紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书

2．紫外吸收法测定蛋白质/DNA 浓度的原理
2.1 紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理 蛋白质为生物大分子，所产生的紫外吸收往往是其分子内的小
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基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。 1． 在蛋白质分子中，酪氨酸（Tyr） 、苯丙氨酸（Phe）和色氨 酸（Trp）残基的苯环含有共轭双键，该共轭双键对紫外光有吸收（其 中最大吸收 Tyr 在 274nm；Phe 在 257nm；Trp 在 280nm） ，从而导致 该蛋白质对紫外光有吸收，且其吸光度值与这三种氨基酸的浓度相 关，从而与蛋白质的浓度相关。 2． 肽键对紫外光有吸收（其最大吸收在 238nm） ，因此蛋白质 溶液在 238nm 的光吸收值与其肽键含量成正比，从而与蛋白质溶液 的浓度相关。 2.2 紫外吸收法测定 DNA 浓度的基本原理 DNA 也为生物大分子， 所产生的紫外吸收也是其分子内的小基 团所引起的，例如嘌呤碱、嘧啶碱等等。 嘌呤碱、嘧啶碱以及由它们参与组成的核苷、核苷酸及核酸 （DNA&RNA）对紫外光都有强烈的吸收作用。它们吸收紫外光的共 同特点是在 260nm 处为最大吸收值。
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的吸收值 A，通过标准曲线法计算出样品浓度。 缺乏 DNA 标准溶液时，可以利用下面的经验公式来计算： C ＝ 50×A260 （ug/mL） DNA 浓度较低时（20—200 ug/mL） ，上述经验公式线性相关性 较好。 同时， 如果存在高浓度的盐、 带共轭双键的有机溶剂和蛋白质， 都会对测量结果产生影响。 3.3 蛋白质/DNA 混合溶液浓度的测定方法 蛋白质和核酸（DNA&RNA）是生物体内最重要的两种物质， 绝大多数生物体内都含有大量的蛋白质和核酸，而且两者紧密相关， 互为依存。从生物体内提取蛋白质时，通常混有核酸；从生物体内提 取核酸时，又通常混有蛋白质，而两者在紫外区又都有吸收，所以在 测定其浓度时， 如果采用上述纯溶液的测定方法， 都会对对方有干扰。 因此，针对这种情况，形成了一些专门测定蛋白质/DNA 混合溶液浓 度的方法。 1．280nm 和 260nm 下的光吸收差法 核酸对紫外光有很强的吸收， 在 280nm 处的吸收比蛋白质强 10 倍，在 260nm 处的吸收更强，核酸 260nm 处的消光系数是 280nm 处 的 2 倍。而蛋白质则相反，280nm 紫外吸收值大于 260nm 的吸收值。 依照蛋白质和核酸分别在 260nm 和 280nm 处吸光度的差异， 可 以依据 A280/A260 判断蛋白质和核酸的比例，如下： 纯蛋白质的光吸收比值：A280/A260 1.8 蛋白质核酸混合溶液： A280/A260 1.8～0.5
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方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再作测定。 3．215nm 和 225nm 下的光吸收差法： 本方法为一个经验公式。 蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm 的光吸收测定 时，可用 215nm 与 225nm 下的光吸收值之差，通过标准曲线法来测 定蛋白质稀溶液的浓度。 吸收差= A215 －A225 测定方法： 测定蛋白质标准溶液在 215nm 和 225nm 处的吸收值， 计算出吸收差，以对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测 定待测样品在 215nm 和 225nm 处的吸收值，计算出吸收差，通过 标准曲线法计算出样品浓度。 在蛋白质浓度 20~100g/ml 范围内，蛋白质浓度与吸光度差值 成正比，其中 NaCl、 （NH4）2SO4 以及 0.1M 磷酸、硼酸和 Tris 等缓 冲液，都无显著干扰作用，但是 0.1N NaOH, 0.1M 乙酸、琥珀酸、 邻 苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的 215nm 光吸收值较大，必须将其浓度 降到 0.005M 以下才无显著影响。 3.2 纯 DNA 浓度的测定方法 DNA 在 260nm 下有最大吸收， 且 A260 值与 DNA 的浓度成正比 例关系。因此，可以根据 DNA 溶液的 A260 值来计算 DNA 溶液的浓 度。 测定方法：测定 DNA 标准溶液在 260nm 处的吸收值 A，以 A 对 DNA 标准溶液浓度作标准曲线， 然后再测定待测样品在 260nm 处
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纯核酸的光吸收比值： A280/A260 0.5 测定方法：对于蛋白质和核酸（以 DNA 为代表）的混合溶液， 直接在 260nm 和 280nm 下测定其吸光度值，由下面的经验公式，即 可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度： 蛋白质浓度 ＝ 1552×A280－757.3×A260 (ug/ml) DNA 浓度 ＝ 62.9×A260－36.0×A280 (ug/ml) 注意： （1）该公式为一系列蛋白与核酸的混合溶液通过统计归 纳出的经验公式，上述四个系数针对不同的情况还需要修正； （2） 该方法受很多干扰物质的影响， 前文所述纯溶液测定方法 的干扰物质都会对本方法产生干扰，如高浓度的盐（如 NaCI）和含 有共轭双键的有机溶剂等等。 2．230nm 和 260nm 下的光吸收差法 依前文所述，蛋白质中肽键在 238nm 下有最大吸收值，可以取 A230 作为其一个近似值， 同时核酸在 230nm 附近也有较强吸收， 因此， 对于蛋白质和核酸 （以 DNA 为代表） 的混合溶液， 可分别测定其 A230 和 A260。 测定方法： 直接在 230nm 和 260nm 下测定其吸光度值， 由下面 的经验公式，即可分别算出蛋白质和核酸（DNA）的浓度： 蛋白质浓度 ＝ 183.0×A230－75.8×A260 (ug/ml) DNA 浓度 ＝ 49.1×A260－3.48×A230 (ug/ml) 与 A280/A260 光吸收差法类似，该公式也是为一系列蛋白与核酸 的混合溶液通过统计归纳出的经验公式， 上述四个系数针对不同的情
3．紫外吸收法测定蛋白质/DNA 浓度的方法
3.1 纯蛋白质浓度的测定方法 1．280nm 下的光吸收法 这是最常用的测定蛋白质浓度的紫外吸收法。 方法依据： 蛋白质分子中的酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸在 280nm 附近具有最大吸收，而且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不

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北京普析通用仪器有限责任公司 应用技术部 2004 年 7 月
目 录
前言：..........................................................................................................1 1．蛋白质/DNA 浓度测定的意义............................................................ 1 2．紫外吸收法测定蛋白质/DNA 浓度的原理........................................1 2.1 紫外吸收法测定蛋白质浓度的基本原理.....................................1 2.2 紫外吸收法测定 DNA 浓度的基本原理......................................2 3．紫外吸收法测定蛋白质/DNA 浓度的方法........................................2 3.1 纯蛋白质浓度的测定方法............................................................2 3.2 纯 DNA 浓度的测定方法............................................................. 4 3.3 蛋白质/DNA 混合溶液浓度的测定方法.....................................5 4．UVWin5.0 软件包测定蛋白质/DNA 浓度的使用方法..................... 7 4.1．启动 DNA 蛋白质测定功能....................................................... 7 4.2．设置测量参数.............................................................................. 8 4.3．处理测量结果.............................................................................. 9 5．影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA 浓度的因素................................9 6．测定蛋白质/DNA 浓度的其他应用方法简介..................................11
大，所以很多蛋白的浓度与 A280 成正比。 测定方法：测定蛋白质标准溶液在 280nm 处的吸收值 A，以 A 对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在 280nm 处的吸收值 A，通过标准曲线法计算出样品浓度。 方法的缺点： （1）干扰物质较多，高浓度的盐（如 NaCI） 、含有共轭双键的 有机溶剂、核酸都会对测量结果产生干扰。因此本方法一般只适用于 纯蛋白溶液（不含其他盐类或其他盐类浓度非常低） 。 （2） 目标蛋白与标准蛋白中所含上述三种氨基酸的含量差别较 大时，测量结果将会产生大的偏差。 值得注意的是，目前该方法的应用已经非常广泛，很多蛋白在 一定浓度和一定波长下的吸光度 A 值都有文献数据可查，因此将所 测吸光度 A 值结合文献数据即可以计算出相应的蛋白质浓度。 2．肽键测定法（A238 法） 蛋白质溶液在 238nm 处的光吸收的强弱， 与肽键的多少成正比， 故此法称为 A238 法。 （有时也可以使用 A230 法取代） 测定方法：测定蛋白质标准溶液在 238nm 处的吸收值 A，以 A 对蛋白质标准溶液浓度作标准曲线，然后再测定待测样品在 238nm 处的吸收值 A，通过标准曲线法计算出样品浓度。 A238 法比 A280 法灵敏，但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、有 机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐、无机 碱或水溶液进行测定。若含有有机溶剂，可先将样品蒸干，或用其他