活细胞工作站技术
活细胞工作站的应用
应用范围：
• 用于研究亚细胞结构、细胞内的物质(囊泡、细胞 器、蛋白质复合体等的转运、分子相互作用、细 胞骨架的动态变化、细胞分裂和细胞器发生过程 等); • 对细胞内结构和活动进行准确的定性、定量、定 时和定位分布观察。研究方法包括免疫荧光染色 （单染、双染、三染）、活细胞荧光标标记、 FRAP(Flourescence Recovery After Photobleaching)、FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)等。
形态暨影像公共平台
生理129室
形态暨影像公共平台
• 激光共聚焦显微镜 (Laser Scan Confocal Microscope，LSCM， Leica) • 流式细胞仪 (Flow cytometry，BD)
激光共聚焦显微镜 (Laser Scan Confocal Microscope)
活细胞工作站的应用 (Live cell imaging system )
• • • • • 荧光标记蛋白的长时间跟踪观测 活细胞运动及形态跟踪观测 荧光共定位 荧光共振能量转移FRET 荧光图像处理、测量
活细胞工作站的优点
• • • • • 实时观测 自动聚焦 单细胞追踪 多位点成像 成像速度快
3. 扫描系统： 线扫描速度(双向) ：2800线/sec，连续可调； 扫描分辨率：8192×8192像素； 最大帧频：512×512
物镜的配置
• • • • • 10×； 20×； 40×； 63×(油镜)； 63×(水镜)；
利用水浸物镜进行长期活细胞观察
• 水浸物镜可以获得最高的分辨率和对比度。自动加水设备， 保证移入样本后对比度不会下降。无对焦错误,运动过程 中水膜不会破裂。
TCB9-2活细胞工作站
活细胞高速共聚焦成像分析系统背景为适应目前对活细胞成像速度的要求，高速活细胞共聚焦显微镜应运而生，它们大大提高了成像速度，在取得高质量图像的同时，尽量保护样品，减少荧光淬灭，捕捉活细胞长时间动态变化，在生物学中得到广泛应用。
分类（根据扫描单元不同）（一）碟片式共聚焦1、高灵敏度、高分辨率的EMCCD2、YOKOGAWA CSU22/10共聚焦扫描单元3、电动载物台、快速聚焦单元4、细胞培养小室共聚焦扫描单元EMCCD电动载物台细胞培养小室分类（根据扫描单元不同）特点：1、高灵敏度2、高速成像3、低光毒性、光漂白4、多种实验技术应用分类（根据扫描单元不同）（二）点扫描式共聚焦1、PMT2、点扫描共聚焦单元3、电动载物台、快速聚焦单元4、细胞培养小室特点：高分辨率1）细胞迁移与细胞骨架2）细胞分裂与细胞周期3）细胞信号转导4）组织分化与发育5）囊泡和蛋白运输6）生理学和神经科学7）钙离子信号研究8）蛋白质与DNA相互作用9）宿主与病原体相互作用10）癌症研究11）药理研究12）生物物理研究T 细胞，绿色颗粒为HIV 病毒可以精确的跟踪需要观察的细胞记微管蛋白，红色标记染色体Determining the position of the cell division planeVol 424, 1074 -1078 (28 August 2003)T-cell engagement of dendritic cells rapidly rearranges MHC class II transportVol.418、No.6901（29 Aug.’02）细胞核囊泡和微管囊泡运输模式动物4D成像、追踪分析－－3D＋T光诱导动力学（Photokinesis）020060010001400C e l l C o u n t M itochondrial M ass-3-2-1123456400800120016002000T a crineF C C PA ce ta m in o p h e n L o g co m p o un d [礛]M i t o c h o n d r i a l M a s s 020040060080010001200140016001800200000.030.10.3131030Staurosporine [µM]C e l l n u m b e r a n d n u c l e i a r e a [-]什么是高内涵（HCA）细胞成像分析技术？高内涵细胞成像分析系统由三个部分组成：全自动高速显微成像，全自动图像分析和数据管理。
低氧活细胞工作站重要性
现今，越来越多的专家学者开始使用低氧工作站来培养细胞，这是对旧的试验方法的革新，也是对科学研究者的一次观念上的革新。
因为只有低氧培养细胞，才能够完全在体外模拟细胞在体内的生存环境，让细胞在一个完全无压力的环境下生长。
首先，我们需要认识两个概念：
1.低氧培养：当细胞或器官中的氧气含量低于空气中的氧气水平时的培
养状态，称为低氧培养。
2.生理正常氧气水平：这取决于是什么细胞或器官，但绝对不是20.9%，
如下图所示。
人体内不同部位的细胞，正常的生理氧气水平不同，如
动脉血为15%，静脉血为5%，脑为2%左右，如果想要在低氧状态下
研究脑细胞，那么氧气水平必须在2%左右，才叫做低氧培养，绝对
不是20.9%。
相同的，人体内其他组织，如肺、肝、肾、脾和心脏等
的正常生理氧气水平都不一样。
所以，我们应该使细胞在正常的生理环境需氧量下培养细胞，才能让细胞在一个完全无压力的环境下生长，才能让细胞的数量和活性都大大提高。
活细胞工作站与应用——孟丽丽
第三期光学显微镜培训班
16
背感光EMCCD第三期光学显微镜培训班 33
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温冷CCD 典型应用： TIRF、转盘式共聚焦、单分 子探测、病毒活性
囊泡运输过程 18fps
第三期光学显微镜培训班 34
4。兼容行好 光路设计灵活 可使用多电动部件或者中间附件
5。整个系统协调工作的系统软件
第三期光学显微镜培训班
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第三期光学显微镜培训班 21
Major Problems In Live Cell Imaging
– 光毒性及光漂白 （Photo toxicity and bleaching）
在有氧环境下，荧光激发光会对细胞产生毒性及漂白 作用，造成细胞功能损害甚至死亡；要最大限度地减 少成像时的曝光时间！
第三期光学显微镜培训班 14
活细胞应用条件——“活”
第三期光学显微镜培训班
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第三期光学显微镜培训班 15
u CO2培养系统
参数
适合的范围
温度
28-37°C
气体 湿度
空气 5-7% CO2
97-100%
注释 热台 灌流 物镜加热 培养箱环境控制
Use HEPES Buffered Media for Air 气体控制 Chamber
第三期光学显微镜培训班 18
u 气体混合系统
• 可以使用于缺氧、腹氧实验等， 对气体环境有要求的实验
• 可以控制CO2、O2等气体的浓 度，
• 可用于没有内置混合器的任何控 制器
第三期光学显微镜培训班
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第三期光学显微镜培训班 19
活细胞高速共聚焦成像系统使用说明
活细胞工作站使用指南1. 开机顺序：1） 分为上下两列开关：先下列按照一、三、二、四、五的顺序打开，上列依顺序由下向上打开；2） 打开激光器开关；3） 打开电脑；4） 打开气瓶，顺时针缓慢拧开，压力阀上调一小刻度即可；5） 小室加水，要用超纯水（如小瓶没水，请到各自实验室填充）；6） 选择合适的适配器（33mm 培养皿或玻片）后，将细胞放入小室，盖好小室上层小盖。
2. 打开软件。
桌面——双击Volocity ——出现 界面1） 新建文件夹（为了保证每次数据的安全性及有序性，要求每次试验都建立新的文件夹）方法：点击 Creat a new library 图标——选择新建文件夹路径（C:\Ultraview \ioz\当时月份的文件夹）——输入文件名（名称格式为 本人姓名+年月日）——点击 Creat ——进入软件界面2） 打开已有的文件夹进行数据处理点击 Open a existing library 图标——选择新建文件夹路径（C:\Ultraview \ioz\当时月份的文件夹\目标文件名）——点击 Open ——进入软件界面3. 软件界面及显微镜界面构成：2） 显微镜界面：图2：显微镜正面示意图（学生可操作的部分有两部分）：图44. UltraVIEW VoX 图像采集简要操作流程1) 将样品放入小室，盖好小室上层小盖；2) 打开软件，单击图1 第三部分中的“video preview ”图标，点击图1 第六部分中的⑦打开明场光路；3) 选择合适的物镜后在显微镜下调整样品对焦；4) 点击图2.第一部分中的“L100”将显微镜光路切换至共聚焦成像模式；5) 选择合适的激光通路6) 依次调节各路激光的激光功率，敏感度（sensitivity ）及曝光时间（exposure time ）；激光功率最大一般控制在40%左右，如果荧光较弱，敏感度可以拉的很大，但曝光时间一般最大控制在500ms 左右。
典型活细胞工作站图文介绍
温度控制单元-尾部接口，每个 终端对应接上即可
其它种类（培养皿等）的孵育系统底座，孵育系统盖子统一使用
气体控制单元-面板，高级设备可同时控制二氧化碳和氧气浓度
气体加湿、加温 设备
气体控制单元-尾部借口
简单图片展示
左图：相差模式，微米岛上粘附 的干细胞（背景区域抗细胞黏附）
右图：DIC图片叠加绿色荧光图片， 干细胞在微米图案上长时间培养后利 用LIVE-DEAD试剂盒进行染色，结 果表明细胞状态良好
活细胞工作站（硬件设备图文介绍）
背景介绍 实时动态观察记录功能 自动部件（载物台、光闸等） 细胞孵育系统（含温度和气体控制单 元等） 拍摄图片及视频展示 工作站使用注意事项
背景介绍
利用以往的显微镜，我们仅能观察固定标 本的状态（活体的某一个瞬间） 现在人们不仅仅局限于处理与观察死亡细 胞标本，活细胞的实时动态观察已变得越 来越普及 活细胞工作站的主要功能: 对细胞行为进行 实时的观察记录，即动态观察细胞行为的 发生、发展过程（细胞孵育系统+全自动观 察记录系统）
特色：实时观察记录功能
A 多点、每个点多种采集模式、时 间序列循环拍摄
B
A
1. 相差 2. 荧光1 3. 1 3. 荧光2 …
自动功能硬件
载物台：可在X、Y、Z方向上自动移动 光闸：明场光源和荧光光源处各一个 聚光镜转盘：H、PH1、PH2、DIC等模式 物镜转盘：5X/0.15；10X/0.45(PH)； 20X/0.4(PH, DIC)；20X/0.8；40X/0.6(PH)； 40X/1.30 滤光块转盘：EGFP/FITC/CY2/A488； DSRED/CY3/TRITC；DAPI/Hoechst 防焦点漂移：Definite Focus（不同厂商方案有差别）
活细胞工作站技术
3’ MCS
/techinfo/vectors/vectorsE/pEGFP-N1.html
Multiple Cloning Site (MCS) of pEGFP-N1
Vector map of pEGFP-C1
Multiple Cloning Site (MCS) of pEGFP-C1
Selecting and focusing specimen section
5. Place the specimen on the xy-stage. 6. Focus the image directly at the microscope. 7. Switch on the VIS observation output on the front panel of the microscope. If the contrast method is changed the intensity slider is automatically adjusted. 8. Use the SmartMove to bring a selected specimen section to the focus plane and focus it.
特点(二)
二. 最大程度减少因各种原因造成的图像 模糊
1. 防止室温变化的效应 孵育箱 2.全自动数控载物台, 配备各类卡具 3.全自动物镜转换器:定时、自动聚焦 4. 防止内置电子元件引起的热变形
自动聚焦功能
特点(三)
三. 使细胞处于最佳的生理状态 1. 高纯度CO2 2. CO2控制器 3. 温度控制器 4. 加热器 5.电动快门的使用（数十毫秒）：减少光损伤
Transfection Protocol
活细胞工作站 原理
活细胞工作站原理
活细胞工作站是一种实验设备，用于对活细胞进行研究和实验操作。
其原理主要包括以下几个方面：
1. 细胞培养：活细胞工作站提供了一个受控的环境，包括适当的培养基、温度、湿度和二氧化碳浓度等，以确保细胞在理想的条件下生长和繁殖。
2. 细胞观察：活细胞工作站通常配备了光学显微镜和相应的放大倍数，以便对细胞进行观察和记录。
用户可以观察细胞的形态、大小、运动和细胞器的定位等特征，以了解细胞的生理状态和功能。
3. 细胞操作：活细胞工作站通常配备了显微操作装置（如激光切割系统、显微注射装置、微操纵器等），以便对细胞进行操作。
例如，可以通过激光切割系统将细胞进行分离，或通过显微注射装置进行基因转染等。
4. 环境控制：活细胞工作站具有对温度、湿度和二氧化碳浓度等环境因素的控制能力，以模拟体内情况，提供一个适宜的环境给细胞生长和实验操作。
5. 数据记录和分析：活细胞工作站通常配备了图像记录系统，将观察到的细胞图像保存下来。
此外，还可利用图像处理和分析软件对细胞图像进行处理和分析，从而得到更详细的数据和结论。
通过活细胞工作站的使用，研究人员可以更加全面地了解和研究活细胞的行为、功能以及细胞内的分子机制，为细胞生物学研究提供了强大的工具和平台。
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单色仪的优点
1）提供的激发光波长更精确，带宽更窄 2）不同波长的转换不需要更换任何光学元
件，更换速度很快，只需2-3ms
荧光滤色块
A4 GFP RFP CFP YFP CFP/YFP 三色
Incubate the cells : 30-40% confluent. Transfection : lipofectamine 2000 Transient transfection: used for imaging
directly. Select stable cell lines: 48h, G418, 2-3weeks
Multiple Cloning Site (MCS) of pEGFP-C1
Other living color vectors from clontech
EBFP Vectors ECFP Vectors EYFP Vectors DsRed Vectors
……
Transfection
绿色荧光蛋白 （Green Fluorescent Protein, GFP)
1) 可溶性蛋白，性质稳定。 2）荧光基团相当明亮 3）荧光在活细胞中即可观察，不需固定和
组织加工。 4）GFP基团和目的基因做成融合蛋白后，
可以通过转染的方法在细胞中稳定表达。 5）表达GFP融合物的细胞能够在生活状态
4. For each transfection, add 800 μl serum-free DMDM to each tube. Do not add antibacterial agents to medium during transfection.
特点
一. 弱激发光改善荧光检测 二. 最大程度减少因各种原因造成的图像模糊 三. 使细胞处于最佳的生理状态 四. 避免震动效应 五. 使用0.17mm厚的玻璃底培养皿
特点(一)
一. 弱激发光改善荧光检测 1. 弱光激发
汞灯：全波段 氙灯：300-700nm 2. 扩大荧光检测效率 A. 使用高数值孔径物镜
进行实验和检测。
Vector map of pEGFP-N1
5’ APOE 3’
MCS
/techinfo/vectors/vectorsE/pEGFP-N1.html
Multiple Cloning Site (MCS) of pEGFP-N1
Vector map of pEGFP-C1
活细胞工作站技术 (Live Cell Imaging System)
刘雅静 Email: yjl@ 中国科技大学生命科学实验中心
生物楼340
部件介绍 ห้องสมุดไป่ตู้点 特点 应用 使用方法 Movie
主要内容
System overview
1 Monitors 2 Control panel with on/off switch and running-time meter 3 System desk∗ 4 Mouse 5 Keyboard 6 Remote control module "SmartMove" 7 Control unit 8 Workstation (PC) 9 Leica DMI6000 B microscope 10 Antivibration stage* 11 Climate chamber*
Climate chamber and accessories
Heating Unit*
Tempcontrol 37-2 digital*
The Tempcontrol 37-2 digital* must always be switched off a few minutes after switching off the heating unit*.
Transfection Protocol
1. Prepare the following solutions in 5ml sterile tubes: Solution A: dilute 1μg DNA in 100 μl serum-free DMDM Solution B: dilute 2 μl Lipofectamine2000 Reagent in 100 μl serum-free DMDM.
Leica DMI6000 B
全自动数控载物台 全自动物镜转换器：定时、自动聚焦 物镜适合长时间工作在细胞生长环境中 荧光光强控制，防淬灭 超快速荧光滤块转换 参数显示屏 快捷操作控制键
Main circuit breaker
The main circuit breaker is exclusively for powering down the system in the event of danger, for service work, or if the system is not to be used for an extended period.
Otherwise the heating may not cool down properly.
Temperature sensor
CO2 Controller
参数显示屏
SmartMove
物镜转换控制
调焦控制
Control panel
环境控制系统
环境控制系统
优点
实时观测 自动聚焦 单细胞追踪 多位点成像 成像速度快 图像清晰度高
2. Combine the two solutions, mix gently, and incubate at room temperature for 20 min.
3. Wash the cells once with 1 ml serum-free DMDM.
Transfection Protocol