突状细胞可分为两类：骨髓来源的髓系DCs和淋巴组 织来源的淋巴系DCs。
树突状细胞的功能
01
02
03
抗原呈递
树突状细胞能够摄取并加 工处理抗原，将其呈递给 T细胞，激活适应性免疫 应答。
免疫调节
树突状细胞能够分泌多种 细胞因子和炎症介质，调 节免疫应答的强度和方向 。
诱导免疫耐受
黎衍敏树突状细胞具有抗原提呈作用，能够摄取并加工处理抗原，将抗原信息暴露在细胞表面，供T 细胞识别。
详细描述
在免疫应答中，树突状细胞扮演着关键角色，它们能够高效地摄取和加工处理抗原，将抗原信息暴露 在细胞表面，从而激活T细胞。这种抗原提呈作用是树突状细胞的核心功能之一，有助于触发适应性 免疫应答。
免疫调节作用
其生物学特性。
阐明细胞命运的决定机制
03
解析黎衍敏树突状细胞命运决定的分子机制，为干预其功能提
供理论依据。
探索黎衍敏树突状细胞在疾病治疗中的应用
1 2
开发新的治疗策略
基于对黎衍敏树突状细胞的深入理解，开发新的 治疗策略，为疾病的治疗提供新的思路。
陕西医学杂志
陕西医学杂志期刊征稿：陕西医学陕西医学期刊级别：统计源期刊主管单位：陕西省卫生厅主办单位：陕西省中医药研究院出版地方：陕西快捷分类：医学国际刊号：1000-7377国内刊号：61-1104/R邮发代号：52-40创刊时间：1972陕西医学杂志简介期刊之家医学核心学术期刊杂志社结成了学术联盟，如果您有医学学术论文需要发表到统计源期刊(中国科技核心期刊)、中文核心期刊（北大核心）、南大核心（cssci）或SCI检索收录期刊等需求的作者请及时与我们联系，进行学术期刊选刊与时间安排等相关事务联系杨老师微信LunwenFz《陕西医学》（月刊）创刊于1972年，由陕西省中医药研究院主办。
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2011年基础医学院招收博士生/硕博连读生导师名单
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北京大学医学部基础医学院研究生指导教师
作者：admin文章来源：本站原创点击数：8416 更新时间：2009-2-25
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利用Ｎ 糖苷酶Ｆ 对单克隆抗体Ｎ 糖酶解条件的优化
生物技术进展２０２１年㊀第１１卷㊀第２期㊀２１４~２２２ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１研究论文Ａｒｔｉｃｌｅｓ㊀收稿日期:２０２１￣０１￣１４ꎻ接受日期:２０２１￣０１￣２７㊀基金项目:上海市浦东新区科技发展基金(ＰＫＸ２０１９￣Ｓ０９)ꎮ㊀联系方式:张博慧Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｏｙａｏｚｈｄ＠１６３.ｃｏｍꎻ∗通信作者许俊彦Ｅ￣ｍａｉｌ:ｊｕｎｙａｎ.ｘｕ＠ｄｒａｇｏｎｂｏａｔｂｉｏ.ｃｏｍ利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化张博慧ꎬ㊀贾戴辉ꎬ㊀程倩ꎬ㊀许俊彦∗ꎬ㊀邵喆ꎬ㊀黄应峰宝船生物医药科技(上海)有限公司药物分析部门ꎬ上海２０１２０３摘㊀要:为了优化利用Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)酶解单克隆抗体中Ｎ糖的方法ꎬ应用本公司生产的单抗对ＰＮＧａｓｅＦ酶的酶解条件进行优化ꎬ包括缓冲液ｐＨ㊁酶种类㊁仪器㊁酶解程度㊁变性缓冲液及酶加入量等ꎬ总结酶解条件对Ｎ糖谱结果的影响ꎮ结果显示ꎬ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中可以避免某些单抗在低ｐＨ酶解时Ｇ０Ｆ转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ并可改善峰型ꎻ快速ＰＮＧａｓｅＦ和加入变性缓冲液能有效提高酶解效率ꎻＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径色谱柱能提高分离度ꎻ不完全酶解影响Ｎ糖含量结果ꎮ研究结果表明ꎬ采用优化的酶解条件可快速㊁有效的酶解单抗上的Ｎ糖ꎬ使Ｎ糖谱结果准确可靠ꎬ为细胞株筛选和单抗药物质量控制提供有效手段ꎮ关键词:单克隆抗体ꎻＮ糖ꎻＰＮＧａｓｅＦ酶ＤＯＩ:１０.１９５８６/ｊ.２０９５￣２３４１.２０２１.０００５中图分类号:Ｑ８１９ꎬＲ９７㊀㊀㊀文献标识码:ＡＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙＰＮＧａｓｅＦ㊀ＺＨＡＮＧＢｏｈｕｉꎬＪＩＡＤａｉｈｕｉꎬＣＨＥＮＧＱｉａｎꎬＸＵＪｕｎｙａｎ∗ꎬＳＨＡＯＺｈｅꎬＨＵＡＮＧＹｉｎｇｆｅｎｇＤｒｕｇＡｎａｌｙｓｉｓＤｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬＤｒａｇｏｎｂｏａｔＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ.ꎬＬｔｄꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１２０３ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｖｅｌｏｐａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅａｍｅｔｈｏｄｏｆｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｂｙｕｓｉｎｇＰＮＧａｓｅＦꎬａｓｅｒｉｅｓｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒｐＨꎬｅｎｚｙｍｅｔｙｐｅꎬｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓꎬｄｅｇｒｅｅｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓꎬｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｂｕｆｆｅｒｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｏｓａｇｅｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｕｓｉｎｇｓｅｖｅｒａｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬｂｕｆｆｅｒｅｘｃｈａｎｇｉｎｇｉｎｔｏ１ˑＰＢＳｃｏｕｌｄａｖｏｉｄｔｈｅｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｓｏｍｅｍＡｂｓｆｒｏｍＧ０ＦｔｏＧ０Ｆ￣ＧＮａｔｌｏｗｐＨａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｐｅａｋｓｈａｐｅ.ＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｂｕｆｆｅｒｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ.ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＵＰＬＣａｎｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｌｕｍｎｗｉｔｈ１.７μｍｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ.ＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｕｌｄａｆｆｅｃｔｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔ.ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＮＧａｓｅＦｃａｎｑｕｉｃｋｌｙａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｈｙｄｒｏｌｙｚｅｔｈｅＮ￣ｇｌｙｃａｎｆｒｏｍｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬｗｈｉｃｈｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇＮ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｄｒｕｇｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎻＮ￣ｇｌｙｃａｎꎻｐｅｐｔｉｄｅＮｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊀㊀Ｎ糖基化修饰是单克隆抗体药物普遍存在的翻译后修饰现象ꎮ目前研究表明ꎬ糖基化修饰与单克隆抗体药物的功能㊁药物代谢㊁免疫原性等关系密切[１￣３]ꎬ如核心岩藻糖缺失能显著增强ＡＤＣＣ效应[４]ꎬ半乳糖能够增强ＣＤＣ活性[５]ꎻ末端Ｎ￣乙酰葡萄糖影响抗体药物半衰期[６￣７]ꎻ唾液酸化糖型具有抗炎症功能[８]ꎻα(１￣３)半乳糖和ＮＧＮＡ型唾液酸易引起免疫原性[９]等ꎮＮ糖对抗体结构也具有重要作用ꎬ能稳定ＣＨ２结构域ꎬ去糖抗体稳定性会变差ꎬ更易发生去折叠和聚集[１０]ꎮＮ糖类型和含量受细胞株㊁培养条件㊁纯化和储存[１１￣１３]等过程的影响ꎬ因此在单抗药物细胞筛选㊁工艺优化㊁纯化㊁产品放行和稳定性考察中控制和监测Ｎ糖含量ꎬ保证单抗药物安全性㊁有效性等尤为重要ꎮ目前检测Ｎ糖的方法主要有亲水色谱－荧光法[１４]㊁ＣＥ￣ＬＩＦ法[１５￣１６]和质谱法[１７￣１８]. All Rights Reserved.等ꎮ其中亲水色谱－荧光法是目前应用最为广泛的方法ꎬ该方法通常需要用糖苷酶水解糖蛋白上的Ｎ糖链ꎬ再用标记试剂进行衍生化ꎬ采用亲水色谱柱分离ꎬ荧光检测器检测ꎮ由于ＰＮＧａｓｅＦ几乎能水解所有哺乳动物细胞产生的Ｎ糖ꎬ因此得到广泛应用[１９]ꎮ传统的Ｎ糖谱检测方法一般耗时较长ꎬ目前快速Ｎ糖样品制备的试剂盒已经商品化ꎬ大幅提高了Ｎ糖的检测效率ꎬ但是通常价格昂贵ꎮ而应用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶与传统制备过程相组合成为提高检测效率和降低检测成本的一种选择ꎮ本研究基于亲水色谱－荧光法ꎬ针对ＰＮＧａｓｅＦ水解条件进行了优化ꎬ发现和解决了酶解过程中易对结果产生影响的一些因素ꎬ建立了高效准确的Ｎ糖检测方法ꎬ以期为Ｎ糖的检测研究提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料１.１.１㊀供试品㊀本研究所用ｍＡｂ１㊁ｍＡｂ２和ｍＡｂ２￣Ｆ均为宝船生物医药科技(上海)有限公司生产的ＩｇＧ１型单克隆抗体ꎮ１.１.２㊀试剂和耗材㊀Ｎ糖苷酶Ｆ(ＰＮＧａｓｅＦ)㊁快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)及变性缓冲液(５ˑ)均购自ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ公司ꎻ无水乙醇㊁甲酸铵㊁乙酸㊁二甲基亚砜(ＤＭＳＯ)㊁２￣氨基苯甲酰胺(２￣ＡＢ)㊁氰基硼氢化钠㊁β￣巯基乙醇等均购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ甲酸和乙腈购自Ｆｉｓｈｅｒ公司ꎻＰＢＳＢｕｆｆｅｒ(１ˑ)购自上海生工ꎻ１０ｋＤ超滤离心管购自Ｍｅｒｃｋ公司ꎻ１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液和非涂层－熔融石英毛细管购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ纯化柱(ＧｌｙｃｏＣｌｅａｎＴＭＳＣａｒｔｒｉｄｇｅｓ)购自Ｐｒｏｚｙｍｅ公司ꎻ色谱柱ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ(１.７μｍꎬ２.１ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ色谱柱ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎ(２.７μｍꎬ４.６ｍｍˑ１５０ｍｍ)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎮ１.１.３㊀主要仪器设备㊀高效液相系统(ＨＰＬＣꎬ１２６０)购自Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻ超高效液相系统(ＵＰＬＣꎬＨ￣ＣｌａｓｓＰｌｕｓ)购自美国Ｗａｔｅｒｓ公司ꎻ液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)和数据处理软件(ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒ)均购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司ꎻ毛细管电泳仪(ＣＥꎬＰＡ８００Ｐｌｕｓ)购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻ真空离心浓缩干燥仪(ＲＶＣ２￣２５)购自德国Ｃｈｒｉｓｔ公司ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀蛋白沉淀和Ｎ糖衍生化㊀向酶解后的样品中加入３倍体积的冰乙醇ꎬ－１５~－２５ħ放置约１ｈꎬ高速离心１０ｍｉｎꎬ取上清干燥ꎮ加入１０μＬ２￣ＡＢ衍生化试剂ꎬ６５ħ避光孵育３ｈꎮ用纯化柱纯化后干燥ꎬ５０％乙腈复溶ꎬ准备上机分析ꎮ１.２.２㊀ＨＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用高效液相系统(Ａｇｉｌｅｎｔꎬ１２６０)ꎻ色谱柱采用ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏＧｌｙｃａｎＭａｐｐｉｎｇＣｏｌｕｍｎꎻ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎻ进样量２μＬꎻ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎻ荧光检测器激发波长２６０ｎｍꎬ发射波长４３０ｎｍꎻ色谱柱温度５５ħꎻ梯度洗脱ꎮ１.２.３㊀ＵＰＬＣ色谱条件㊀仪器采用超高效液相系统(ＷａｔｅｒｓꎬＨ￣ｃｌａｓｓｐｌｕｓ)ꎬ色谱柱采用ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎꎮ流动相Ａ为１００ｍｍｏｌ Ｌ－１甲酸铵(ｐＨ４.５)ꎬ流动相Ｂ为１００％乙腈ꎬ进样量２μＬꎬ流速０.５ｍＬ ｍｉｎ－１ꎬ荧光检测器激发波长３３０ｎｍꎬ发射波长４２０ｎｍꎬ色谱柱温度６０ħꎬ梯度洗脱ꎮ１.２.４㊀质谱参数㊀应用液质联用系统(ＬＣ￣ＭＳꎬＱＥｘａｃｔｉｖｅ)的ＨＥＳＩ正离子模式(ＨＥＳＩ＋)ꎬ离子源的温度和电压分别为３２０ħ和３.８ｋＶꎬ离子传输管温度为２００ħꎬ其他仪器参数设置均经过优化以获得最佳信号响应ꎻ母离子扫描范围７００~３０００ｍ ｚ－１ꎬ分离度１５０００ꎬ分析时长６０ｍｉｎꎻ数据处理软件采用ＢｉｏｐｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒꎮ１.２.５㊀还原毛细管凝胶电泳(ＲＣＥ￣ＳＤＳ)㊀将蛋白沉淀用１００ｍｍｏｌ Ｌ－１Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(含１％ＳＤＳꎬｐＨ９.０)溶液复溶ꎬ加入β￣巯基乙醇还原ꎮ仪器采用毛细管电泳仪(ＢｅｃｋｍａｎꎬＰＡ８００ｐｌｕｓ)ꎬ毛细管采用非涂层－熔融石英毛细管ꎬＰＤＡ检测器ꎬ波长２２０ｎｍꎬ电动进样(－５ｋＶ)２０ｓꎬ电压分离(－１５ｋＶ)４０ｍｉｎꎮ２㊀结果与分析２.１㊀缓冲液ｐＨ对结果的影响分别将ｍＡｂ１和ｍＡｂ２样品调ｐＨ至４㊁５㊁６和７ꎬ取２００μｇ进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ检测Ｎ糖含量ꎮ实验结果如表１和图１所示ꎬｍＡｂ２在不５１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.同ｐＨ缓冲液酶解的Ｎ糖含量高度一致ꎬ说明ｐＨ对该样品Ｎ糖水解无影响ꎻ而ｍＡｂ１中Ｎ糖含量随ｐＨ的变化出现明显差异ꎬ其中缓冲液ｐＨ为４时ꎬ峰２(ｐ２)含量出现大幅度升高ꎬ相应的峰３(ｐ３)含量明显下降ꎬｐＨ６和７条件下Ｎ糖含量基本一致ꎮ表１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ样品名称ｐＨＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４ｍＡｂ２４/７.４４６.０５.３２４.１８.２４.８５/７.６４５.８５.４２３.９８.２４.８６/７.６４５.７５.４２４.０８.２４.９７/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９图１㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在不同ｐＨ缓冲液中酶解的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.１㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ６１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.㊀㊀将ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解后的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ结果(图２)显示含Ｎ糖重链(ＨＣ)基本已被酶解成非糖基化重链(ＮＧＨＣ)ꎬ说明不同ｐＨ缓冲液下ＰＮＧａｓｅＦ酶解Ｎ糖２４ｈ后均酶解完全ꎬＮ糖含量的变化并非不完全酶解造成ꎮ利用液质联用鉴定各Ｎ糖的种类ꎬｐ２和ｐ３分别为Ｇ０Ｆ￣ＧＮ(Ａ１Ｆ)和Ｇ０Ｆ(Ａ２Ｆ)ꎮ通过比较不同时间(１㊁８和２４ｈ)酶解结果(表２)ꎬ发现缓冲液ｐＨ为４和５时ꎬｐ２和ｐ３含量的变化随着酶解时间的增加而呈梯度变化ꎬｐＨ４时尤为明显ꎻｐＨ为６和７时ꎬ变化不明显ꎮ因此推测在某些单抗分子上ꎬＧ０Ｆ上的Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖在低ｐＨ条件下易从Ｎ糖链上脱落ꎬ使Ｇ０Ｆ形成Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ从而引起Ｇ０Ｆ￣ＧＮ和Ｇ０Ｆ含量的变化ꎮ因此在进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解时ꎬ应避免酶解体系中ｐＨ过低ꎮ图２㊀ｍＡｂ１不同ｐＨ酶解蛋白ＲＣＥ￣ＳＤＳ电泳图Ｆｉｇ.２㊀ＲｅｄｕｃｅｄＣＥ￣ＳＤＳｏｆｄｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒ表２㊀ｍＡｂ１在不同ｐＨ缓冲液中酶解不同时间的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ２㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐＨｂｕｆｆｅｒａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｓｐＨ时间/ｈＮ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７Ｍａｎ４Ｇ０Ｆ￣ＧＮＧ０ＦＭａｎ５Ｇ１ＦａＧ１ＦｂＧ２Ｆ４１９.３１.０７０.７８.０４.５１.９０.８８３.４７.３７３.０５.８４.３２.００.４２４２.０２３.４５７.６６.２３.４１.６０.４５１４.５０.８７８.６６.０４.６２.２０.４８３.８２.３７８.５５.２４.４２.３０.４２４３.７４.２７６.６５.１４.２２.２０.４６１４.５０.７７９.１５.７４.５２.２０.４８３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３２４３.９１.３７９.８４.８４.３２.２０.４７１４.４０.７７９.７５.４４.５２.２０.４８３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３２４３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４７１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.２.２㊀置换缓冲液的选择为避免样品缓冲液ｐＨ及成分对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响ꎬ用超滤离心管将样品换液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎮ本研究选择了１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)和超纯水分别置换ｍＡｂ１和ｍＡｂ２的样品缓冲液ꎬ以未置换缓冲液(ｐＨ７)为对照ꎬＰＮＧａｓｅＦ酶解２４ｈꎬ进行Ｎ糖谱检测ꎮＮ糖色谱图和含量分别见表３和图３ꎬ结果表明１ˑＰＢＳ溶液㊁超纯水和样品缓冲液(ｐＨ７)的Ｎ糖谱结果一致ꎮ因为蛋白在超纯水中稳定性较差ꎬ所以本研究选用１ˑＰＢＳ溶液(ｐＨ７.４)置换样品的缓冲液ꎮ表３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ样品名称缓冲液Ｎ糖含量/％ｐ１ｐ２ｐ３ｐ４ｐ５ｐ６ｐ７ｍＡｂ１样品缓冲液(ｐＨ７)３.９１.０８０.２４.７４.４２.３０.４１ˑＰＢＳ３.９０.８８０.４４.８４.４２.４０.３超纯水３.９１.０８０.４４.９４.４２.４０.３ｍＡｂ２样品缓冲液(ｐＨ７)/７.４４５.７５.４２４.０８.２４.９１ˑＰＢＳ/７.６４５.９５.４２４.０８.２４.８超纯水/７.７４５.８５.４２４.０８.２４.８图３㊀ｍＡｂ１和ｍＡｂ２在样品缓冲液㊁１ˑＰＢＳ和超纯水中的Ｎ糖色谱图Ｆｉｇ.３㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ１ａｎｄｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｉｎｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒꎬ１ˑＰＢＳａｎｄｗａｔｅｒ２.３㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ酶对Ｎ糖结果的影响直接取２００μｇ样品ꎬ分别加入快速ＰＮＧａｓｅＦ酶(ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ)和ＰＮＧａｓｅＦ进行酶解ꎬＮ糖谱如图４所示ꎮ结果显示用ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ进行酶解时ꎬ若选择用ＵＰＬＣ和１.７μｍ粒径的ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ则由于分离度的提高ꎬｍＡｂ２的Ｎ糖色谱图(图４Ｂ)中Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ出现肩峰ꎬ而ＨＰＬＣ结果８１２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.Ａ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＨＰＬＣ检测ꎻＢ:ｍＡｂ２未置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎻＣ:ｍＡｂ２置换缓冲液ＵＰＬＣ检测ꎮ图４㊀不同ＰＮＧａｓｅＦ的Ｎ糖谱结果Ｆｉｇ.４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔＰＮＧａｓｅＦ(图４Ａ)由于分离度较差ꎬ此峰未得到有效分离ꎮ当将ｍＡｂ２样品缓冲液置换至１ˑＰＢＳ中时(图４Ｃ)ꎬ该肩峰消失ꎮ综合２.１~２.３部分的研究结果可知ꎬ将样品置换缓冲液至合适的溶液中再进行ＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ对改善Ｎ糖谱峰形和结果准确度至关重要ꎬ本研究采用了１ˑＰＢＳ溶液ꎬ效果良好ꎮ另外ꎬ在置换缓冲液的基础上使用快速ＰＮＧａｓｅＦ能将酶解时间缩短为数十分钟ꎬ有效提高了检测效率ꎮ选择ＵＰＬＣ能有效提高分辨率ꎮ２.４㊀蛋白变性对酶解效率的影响本研究发现ꎬ在非变性条件下利用快速ＰＮＧａｓｅＦ酶解不同单抗所需酶解时间差异明显ꎬ从数分钟至数小时不等ꎮ为了有效提高酶解效率ꎬ选择所需酶解时间最长的ｍＡｂ２￣Ｆ置换缓冲液至１ˑＰＢＳ中ꎬ加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎ后进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以未加变性缓冲液(５ˑ)样品为对照ꎮ由图５还原ＣＥ￣ＳＤＳ结果可知ꎬ相同的酶解时间条件下ꎬ蛋白变性后由于高级结构被破坏ꎬＮ糖充分暴露与酶接触ꎬ所以其酶解效果更好ꎮ２.５㊀酶解程度对Ｎ糖结果的影响在非变性条件下加入不同体积的ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶对ｍＡｂ２￣Ｆ进行Ｎ糖谱检测处理ꎬ将沉淀的蛋白进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ以加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶的样品为对照ꎬ酶解条件均选择５０ħ㊁１０ｍｉｎꎮ由图６(左)９１２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.可知ꎬ在非变性条件下酶解相同时间ꎬ酶量的增加使非糖基化组分增多ꎬ但酶量增加至２μＬ时酶解效果仍较差ꎬ而变性条件下用１μＬｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ꎬ糖基化组分基本被转换成非糖基化组分ꎮＮ糖水解的程度不同ꎬＮ糖含量(表４)明显成梯度变化ꎬ说明ＰＮＧａｓｅＦ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ图５㊀ｍＡｂ２￣Ｆ在变性和非变性条件下切糖后还原ＣＥ￣ＳＤＳ图谱Ｆｉｇ.５㊀ＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣Ｆｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｉｎｎａｔｕｒｅａｎｄｄｅｎａｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ表４㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的Ｎ糖含量Ｔａｂｌｅ４㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ/μＬＮ糖含量/％Ｇ０Ｍａｎ５Ｇ１ａＧ１ｂＧ２０.５４３.４１８.４１８.４５.５２.６１.０４８.０１２.９２０.１６.４２.９２.０５４.５７.９２１.２７.３３.１１＋变性５５.２７.５２０.０８.０３.１３㊀讨论Ｎ糖检测结果的准确性受多种因素的影响ꎮ在缓冲液ｐＨ对ＰＮＧａｓｅＦ酶解的影响研究中发现ꎬ低ｐＨ能使某些单抗在酶解过程中Ｇ０Ｆ逐渐转化为Ｇ０Ｆ￣ＧＮꎬ造成检测结果的严重偏差ꎬ这种情况通常出现在ＰｒｏｔｅｉｎＡ亲和纯化后的样本ꎬ在低ｐＨ洗脱后直接进行酶解ꎬ若先将样品缓冲液ｐＨ调至中性或进行换液处理ꎬ能够避免ｐＨ的影响ꎮ对照ｍＡｂ２置换和未置换样品缓冲液酶解结果ꎬ置换缓冲液能有效消除Ｇ０Ｆ和Ｇ１Ｆａ的肩峰ꎬ消除样品缓冲液成分对检测结果的影响ꎮ另外ꎬ本研究对多种单抗的研究发现ꎬ酶解程度不同的Ｎ糖检测结果存在明显差异ꎬ说明Ｎ糖苷酶Ｆ对不同类型的Ｎ糖水解效率不同ꎬ这与已有文献报道[２０]一致ꎮ因此为了获得样品中真实的Ｎ糖含量水平ꎬ应将Ｎ糖尽量酶解完全ꎮ酶解程度可采用将蛋白沉淀进行还原ＣＥ￣ＳＤＳ检测ꎬ观察非糖基化组分含量的变化情况ꎮ在细胞株筛选和工艺优化阶段ꎬ快速㊁准确的Ｎ糖检测结果能够有效推进开发进度ꎬ而该阶段０２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.图６㊀不同体积ｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶解ｍＡｂ２￣Ｆ的ＲＣＥ￣ＳＤＳ和Ｎ糖谱图Ｆｉｇ.６㊀Ｎ￣ｇｌｙｃａｎａｎｄＲＣＥ￣ＳＤＳｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｍＡｂ２￣ＦｄｅｇｌｙｃａｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦａｍｏｕｎｔ巨大的样本量又对成本控制提出更高的要求ꎬ因此建立一种高效㊁准确且低成本的Ｎ糖检测方法尤为重要ꎮ本研究确定了较为通用的ＰＮＧａｓｅＦ酶对单克隆抗体的酶解条件ꎬ即为将样品置换缓冲液至１ˑＰＢＳꎬ取适量样品加入变性缓冲液(５ˑ)和１μＬＲａｐｉｄＰＮＧａｓｅＦ酶ꎬ５０ħ孵育１０ｍｉｎꎬ进行后续除蛋白㊁干燥等处理ꎬ快速ＰＮＧａｓｅＦ酶和变性处理的应用ꎬ将酶解时间大幅缩短ꎬ提高了检测效率ꎻ同时采用传统的ＵＰＬＣ和ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＧｌｙｃａｎＢＥＨＡｍｉｄｅＣｏｌｕｍｎ色谱柱ꎬ有效提高了分离度ꎬ并控制了检测成本ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＦＲＩＥＳＳＷꎬＳＥＩＤＬＡꎬＳＯＥＲＧＥＬＦꎬｅｔａｌ..Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｈａｒ￣ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２０１６ꎬ１００:９４－１００. [２]㊀刘晓宇.单克隆抗体糖基化修饰的研究现状和进展[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０２０ꎬ３３(２):２１６－２２１. [３]㊀ＬＩＵＬ.Ａｎｔｉｂｏｄｙｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｉｍｐａｃｔｏｎｔｈｅｐｈａｒｍａｃｏ￣ｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＦｃ￣ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｓｃｉ.ꎬ２０１５ꎬ１０４(６):１８６６－１８８４.[４]㊀ＳＨＩＥＬＤＳＲＬꎬＬＡＩＪꎬＫＥＣＫＲꎬｅｔａｌ..Ｌａｃｋｏｆｆｕｃｏｓｅｏｎｈｕ￣ｍａｎＩｇＧ１Ｎ￣ｌｉｎｋｅｄｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｍｐｒｏｖｅｓｂｉｎｄｉｎｇｔｏｈｕｍａｎＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｔｏｘｉｃｉｔｙ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００２ꎬ２７７:２６７３３－２６７４０.[５]㊀ＢＯＹＤＰＮꎬＬＩＮＥＳＡＣꎬＰＡＴＥＬＡＫ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｒｅ￣ｍｏｖａｌｏｆｓｉａｌｉｃａｃｉｄꎬｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄｔｏｔａｌｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣａｍｐａｔｈ￣１Ｈ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.ꎬ１９９５ꎬ３２:１３１１－１３１８.[６]㊀ＪＯＮＥＳＡＪꎬＰＡＰＡＣＤＩꎬＣＨＩＮＥＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｌｅａｒ￣１２２张博慧ꎬ等:利用Ｎ糖苷酶Ｆ对单克隆抗体Ｎ糖酶解条件的优化. All Rights Reserved.ａｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｃａｕｓｅｄｂｙｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｍｏｎｋｅｙｓ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００７ꎬ１７:５２９－５４０.[７]㊀ＫＥＣＫＲꎬＮＡＹＡＫＮꎬＬＥＲＮＥＲＬꎬｅｔａｌ..ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｍｐｌｅｘｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｗｈｏｓｅｖａｒｉａｂｌｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｃｌｅａｒａｎｃｅｉｎｈｕｍａｎｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｔｅｒｍｉｎａｌＮ￣ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔ[Ｊ].Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓꎬ２００８ꎬ３６:４９－６０.[８]㊀ＮＩＭＭＥＲＪＡＨＮＦꎬＲＡＶＥＴＣＨＪＶ.Ｔｈｅａｎｔｉ￣ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｃ￣ｔｉｖｉｔｙｏｆＩｇＧ:ｔｈｅｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓＩｇＧｐａｒａｄｏｘ[Ｊ].Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.ꎬ２００７ꎬ２０４:１１－１５.[９]㊀王冲ꎬ郭怀祖.不同细胞系表达的抗ＥＧＦＲ单抗糖基化结构对比分析[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１７ꎬ３３(６):１０１８－１０２７. [１０]㊀ＺＨＥＮＧＫꎬＢＡＮＴＯＧＣꎬＢＡＹＥＲＲ.Ｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａ￣ｔｉｏｎｏｎｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ].ＭＡｂｓꎬ２０１１ꎬ３:５６８－５７６.[１１]㊀ＫＩＬＤＥＧＡＡＲＤＨＦꎬＦＡＮＹＺꎬＳＥＮＪＷꎬｅｔａｌ..Ｇｌｙｃｏｐｒｏｆｉｌ￣ｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉａａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎＩｇＧｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＣＨＯｃｅｌｌｓｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇｉｎ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(２):３５９－３６６.[１２]㊀ＢＥＮＪＡＭＩＮＤꎬＮＥＨＡＭꎬＭＩＣＨＡＥＬＢ.Ａｌｏｗｒｅｄｏｘｐｏｔｅｎｔｉａｌａｆｆｅｃｔｓｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１７ꎬ２４６:７１－８０.[１３]㊀ＳＴＥＦＡＮＦꎬＪＯＥＲＧＨꎬＨＡＮＮＳ￣ＣＨＲＩＳＴＩＡＮＭ.Ｇｌｙｃａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｓｔｏｒａｇｅａｎｄａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｍｕ￣ｌａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｅｕｒ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.Ｂｉｏｐｈａｒｍ.ꎬ２００８ꎬ７０:４２－５０. [１４]㊀丛宇婷ꎬ胡良海.单克隆抗体药物糖基化修饰分析研究进展[Ｊ].色谱ꎬ２０１６ꎬ３４(１２):１１８６－１１９１.[１５]㊀ＭＥＬＩＳＳＡＨꎬＹＡＮＧＷꎬＲＩＣＨＡＲＤＲ.ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｉｎａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎＮＳ０ｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｌａｓｅｒ￣ｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓ￣ｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓꎬ２０１３ꎬ６:３９３－４０６. [１６]㊀ＧＥＮＮＡＲＯＬＡꎬＳＡＬＡＳ￣ＳＯＬＡＮＯＯ.Ｏｎ￣ｌｉｎｅＣＥ￣ＬＩＦ￣ＭＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｄｉｒｅｃｔｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ[Ｊ].Ａｎａｌｙｔ.Ｃｈｅｍ.ꎬ２００８ꎬ８０:３８３８－３８４５.[１７]㊀李媛ꎬ邱建华ꎬ陈家琪ꎬ等.液相色谱－质谱技术对利妥昔单抗及其类似药结构表征和相似性的研究[Ｊ].国际生物制品学杂志ꎬ２０１６ꎬ３９(３):１１６－１２１.[１８]㊀ＣＨＥＮＸꎬＦＬＹＮＮＧＣ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｓｆｒｏｍｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧｂｙｏｎ￣ｌｉｎｅｒｅｖｅｒｓｅｄ￣ｐｈａｓｅｈｉｇｈ￣ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ/ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].Ａｎ￣ａｌｙｔ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.ꎬ２００７ꎬ３７０:１４７－１６１.[１９]㊀ＴＡＲＥＮＴＩＮＯＡＬꎬＧÓＭＥＺＣＭꎬＰＬＵＭＭＥＲＴＨＪ.Ｄｅｇｌｙｃｏ￣ｓｙｌａｔｉｏｎｏｆａｓｐａｒａｇｉｎｅ￣ｌｉｎｋｅｄｇｌｙｃａｎｓｂｙｐｅｐｔｉｄｅ:Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９８５ꎬ２４:４６６５－４６７１.[２０]㊀ＨＵＡＮＧＹＮꎬＲＯＮＯ.ＫｉｎｅｔｉｃｓｏｆＮ￣ｇｌｙｃａｎｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ(ＩｇＧ)ｂｙＰＮＧａｓｅＦ:ａｌｌｇｌｙｃａｎｓａｒｅｎｏｔｃｒｅａｔｅｄｅｑｕａｌ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ.Ｔｅｃｈｎ.ꎬ２０１７ꎬ２８:１５０－１５７.２２２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.。
【doc】浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备
浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备2008年第2期6月出版食品工程F00DENGINEERINC浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备Onthepreparationofchromosomeofperipheralbloodlymphocyteofhumanbody董烁谢振兴(河南大学医学院,开封475004)DONGShuo'XIEZhen—xing(MedicalSchool,HenanUniversity,Kaifeng475004,China)摘要染色体制备技术是医学遗传学中最常见而重要的一种技术,由于各个实验室实验条件和个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的制作方法也不尽相同.笔者就人体外周血淋巴细胞染色体的制片过程中容易出现的问题及近几年制作染色体标本总结的经验和实验方法改进进行探讨,并提出了有效的避免方法.关键词染色体;染色体制备技术;外周血;细胞培养AbstractThepreparationofchromosomeisafrequent andanimportanttechniqueinmedicalgenetics.Some problemsexistedinexperimentwereanalysed.Improvingoftheexperiments,experiencesandprecautionsduring thepreparationofchromosomeofperipheralbloodlym—phocyteofhumanbodytheseyearswerethoroughlydis-cussed.Someeffectivemethodshavebeengiveninthispaper?keywordschromosome;preparationofchromo—some;peripheralblood;cellculture染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体,他由DNA和蛋白质构成,具有储存和传递遗传信息的作用.人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体.生物体细胞染色体数目和结构是重要的遗传标志之一,特别是在真核细胞中.因此深入认识染色体的结构和功能,对生物的遗传,变异和进化以及细胞的增殖,个体的发生和生殖过程的平衡控制都具有十分重要的意义.每个物种的细胞都具有一定的数目,形态,大小的染色体特征,称为染色体董烁,女,1976年出生,1999年毕业于河南师范大学,生物教育专业,助教.收稿日期:2008—03—19组型,各种染色体技术已广泛应用于核型,鉴别变异,体细胞杂交分析和绘制基因图等方面,因此在染色体的分析研究中,制备染色体标本无疑是细胞遗传学最基本而重要的技术,而优良的染色体制片是其他技术的先决条件.正常情况下,人外周血中是没有分裂相细胞的,只有在异常隋况下才能发现.外周血淋巴细胞一般隋况下处于增殖期中的GO(GD期,未经培养的外周血中很难找到正在分裂的淋巴细胞.植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,能使处于GO期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂.利用PHA这一特性,淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,再用秋水仙素处理,即可获得终止于分裂中期的淋巴细胞, 进而得到所需的人体染色体图片.加之,淋巴细胞遍及全身,并在所有器官组织中不断循环,能反映个体整体水平情况而不象体细胞那样具有局部性.1细胞培养1.1无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件,也是实验成功与否的先决条件.收获细胞前的所有步骤都要保持高度的无菌,严防细菌和病毒的污染.当细胞放置于体外培养时,与体内相比细胞丢失了对生物和有毒物的防御能力,一旦被污染或自身代谢物质积累等,可导致细胞死亡.1.2恒定的温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.人体细胞培养的标准温度为36.5±0.5oC,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至食品工程2008年第2期6月出版死亡.如果温度高于37℃,细胞的生长速度减慢;如果温度高于40℃,细胞受损,超过43℃,则导致细胞死亡.培养箱的温度应严格控制在37土0.5℃, 为了能精确有效的控温,在普通的隔水式恒温培养箱上可加装一个电子控温仪.若温度过高或过低,则会延缓分裂周期,造成收获时细胞分裂相减少.1.3气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有0和CO.CO既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,他在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4,培养基的pH值也应调整到7.2～7.4 之间,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响. 偏酸时细胞发育不良,偏碱时细胞会出现轻度固缩. 细胞培养液pH的调节最常用的为加NaHCO的方法,因为NaHCO,可供CO,但CO易于逸出,故最适用于封闭培养.1.4培养液植物凝集素(PHA)是体外淋巴细胞培养成败的关键,只有在PHA的作用下才能进入有丝分裂, 因此要考虑他的质量和尝试,质量有问题药效会降低,浓度过高可能会导致红细胞凝集,都会造成实验效果差.2操作步骤2.1细胞接种接种就是将注射器中的血液注入到培养瓶中.将注射器针头刺人培养瓶的胶塞向培养液中加入0.4mL～0.5mL血液.细胞接种通常是在无菌室超净工作台内的酒精灯火焰区进行.接种时无菌操作是否规范,直接影响到细胞培养的成败.如接种时如不慎将手接触到培养瓶的瓶塞,或接触了注射器的针头,可能会造成细菌中霉菌的污染.接种时,加入血液量的多少也会对培养结果有影响,血液太少, 细胞稀薄,细胞生长速度减慢;血液太多,会造成培养时细胞生长时营养成分不够,影响细胞生存.接种操作是在酒精灯附近进行,接种时还应注意避免血液遇高温被破坏.操作时手与酒精灯的距离以火焰不烫手为宜,离火焰太近,血细胞可能被破坏,甚至被烧焦成块,肉眼可见呈团块;同时也会造成针头堵塞.出现这种情况,应及时更换针头.如已接种,应更换一瓶培养液.2.2秋水仙素适量的秋水仙素,适当的处理时机和时间,是获得足够数量的,良好细胞分裂相的条件.分裂相的多少和染色体形态及带型处理是否良好均受其影响. 秋水仙素是一种生物碱,干扰细胞中微管组装,抵制细胞纺缍体的形成,能使细胞分裂停止于分裂中期,以积累大量的中期细胞.其浓度范围较宽,可相差几十倍之多,常用质量浓度为8g/mL~0.5g/mL.一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系, 如果在培养中,浓度过低或处理的时间过短,则标本中的分裂细胞就少,染色体瘦长;用量过多,浓度过高,虽能获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得中期分裂相,但染色体缩短变粗,不利于核型分析和显带.只有浓度适量,才能确保获得足够多的分裂相和长度收缩适度的染色体.另外,处理时间延长,染色体发生分离,同样使染色体变粗短,也不利于计数和分析.加秋水仙素的时间是收集细胞制备染色体前2h～3h,加入秋水仙素后,使秋水仙素的终质量浓度为0.04g/mL~0.08g/mL培养液.实验前应根据培养液的用量和秋水仙素的浓度计算出加入的剂量.通常采用的加秋水仙素的器具是容量为1mL的注射器,使用时也应注意控制好注射器活塞,避免推动时用力过猛,导致秋水仙素加入量过多.2.3收获细胞和制片收获细胞和制片包括收集细胞,低渗,固定,滴片染色等几个步骤,每一步操作失误都可能造成最后实验的失败,使玻片上观察不到染色体.2.3.1收集细胞此步骤操作不当,容易造成细胞丢失.培养瓶从恒温箱中取出时,大部分细胞都沉淀在瓶子的底部,在将培养瓶中液体吸入到离心管之前,应用吸管将细胞充分吹打均匀,再移人离心管中.离心之后,吸弃上清,也应小心操作,有时由于吸得过猛,将与上清液相接处的淋巴细胞层吸掉了,造成大量的分裂中期相细胞丢失.2.3.2低渗低渗处理是染色体制备中很重要的环节,是获得分散良好的分裂相的关键步骤,低渗时间和低渗温度都关系到制片的成功.低渗过度或不足都会造成染色体形态不良.在低渗处理时期细胞十分娇嫩,并且表面发黏,低渗细胞混匀时,吹打要适宜,避2008年第2期董烁,等:浅谈人体外周血淋巴细胞染色体的制备6月出版27免细胞破碎及粘团,另外不要将细胞吸到吸管上部及离心管上部,避免细胞丢失.通过对比实验认为采用0.075mol,LKC137cI=处理20min一25min较合适,效果较好.用0.075mol,LKC1溶液于处理中期细胞,使细胞核膨胀破裂,染色体分散良好,便于观察计数.当低渗处理时间过长时,细胞膜过早破裂,导致分裂细胞丢失,或染色体丢失;如果低渗处理时间不足时细胞膨胀不够,则染色体分散不好,染色体仍然成团或相互重叠,不利于进行观察,计数,分析.经过低渗处理的细胞因已膨胀,容易过早破裂,造成分裂细胞丢失,所以低渗后操作应特别注意不要用力冲吸.另外低渗还可使红细胞膜破裂,经离心后,血影浮于上清液中被去除.在观察制片结果时,如发现玻片上染色体有的张不开,有的呈现团状,有的数目不够,这是由于低渗时操作不当引起的.低渗不充分,染色体聚在一起;低渗过头,染色体丢失.低渗是否能达到目的,操作时要注意两个方面:一是要使细胞充分与低渗液接触.这就需要在加入低渗液后,要充分将细胞吹打均匀;二是要注意低渗时的温度和时间.2.3.3固定固定技术也是制备良好分散的染色体的重要步骤.低渗处理完后,需加入固定液,固定的目的是对染色体形态进行固定.若染色体分散不良,可适当加大冰乙酸含量,其同时有改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成的缺陷,但过量会造成染色体形态变化和影响分带结果.染色体形态不良与加固定液速度有关,加第一次固定液快或过快,可造成飘带样染色体.固定液每次使用必须新鲜配制,否则将会形成酯类,从而影响固定效果.如果固定液不新鲜或甲醇,冰醋酸的质量不佳时,染色体形象模糊,染色体周围有胞浆背景,固定液为分析纯的甲醇和冰醋酸按3:1的体积比配制.预固定和固定时间:加固定液时,应沿管壁慢慢加入并轻轻吹打均匀,预固定和以后的二,三次固定时,固定液加入太快,混匀太快,会使固定作用过强,染色体扭转;固定作用若不足,染色体出现毛刷状.固定液纯度要高,临时配制,固定后再彻底打匀.吹打细胞时,用力要适度,如吹打过重, 会导致核型中染色体的丢失或变形.采用甲醇和冰醋酸按3:1体积比的固定液进行固定,将常用的第一次固定时间5min,30min改为25min,20min,适当延长时间,固定效果较理想.2.3.4滴片滴片是染色体制备中影响染色体形态的关键一步.首先是载玻片要非常干净,否则会影响染色体的分散和分带效果.滴片用的玻片应干净,无脂,无酸才行.其次是滴片的距离,滴加量多少,制片的方式都会影响染色体分散效果.如果冰片冷冻不够,细胞难以贴附而造成丢失.载玻片经过一系列处理擦干后,放置冰箱内,冰冻4h以上,即为冰片.滴片时现用现拿出,否则会融化,操作时采用0℃预冷的冰片滴片.滴片时导致实验失败的原因有以下几方面:①由于细胞悬液太稀,导致滴片时细胞稀少;②载玻片上水太多,导致细胞悬液顺着水流失;③载玻片不洁净,染色体分散不佳;④滴片后,应立即放入7OcI=的烤箱中,以利于细胞的进一步胀开. Giemsa染色液与pH的影响:染色液浓度高,染色时间应缩短,如果染色液浓度增高,染色时间又延长,染色体着色加深,形态结构不清,对裂隙, 染色体断裂的检出可能减少.pH偏碱,染色体着色发蓝,色泽不艳,pH稍酸,染色体呈玫瑰色,色调鲜艳,形态结构清晰,利于统计分析和畸变的检出.烤片是染色体制备中最后一步技术.烤片的温度,时间与染色体形态和分带有关.不宜温度过高和烤片时间过长.细胞培养和染色体制备实验从接种到制片长达76h,在整个实验过程中必须严谨,不能有任何差错.而且细胞培养实验不同于其他实验,步骤多,整体性强,操作要求严格认真,最终实验才会取得成功.总之,随着医学的发展及人们对遗传疾病的逐步认识,染色体制备技术现已是医学遗传学中最常见而重要的一种技术.作为一名技术人员,做出一张高质量的人体外周血淋巴细胞染色体标本是十分重要的,这样才能更好地为临床诊断及优生与遗传咨询工作服务.参考文献[1]左假.医学遗传学[M],北京:人民卫生出版社.2004:110-127.[2]周焕庚.人类染色体[M].北京:科学出版社.1987:85—86.[3]蔡绍京.细胞生物学与医学遗传实验指南[M].上海:第二军医大出版社,2002:47_48.。
掌握各个阶段淋巴细胞的形态特点及镜下识别
多，对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
免疫缺陷病
03
某些免疫缺陷病患者，外周血中成熟淋巴细胞数量可减少，对
于疾病的诊断和鉴别诊断具有一定帮助。
05 活化淋巴细胞与记忆淋巴 细胞
活化淋巴细胞形态特征及功能
形态特征
活化淋巴细胞体积增大，细胞核增大、分裂活跃，细胞质内 RNA和蛋白质合成增加，可见细胞质扩张和线粒体增多等现 象。
相关疾病与诊断意义
相关疾病
幼稚淋巴细胞增多可见于急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等疾病。
诊断意义
幼稚淋巴细胞是白血病细胞的重要组成部分，其形态学特征是白血病诊断和分 型的重要依据之一。同时，幼稚淋巴细胞计数也是判断白血病治疗效果和预后 的重要指标之一。
04 成熟淋巴细胞阶段
成熟淋巴细胞形态特征
细胞大小
细胞质
成熟淋巴细胞大小较均一，直径一般 在6-9μm之间。
细胞质较少，呈淡蓝色，无颗粒或仅 有少量嗜天青颗粒。
细胞核
成熟淋巴细胞的细胞核呈圆形或卵圆 形，染色质呈粗块状，核膜清晰，核 仁消失。
镜下识别方法及技巧
染色方法
常用瑞氏-吉姆萨染色法进行染色， 使得细胞核和细胞质呈现不同的 颜色，便于观察。
功能
活化淋巴细胞具有高度的增殖能力和分化能力，可迅速分裂 并分化为效应细胞和记忆细胞，参与机体的免疫应答。
记忆淋巴细胞形态特征及功能
形态特征
记忆淋巴细胞体积较小，细胞核较大 而细胞质较少，表面标记和细胞内分 子特征与普通淋巴细胞有所不同。
功能
记忆淋巴细胞具有长期存活的能力， 当机体再次接触相同抗原时，可迅速 增殖并分化为大量效应细胞，产生更 快、更强的免疫应答。
观察要点
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CD4
CD4 SP
CD4 RTE
TCR CD8
TCR CD8
b-selection
Positive selection
CD8 SP
Negative selection
CD8 RTE
Functional maturation
Aire缺陷与自身免疫
Aire驱动TSA在髓质区胸腺 上皮细胞中表达 OVA-specific TCR/insulin promoter-driven OVA双转 基因鼠模型
Notch1。对诱导和维持B系定向至关重要
Id
IL-7/Stat5
E2A
EBF
Pax5
滤泡B细胞和边缘带B细胞分化
FO：IgM+IgDhiCD23+CD21int MZ： IgMhiIgD+CD23-CD21hi
BCR信号强度： Aiolos，负调控，FO增加 CD21，正调控，MZ增加
Notch2信号：MZ B细胞缺失 BAFF：T2，FO B细胞缺失
阴性选择中的一些问题
Anergy的相对贡献？ 受体编辑：25%非转基因B细胞
仅发生在骨髓 如何避免有益BCR被清除？
未成熟B与成熟B细胞对BCR交联反应性差异
BCR刺激后，未成熟B细胞中PIP2水解和 PKCb活化不充分 PKCb持续活化令未成熟B细胞获得凋亡抗性 PKCb功能阻断使成熟B细胞对凋亡高度敏感
VL to JL
CLP
Linc-kit+IL-7R+
Prepro-B
B220+CD19-
Pro-B
B220+ CD19+CD43+
Pax5 Bcl-6 Blimp-1 Xbp-1
Pre-B
Immature B
CD43Pre-BCR+
IgM+IgD-
apoptosis
SelfReactive B
Plasma cell
CD19loCD138+
Mature B
IgMloIgDhi CD21intCD23+
T2
IgMhiIgD+ CD21+CD23+
T1
IgMhiIgDCD21-CD23-
B细胞定向分化的转录调控
E2A: 调控多种B系基因表达，缺陷导致B细胞发育阻滞于CLP阶段 EBF1： E2A的主要靶基因，同时受IL-7/Stat5信号调控 Pax5： 激活B系基因，如CD19、Ig-a，同时抑制非B系基因，如
c-Rel缺陷鼠来源B细胞受BCR刺激后出现凋亡 CD40信号挽救B细胞凋亡
c-Myc过表达赋予未成熟B细胞凋亡抗性 c-Myc过表达干扰转基因鼠B细胞阴性选择
未成熟B细胞中，BCR受抗原刺激后不能定位于脂筏。鉴于PIP2主要位于脂筏，BCR定 位缺陷可能直接影响PIP2水解。BCR定位缺陷可能与胞膜中胆固醇含量低有关。
Aire作用机制
调控TSA表达 促进mTEC凋亡
Aire的其它功能？
并非所有TSA的胸腺表达都受Aire调控，如C反应蛋白、谷氨酸脱羧酶67等。 a胞衬蛋白、二硫化物异构酶A2等的表达并不依赖于Aire，但Aire缺陷鼠依然 表现出针对这些抗原的自身免疫应答。
Aire影响mTEC抗原加工提呈 Aire参与SP T细胞发育调控 Aire参与外周免疫耐受诱导
谢谢结束语谢谢大家聆！！！20淋巴细胞发育进展张毓
Development of Thymocytes
Double negative
Double positive
Pre-TCR
TCR-b rearrangement
TCR
CD4 TCR-a rearrangement
CD8
TSC
DN
DP
TCR CD4
Single positive
CD45-gp38-MHC II+EpCAM+细胞诱导T细胞凋亡
胸腺器官生成
cTEC和mTEC来自共同前体
K5-K8+
K5+K8+
K5-K8+ cTEC K5+K8- mTEC
mTEC发育
B淋巴细胞发育
Ig gene rearrangements
E2A EBF1 Pax5 DH to JH
VH to DHJH