活细胞工作站的应用

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活细胞工作站与应用——孟丽丽

第三期光学显微镜培训班
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背感光EMCCD第三期光学显微镜培训班 33
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音高速度，全幅30fps，最高300fps以上低温冷CCD 典型应用： TIRF、转盘式共聚焦、单分子探测、病毒活性
囊泡运输过程 18fps
第三期光学显微镜培训班 34
4。兼容行好光路设计灵活可使用多电动部件或者中间附件
5。整个系统协调工作的系统软件
第三期光学显微镜培训班
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第三期光学显微镜培训班 21
Major Problems In Live Cell Imaging
– 光毒性及光漂白（Photo toxicity and bleaching）
在有氧环境下，荧光激发光会对细胞产生毒性及漂白作用，造成细胞功能损害甚至死亡；要最大限度地减少成像时的曝光时间！
第三期光学显微镜培训班 14
活细胞应用条件——“活”
第三期光学显微镜培训班
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第三期光学显微镜培训班 15
u CO2培养系统
参数
适合的范围
温度
28-37°C
气体湿度
空气 5-7% CO2
97-100%
注释热台灌流物镜加热培养箱环境控制
Use HEPES Buffered Media for Air 气体控制 Chamber
第三期光学显微镜培训班 18
u 气体混合系统
• 可以使用于缺氧、腹氧实验等，对气体环境有要求的实验
• 可以控制CO2、O2等气体的浓度，
• 可用于没有内置混合器的任何控制器
第三期光学显微镜培训班
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第三期光学显微镜培训班 19

活细胞高速共聚焦成像系统使用说明

活细胞工作站使用指南1. 开机顺序：1）分为上下两列开关：先下列按照一、三、二、四、五的顺序打开，上列依顺序由下向上打开；2）打开激光器开关；3）打开电脑；4）打开气瓶，顺时针缓慢拧开，压力阀上调一小刻度即可；5）小室加水，要用超纯水（如小瓶没水，请到各自实验室填充）；6）选择合适的适配器（33mm 培养皿或玻片）后，将细胞放入小室，盖好小室上层小盖。

2. 打开软件。

桌面——双击Volocity ——出现界面1）新建文件夹（为了保证每次数据的安全性及有序性，要求每次试验都建立新的文件夹）方法：点击 Creat a new library 图标——选择新建文件夹路径（C:\Ultraview \ioz\当时月份的文件夹）——输入文件名（名称格式为本人姓名+年月日）——点击 Creat ——进入软件界面2）打开已有的文件夹进行数据处理点击 Open a existing library 图标——选择新建文件夹路径（C:\Ultraview \ioz\当时月份的文件夹\目标文件名）——点击 Open ——进入软件界面3. 软件界面及显微镜界面构成：2）显微镜界面：图2：显微镜正面示意图（学生可操作的部分有两部分）：图44. UltraVIEW VoX 图像采集简要操作流程1) 将样品放入小室，盖好小室上层小盖；2) 打开软件，单击图1 第三部分中的“video preview ”图标，点击图1 第六部分中的⑦打开明场光路；3) 选择合适的物镜后在显微镜下调整样品对焦；4) 点击图2.第一部分中的“L100”将显微镜光路切换至共聚焦成像模式；5) 选择合适的激光通路6) 依次调节各路激光的激光功率，敏感度（sensitivity ）及曝光时间（exposure time ）；激光功率最大一般控制在40%左右，如果荧光较弱，敏感度可以拉的很大，但曝光时间一般最大控制在500ms 左右。

典型活细胞工作站图文介绍

温度控制单元-尾部接口，每个终端对应接上即可
其它种类（培养皿等）的孵育系统底座，孵育系统盖子统一使用
气体控制单元-面板，高级设备可同时控制二氧化碳和氧气浓度
气体加湿、加温设备
气体控制单元-尾部借口
简单图片展示
左图：相差模式，微米岛上粘附的干细胞（背景区域抗细胞黏附）
右图：DIC图片叠加绿色荧光图片，干细胞在微米图案上长时间培养后利用LIVE-DEAD试剂盒进行染色，结果表明细胞状态良好
活细胞工作站（硬件设备图文介绍）
背景介绍实时动态观察记录功能自动部件（载物台、光闸等）细胞孵育系统（含温度和气体控制单元等）拍摄图片及视频展示工作站使用注意事项
背景介绍
利用以往的显微镜，我们仅能观察固定标本的状态（活体的某一个瞬间）现在人们不仅仅局限于处理与观察死亡细胞标本，活细胞的实时动态观察已变得越来越普及活细胞工作站的主要功能: 对细胞行为进行实时的观察记录，即动态观察细胞行为的发生、发展过程（细胞孵育系统+全自动观察记录系统）
特色：实时观察记录功能
A 多点、每个点多种采集模式、时间序列循环拍摄
B
A
1. 相差 2. 荧光1 3. 1 3. 荧光2 …
自动功能硬件
载物台：可在X、Y、Z方向上自动移动光闸：明场光源和荧光光源处各一个聚光镜转盘：H、PH1、PH2、DIC等模式物镜转盘：5X/0.15；10X/0.45(PH)； 20X/0.4(PH, DIC)；20X/0.8；40X/0.6(PH)； 40X/1.30 滤光块转盘：EGFP/FITC/CY2/A488； DSRED/CY3/TRITC；DAPI/Hoechst 防焦点漂移：Definite Focus（不同厂商方案有差别）

细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍

一、细胞生物学实验教程：细胞运动性检测实验详细介绍细胞的运动是机体新陈代谢与基本生命特征之一。

在低等生物中，原始细胞通过变形与伪足活动趋近食物与远离伤害。

在高级生物体的生命活动中，细胞的定向迁移与胚胎形成、神经发育、免疫应答、器官成熟等密切有关。

人类的许多重大疾病及其治疗，如肿瘤转移，神经修复、干细胞功能再生等等都与细胞运动息息有关。

细胞的运动依靠于细胞骨架（Cytoskeleton），细胞骨架除了承担胞内的物质运输之外，也是构成细胞运动性的物质基础，比如肌动蛋白是细胞运动伪足中最要紧的结构单位。

当细胞感受到外界的刺激信息（如食物信号等），会伸出扁平的片层伪足，通过其前沿的不断延展与基部的收缩，与细胞与支撑物之间的吸附、解吸附的动态循环，朝向刺激源运动。

细胞的运动还具有粘附性（Adhesion）与趋向性（Polarization）的特点，不一致的粘附因子与细胞外基质（Extracellular Matrix）相互作用一方面决定了细胞运动的分子信号调控，同时与大量的趋化因子共同决定了不一致细胞的特定组织转移与偏好。

图1：细胞的定向迁移运动图2：细胞的运动性与细胞骨架蛋白图3：神经干细胞分化与神经元的定向迁移图4：原生癌细胞的迁移与侵袭图5：一个正在穿孔的肿瘤细胞的运动图6：恶性黑色素瘤细胞侵入机体正常组织图7：上皮细胞在伤口部位增殖，运动迁移，进行组织修复二、细胞运动性常用检测方法细胞运动性研究在发育生物学、神经生物学、癌症与干细胞生物学等诸多前沿科学领域具有重大研究意义。

然而长期以来细胞运动性检测是一个技术难点，目前常规可用于细胞运动性评估的要紧方法有：基于显微镜的形态观察（含荧光标记）、体外组织移植、细胞集落划痕与Boyden Chamber法，这些方法各有千秋，但都无法实现定量检测细胞定向迁移、癌细胞侵袭性与细胞粘附性等，最近罗氏公司推出的基于Boyden Chamber原理的微电子细胞芯片检测技术（xCELLigence）实现了定量、动态、无标记关于大规模细胞迁移、侵袭、粘附性的检测，同时还可同步检测包含细胞增殖、凋亡等多项细胞生理学功能。

尼康全自动倒置显微镜图像工作站-TiE的配置及其视野矫正

尼康全自动倒置显微镜图像工作站-TiE的配置及其视野矫正张妍乐;袁粒星;马志贵;顾玲【摘要】尼康全自动倒置显微镜图像工作站-TiE(活细胞工作站)是用于高端生物科学研究领域的新型倒置显微镜系列,能提供高分辨率、灵活性高、可扩展等多种强大功能,为定时拍摄高清活细胞体外增殖、迁移等活动图像提供可能.将尼康全自动倒置显微镜图像工作站-TiE应用于细胞体外行为的实时观测,为细胞研究提供了一种新的、更高质量的检测手段.【期刊名称】《中国医疗器械信息》【年(卷),期】2018(024)004【总页数】2页(P76-77)【关键词】尼康全自动倒置显微镜图像工作站-TiE;活细胞工作站;配置;视野矫正【作者】张妍乐;袁粒星;马志贵;顾玲【作者单位】四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室四川成都 610000;四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室四川成都 610000;四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室四川成都 610000;四川大学华西第二医院出生缺陷与相关妇儿疾病教育部重点实验室四川成都 610000【正文语种】中文【中图分类】Q2-33活细胞工作站（Live cell Imaging System，LIS）又称活细胞显微成像采集系统，是指在模拟体内环境的条件下，体外观测活细胞增殖、迁移、粘附、凋亡等多种活动的监测系统[1]。

能自分子水平上，做到基因定位定量表达动态分析、蛋白质合成降解运输动态研究、蛋白质相互作用动态研究以及代谢动力学测定等[2]。

因此，熟悉活细胞工作站的具体配置及其使用方法对临床工作具有重要意义。

本研究选取尼康全自动倒置显微镜图像工作站-TiE，介绍其配置及视野矫正方法，现具体报告如下。

1.配置1.1 显微镜目镜该显微镜包含CFI 10x目镜镜头，TI-TD双目镜筒D、TI-TS双目镜筒S、TI-TERG人机学镜筒等3种目镜筒。

活细胞工作站的使用及常见问题分析

活细胞工作站的使用及常见问题分析作者：槐玉英宋瑞龙来源：《科技视界》2020年第16期摘要活细胞工作站可为体外细胞提供生存环境并维持细胞在较长时间内的正常生长繁殖，该设备便于细胞内或细胞间物质代谢的追踪观察，现已成为生物学领域中的一种热门研究手段。

本文概述了该设备的操作方法及常见问题，供大家参考。

关键词活细胞工作站;样品制备;应用;常见问题中图分类号： Q2-33 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;文献标识码： ADOI：10.19694/ki.issn2095-2457.2020.16.085AbstractThe live cell imaging system can provide a living environment for cells in vitro and maintain the normal growth and reproduction of cells for a long time.It is convenient for tracking and observing the metabolic of intracellular or intercellular substance.It has become a popular research method in the biological field.This paper outlines the operation and common problems of the live cell imaging system.Key WordsLive cell imaging system;Sample preparation;Application;Common problems活细胞工作站是在倒置荧光显微镜基础上实现长时间、连续观察活细胞培养并能连续采集图像的成像系统，可对细胞内或细胞间的物质代谢或信息传递进行动态观察。

活细胞工作站实时摄影技术在问充质干细胞迁移实验中的应用

ｇｒａｔｉｏｎｂｅｈａｖｉｏｒ，ｎｏｄｏｕｂｔｐｒｏｖｉｄｉｎｇｎｅｗｍｅａｎｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｒｅｓｅａｒｃｈ．
￣ｂｓｔｒａｃｔ：ＬｅｉｃａｌｉｖｅｃｅｌｌｓｔａｔｉｏｎＡＦ６０００ｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｌｉｖｅｃｅｌｌｉｍａｇｅａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ，ａａａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｏｔｈｅｒｐｏｗｅｆｕｒｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｉｔａｌｓｏｃａｎｋｅｅｐｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｉｍａｇｅａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏｏｐｔｉｃａｌ，ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨｖａｌｕｅ，ａｎｄｏｔｈｅｒｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｈｉｇｈｌｙｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｍｄｓｔａｂｌｅ．ＡＦ６０００ｃｏｕｌｄｍａｉｎｔａｉｎｈｉｇｈｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ｈｉｇｈｃｏｎｔｒａｓｔａｎｄｈｉｇｈｓｐｅｅｄｉｍａｇｉｎｇｅｆｆｅｃｔｉｎｒｅａｌ：ｉｍｅｉｍａｇｉｎｇ；ｆｕｌｌｙｅｍｂｏｄｉｅｓｈａｒｍｏｎｙｂｅｔｗｅｅｎｔｏｍａｉｎｔａｉｎｌｉｆｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｃｅｌｌｓａｎｄｔｏｏｂｔａｉｎａｐｅｆｅｒｃｔｉｖｅｃｅｌｌｉｍａｇｅ．Ｔａｋｉｎｇｕｓｅｏｆｒｅａｌ —ｔｉｍｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＡＦ６０００ｔｏｃａｔｃｈｔｈｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｍｉ－

【蔡司显微镜知识】高速活细胞工作站

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Cell Observer HS 高速活細胞影像工作站快速紀錄離子濃度螢光影像
LED光源Colibri The Lambda DG-4 Xenon light source allows
rapid switching between 4 wavelengths
Zeiss
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培養箱系統搭配：
•小型培養系統Incubator PM S1 -- 精確的控制環境溫度，小型培養箱可快速加熱、均勻混合CO2、，並提供溼氣及物鏡加熱，也可應用於缺氧實驗應用等。

•大型培養系統Incubator PM XL –大型培養系統將所有環境干擾因素降到最低，氣體混合最均勻，濕度控制器提供活細胞培養最自然狀態，穩定性達到最高。

可搭配ApoTome與TIRF：
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•TIRF全反射螢光顯微鏡專門應用於細胞膜表面之螢光訊號觀察。

ApoTome (left) and TIRF (right) sliders transform Cell ObserverR into a system for generating optical sections.
4。

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应用范围：
• 用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞器、蛋白质复合体等的转运、分子相互作用、细胞骨架的动态变化、细胞分裂和细胞器发生过程等); • 对细胞内结构和活动进行准确的定性、定量、定时和定位分布观察。研究方法包括免疫荧光染色（单染、双染、三染）、活细胞荧光标标记、 FRAP(Flourescence Recovery After Photobleaching)、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)等。
形态暨影像公共平台
生理129室
形态暨影像公共平台
• 激光共聚焦显微镜 (Laser Scan Confocal Microscope，LSCM， Leica) • 流式细胞仪 (Flow cytometry，BD)
激光共聚焦显微镜 (Laser Scan Confocal Microscope)
活细胞工作站的应用 (Live cell imaging system )
• • • • • 荧光标记蛋白的长时间跟踪观测活细胞运动及形态跟踪观测荧光共定位荧光共振能量转移FRET 荧光图像处理、测量
活细胞工作站的优点
• • • • • 实时观测自动聚焦单细胞追踪多位点成像成像速度快
3. 扫描系统：线扫描速度(双向) ：2800线/sec，连续可调；扫描分辨率：8192×8192像素；最大帧频：512×512
物镜的配置
• • • • • 10×； 20×； 40×； 63×(油镜)； 63×(水镜)；
利用水浸物镜进行长期活细胞观察
• 水浸物镜可以获得最高的分辨率和对比度。自动加水设备，保证移入样本后对比度不会下降。无对焦错误,运动过程中水膜不会破裂。
Transfection
• Incubate the cells: 30-40% or 70%-80% confluence. • Transfection: lipofectamine 2000 • Transient transfection: used for imaging directly. • Select stable cell lines: 48h, G418, 2-3weeks.
活细胞工作站与共聚焦的区别
• 活细胞工作站：细胞立体感强成像速度快：＜500ms 光毒性小多点拍摄主要用于活细胞实时观察（GFP，CFP、YFP，RFP）
• 激光共聚焦：平面扫描成像速度慢：1-2 min 清晰度较好光毒性主要用于固定后的组织、细胞。
活细胞实验条件的控制
• 温度的保持；（加热的载物台，加热循环空气，物镜加热器，恒温箱） • pH值的保持，即CO2的供应（5% CO2）； • 培养基离子浓度的保持； • O2（95% O2）的要求。
标本的准备要点
• 尽量使用0.17mm厚玻璃底的培养皿（Lab Ｔｅｋ）因为高数值孔经径物镜能发挥其最大效应。 • 对于不容易在玻璃上生长的细胞，使用包被了polylysine 或相似物质的玻璃底培养皿。
绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）
• • • • 可溶性蛋白，性质稳定。荧光基团明亮。荧光在活细胞中即可观察，不需固定和加工。 GFP基团和目的基因做成融合蛋白后，可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。 • 表达GFP融合产物的细胞能在活的状态下进行实验和检测。
Check whether pDsRed1-mito can probe mitochondria in CMs by using 生理楼2012.09.04 confocal microscope
pDsRed1 Mito Mito Green Merge
X63 X63
2.5 h
• 仪器名称：Leica 激光共聚焦Байду номын сангаас微镜 • 型号：Leica TCS SP5 II • 国别：德国徕卡
主要技术指标
1. 激光器： HeNe Red: 633nm； HeNe Green: 543nm； Ar: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm；近紫外: 405nm。 2. 检测通道：3个光谱型检测通道，检测波长范围400-800nm。