基因工程抗体
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。
基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。
基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。
这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。
2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。
这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。
3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。
这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。
4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。
这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。
基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。
2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。
3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。
4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。
基因工程抗体
第五章基因工程抗体分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。
抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。
自1975年Milstein和kÖhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。
异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。
随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。
第一节免疫球蛋白概述免疫球蛋白（immunoglobulin）是指具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。
它是介导体液免疫重要的免疫球蛋白分子。
免疫球蛋白可作为B细胞表面跨膜受体，参与膜信号转导，促进B细胞的激活、分化及凋亡。
血浆中分泌型抗体，具有中和抗原、激活补体或介导细胞毒作用等功能。
一、抗体的生成理论侧链学说( Side chain theory)，模板学说(Template theory )，克隆选择学说(clonal selection theory)二、抗体的结构1、轻链与重链Ig分子由两条轻链（light chain,L）和两条重链（heavy chain, H）组成。
轻链的分子量约为24kD，重链的分子量约为55kD或77kD。
轻链的种类有两种，即κ和λ。
基因工程抗体的例子
基因工程抗体的例子
基因工程抗体是通过基因重组技术将特定抗体基因导入至其他生物细胞中，使其具备产生抗体的能力，从而实现大规模生产高效、高纯度的抗体。
以下是一些基因工程抗体的例子：
1. 重组抗体药物：例如，重组人源单克隆抗体药物，如阿达木单抗（Adalimumab）和帕尼单抗（Panitumumab），用于治疗自身免疫疾病和某些癌症。
2. 基因工程抗体治疗疫苗：例如，COVID-19疫苗中使用的mRNA 疫苗，通过基因工程技术将病毒的抗原编码序列导入到人体细胞中，诱导免疫系统产生抗体来抵抗病毒感染。
3. 重组抗体诊断试剂：例如，基因工程技术可用于生产特定病原体抗体，如新冠病毒SARS-CoV-2抗体，用于开发快速诊断试剂盒，帮助早期检测和诊断疾病。
4. 基因工程抗体治疗：例如，CAR-T细胞疗法，通过基因工程技术将患者自身T细胞中的受体基因改造，使其能够识别和杀死癌细胞，用于治疗某些血液恶性肿瘤。
5. 基因工程抗体生产：基因工程技术可用于大规模生产特定抗体，如重组人源单克隆抗体，用于研究和治疗领域。
这些基因工程抗体的例子说明了基因工程技术在抗体研究、生产和
应用中的重要性和广泛应用性。
抗体的人源化
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五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
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多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
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Ig分子的结构模式图
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原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
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一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
基因工程抗体
VH和VL是抗原决定簇结 VH和VL是抗原决定簇结 合位点 高变区 HVR 决定簇互补区CDR 决定簇互补区CDR 骨架区FR 骨架区FR CH1和CL：Ig同种异型 CH1和CL：Ig同种异型 的遗传标志 CH2： CH2：补体结合位点 CH3：某些细胞Fc受体 CH3：某些细胞Fc受体 Fc 结合部位
Ag
ScFv应用 ScFv应用： 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 研究基因结构与功能的关系
三、单域抗体 抗体与抗原的结合主要由Ig 抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定， Ig的 区决定， 因此只含V区基因片段的小分子抗体， 因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只 有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单 VH或 VL一个功能结构域 一个功能结构域， 克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段 克隆抗体的特异性。 就称为单域或单区抗体， 就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个 Ig分子的 12，故也称之为小抗体。 Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。 分子的1
双特异性抗体的特点
* 将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤 部位的效靶比。 * 不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的 杀瘤机制。
2 1
3
提高抗体效应功能
双特异性抗体 抗体融合蛋白
提高抗体 效应功能
细胞内抗体
偶连细胞毒物质
抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代， 抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，
基因工程抗体
四.超变区多肽
抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来 实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小 结构单位。根据这一特点，可以设计出那些 在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多 肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的 结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为 超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal recognition unit, MRU)。
如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
多克隆抗体与单克隆抗体的比较
多克隆抗体
单克隆抗体
来源 动物免疫血清、恢复期病人血 多为鼠源性 清或免疫接种人群
特点 来源广泛、制备容易
纯度高、特异性强、效价高、少 或无血清交叉反应
组成 针对不同抗原表位的抗体的混 针对单一表位，结构和组成高度
HV sequences contact the antigen.
epitope
Ig胚系基因结构特点
在Ig分子多肽 链中，κ型、λ 型轻链和Ig的 重链分别写作 Igκ、Igλ和IgH ，基因依次写 作IGK、IGL和 IGH，其分别 位于第2、22 和14号染色体 上。
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重链: 位于14号染色体，可分为4组
甚少 3.生产成本高,难于普及应用
人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、 建株难、不稳定、产量低、人体不能随意 免疫
新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又 尽量保留原有的抗体特异性。
基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基 因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白 基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细 胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌 合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体 融合蛋白和双特异性抗体。
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体是由人工合成或修改的基因来产生的抗体，也称为重组抗体。
与传统的抗体不同，基因工程抗体不受限于动物来源，可以通过人工合成的方式来获得。
基因工程抗体的制备过程包括选择目标抗原、构建重组抗体基因、转染宿主细胞、高效表达和纯化等步骤。
因为基因工程抗体可以定制化地设计和制备，具有高度特异性和亲和力，因此在生物医学研究、临床诊断和治疗等方面具有广泛的应用前景。
常见的基因工程抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和重组抗体等。
其中，单克隆抗体是指由单一克隆细胞产生的抗体，具有高度特异性和一致性；人源化抗体是将动物源的抗体人源化，避免了人体免疫系统对异种抗体的攻击；嵌合抗体是将两种或以上不同来源的抗体结合起来产生的新型抗体，具有更广泛的抗原覆盖范围和高亲和力；重组抗体则是根据目标抗原的结构和性质，设计并合成新的抗体基因来产生新型抗体，具有更高的特异性和亲和力。
基因工程抗体的发展将会在生物医学领域带来更多的应用和发展机会，同时也将推动基础研究和药物研发的进步。
生物技术制药：抗体工程制药(2)
（4－3）小分子抗体
➢ 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。
➢ 基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的 V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/801/3。
单区抗体
Fab
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab片段抗体：VH+CH1
(2)FV抗体：VH+VL
(3)单链抗体：VH-Linker-VL
➢ Herceptin(贺赛汀):针对HER-2/neu原癌基因产 物的人/鼠嵌合单抗，特异地作用于HER-2受体过 度表达的乳腺癌细胞
（2）改型抗体（人源化抗体）
1. 将小鼠的CDR（互补决定区）序列移植到人 抗体可变区框架中，产生的抗体称为CDR移 植抗体。
重构抗体 (Reshape d Antibody)
(4)单域抗体：VH或VL
小分子抗体有很多优点: ➢ 可以用细菌或酵母菌发酵生产，成本低; ➢ 分子小，穿透力强; ➢ 不含Fc，没有Fc带来的效应; ➢ 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; ➢ 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒
素或酶标抗体等。
(１)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进 入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。
➢ 人源性可达90主体 地位。
➢ 目前该方法是人源化单抗最常用、最基本的方法
问题
➢ 改型单抗亲和力仅为原来鼠抗体的亲和力的1/40 ➢ 亲和力下降，亲和力是影响改型单链抗体应用于
临床的重要因素 ➢ 人Ig分子的框架区一些氨基酸与鼠Ig的CDR区不
协调 ➢ 三维蛋白结构等需进一步丰富
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基因工程抗体及其进展【摘要】着对分子生物学研究和抗体分子结构功能的深入研究,利用细胞工程和遗传工程对抗体分子进行改建并赋予其新的功能,进而开发了新的抗体应用领域,使单克隆抗体技术又向前发展了一步。
基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。
细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。
【关键字词】基因工程抗体人源化抗体小分子抗体广阔的前景基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等) 正逐渐取代动物源性单抗。
随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。
分子生物学技术的发展，推动了免疫球蛋白遗传学的研究。
抗体的研究从原来的血清学方法、氨基酸水平分析发展到大免疫球蛋白基因结构、表达及调控DNA水平的研究，揭示了抗体多样性、等位基因排斥现象、抗体的分泌型和膜结合型形式、H链类别转换以及亲和力成熟机制等多种生物学现象。
自1975年Milstein和kÖhler等人研制出单克隆抗体以来，抗体技术得到了广泛的应用和发展，但在生物研究和临床疾病的治疗中却遇到了一定的困难。
异源性鼠抗体在人体内诱生免疫应答，产生抗小鼠抗体；人单克隆杂交瘤制备困难，生产量少，稳定性差；获得特异性类别抗体比较困难。
随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
抗体产生的技术革命为抗体治疗开辟了广阔的前景。
1、基因工程抗体概述及分类基因工程抗体又称重组抗体, 是指利用重组DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配, 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。
目前报道的基因工程抗体很多, 分类方法不一, 大体可以分为三类。
1．1 完整的抗体分子该类抗体类似于天然抗体分子, 但经改造后更接近于人的免疫球蛋白, 可在一定程度上降低HAMA。
1．1．1. 嵌合抗体(ch imeric an t ibody) 由在基因水平上连接的小鼠抗体V 区及人抗体C 区组成。
这种抗体含75%～ 80% 人抗体, 20% 鼠抗体, 保留了原来鼠源单抗的特异性, 但对人体仍具一定的免疫原性。
1．1．2. 人源化抗体(human ized an t ibody)又称重构型抗体、改型抗体( reshaped ant ibody)或CDR 移植抗体(CDR graf t ing an t ibody) : 通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区(又称互补决定区, CDR) , 使构成抗原结合部位的轻重链各3 个CDR 区是鼠源的, 其余均为人源的。
该抗体对人的免疫原性大大降低, 但与抗原的亲和力也有所下降。
1．1．3. 完整的人抗体(fu lly human an t ibody)这是由人淋巴细胞产生的理想的抗体分子, 不包含任何鼠源成分。
此种抗体不仅完全避免了HAMA 的产生, 而且特异性、亲和力不受影响。
尽管利用人细胞制备单抗的工艺尚不成熟, 但抗体库技术、体外亲和力成熟及转基因动物的研究等, 已使生产完整的人抗体成为可能。
1．2 抗体分子片段小分子抗体片段具有免疫原性低, 分子量小, 易于渗入目标组织及清除, 不与Fc 受体阳性细胞相结合等优点, 并便于发展其他效应, 如与毒素相连, 融合表达免疫毒素; 与放射性同位素相连, 在体内成像定位检查时本底低, 能呈现清晰图像。
1．3 新型抗体分子将抗体的部分片段连接到与抗体无关的序列上或被其他功能性分子所取代, 使这些抗体不仅具有与抗原结合的特性, 还能发挥其他效应。
2 基因工程抗体的临床应用近年来随着生物工程技术的发展,许多基因工程抗体陆续问世,并在医学领域的许多方面都极具应用潜力,如病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、同种异体移植物注射、哮喘、中风和青光眼治疗,尤其在诊断和治疗肿瘤性疾病及抗感染方面优势明显。
2. 1 在肿瘤性疾病诊疗方面的应用放射性标记抗体在肿瘤影像和治疗中很重要,并可有效进行药代动力学评估。
以标记抗体注入人体内显示肿瘤部位抗原与抗体结合的放射浓集称放射免疫显像,由于基因工程抗体如单链抗体、Fab 片段等分子量小、能很快清除、组织穿透力强,所以更适于放射免疫显像。
例如,中等大小的双特异性抗体(60KD) 与半衰期较短的同位素相连,由于清除率快被用于临床影像学。
治疗用的放射性标记抗体如小抗体(90KD) ,和半衰期较长的同位素相连,可在肿瘤部位达到较高浓度,适合用于肿瘤治疗。
2002 年,美国FDA批准了第一株用于肿瘤免疫治疗的放射性标记抗体(Zevalin)上市。
恶性肿瘤的导向治疗,是通过重组技术将抗肿瘤相关抗原的抗体与多种分子融合,这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能。
这些分子包括:放射性核素、细胞毒药物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治疗的病毒。
对肿瘤治疗来说,设计的双特异性抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原,并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞。
此外,抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联,从而增强体内运输和药代动力学。
作为免疫脂质体,转铁蛋白受体抗体可使药物通过血脑屏障到达大脑。
抗体酶复合物作为前体药物也被用于基础肿瘤治疗。
2. 2 基因工程抗体的抗感染作用预防和治疗感染性疾病常用的药物是疫苗和抗生素,但对于一些尚无有效预防及治疗手段的感染性疾病如SARS、AIDS 等,抗体治疗可做为首选方案。
如在治疗AIDS 方面,利用抗体工程技术已成功地制备出HIV病毒整合菌的单链抗体ScAb2219 ,对HIV 病毒感染的早期和晚期具有有效的抑制作用,并可望成为AIDS 基因治疗的有效手段。
呼吸道合胞病毒(RSV) 易引起婴儿呼吸道疾病,如细支气管炎和肺炎,并可引起严重的并发症,目前已有人源化单克隆抗体Palivizumab 经美国FDA 批准上市,临床实验证明无毒、副反应,并可显著降低婴儿的住院率。
我国率先建立了针对SARS 的基因工程抗体库,这对于SARS 的预防、诊断和治疗都将起到重要作用和深远影响。
对于中和其它病原分子,FDA已批准Fab 单体分子作为抗蛇毒药物;scFv 片段和寡克隆复合物作为抗细菌毒素药物。
2. 3 细胞内抗体随着细胞信号转导和抗体工程技术的发展,诞生了细胞内抗体技术。
这项技术是指在细胞内表达并被定位于亚细胞区室如胞核、胞浆或某些细胞器,与特定的靶分子作用从而发挥生物学功能的一类新的工程抗体,最典型的是scFv ,被称为内抗体。
胞内抗体技术主要应用在抑制病毒复制特别是HIV21 复制、肿瘤基因治疗方面,现已逐渐拓展到中枢神经系统疾病、移植排斥和自身免疫性疾病等领域。
体外培养来源于无关供体的角质形成细胞同种移植物用于严重的烧伤病人的治疗,往往会引起排斥反应,而MHC Ⅰ类分子是引起移植排斥的重要抗原。
Mhashikar 等用编码抗MHC Ⅰ单链抗体的腺病毒转染角质形成细胞,结果显示明显降低了MHC Ⅰ的表达,细胞内抗体介导的表型敲除是否有利于同种移植物的存活还需要进一步研究。
2. 4 用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术生物传感器和微阵列技术在不久以后将有可能成为主要的体外诊断技术。
对于大量诊断试剂盒,抗体有高敏感性和高特异性。
从最初的玻璃界面到现在的多种蛋白亲和界面,用于诊断的抗体微矩阵界面不断发展。
随着体外机械人的出现,这一技术将进一步发展,并用于微生物污染、寄生虫和生物病原体的检测。
3 人源性单抗的研制3. 1 噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术是从外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA 或基因组DNA,设计核酸引物,用PCR技术扩增出整套的抗体基因片段如Fab或scFv,通过随即重组,插入噬菌体或噬菌粒表达载体中,与噬菌体外壳蛋白基因PⅢ或PⅧ连接,感染大肠杆菌并以融合蛋白的形式使抗体片段表达展示于噬菌体表面,形成含有全套抗体谱( repertoire)的噬菌体抗体库,利用抗原2抗体特异性结合进行筛选、富集,并扩增所需克隆。
噬菌体展示技术是将编码外源肽或蛋白的DNA片段插入噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面,以利于配体的识别和结合,而插入的DNA片段对噬菌体的生物学特性无大的影响。
3. 1. 1 丝状噬菌体丝状噬菌体包括f1、fd、M13衍生的载体表达系统。
这类噬菌体的基因组为闭合环状的单股正链DNA ( ssDNA) ,基因组DNA的长度可随插入DNA片段大小不同而变化;编码10种蛋白质,它们在分子量和拷贝数上有很大的差别,其中应用较多的是次要衣壳蛋白PⅢ、PⅥ、PⅦ、PⅨ和主要衣壳蛋白PⅧ。
PⅢ是噬菌体的吸附蛋白,每个噬菌体平均含有5个拷贝,分子量为4. 2 ×104 ,其前体在N端含有18个氨基酸的信号肽。
P Ⅲ作为外源性插入部位的优点是装载量大,甚至可容纳5 ×104外源片段;拷贝数少,有利于分离到高亲和性的表位。
PⅧ含量丰富,每个噬菌体含有2 700～3 000拷贝,分子量为5. 2 ×103 ,其前体含有一个23氨基酸的信号肽。
PⅧ作为外源基因插入部位的优点是表达的抗体效价较高,但抗体亲和力较低。
Gao等将VH和VL基因分别连接到PⅦ、PⅨ的N2末端,经重叠PCR扩增、酶切消化后整合入载体,使之在噬菌体表面以异二聚体形式表达,成功地构建了一个噬菌体抗体库。
这类载体表达系统的缺点:一些较大插入片段在增殖时易发生缺失;包装效率低,只有重组DNA链中一条以ssDNA形式合成包装到病毒颗粒;宿主细胞在噬菌体感染后会发生变化3. 1. 2 噬菌粒验室噬菌粒是噬菌体和质粒的混合体,含有单链噬菌体的复制原点和基因间隔区间及至少一种外壳蛋白编码序列( PⅢ或PⅧ) 。
噬菌粒作为载体应用最广泛,其优点:转化率高,比噬菌体高2～3个数量级,可产生大量DNA及抗体蛋白;既可以表达可溶性Fab又可表达附着性Fab;在抗体库扩增时,融合蛋白渗漏表达水平低,毒性小。
但是,此类载体需要有辅助噬菌体来产生单链基因,并组装成有感染力的噬菌粒。
3. 2 核糖体展示核糖体展示技术的核心是利用体外核糖体表达载体构建ScFv 抗体库, 并于体外转录为mRNA,体外翻译表达,随后以固相化的抗原分子亲和筛选出核糖体mRNA2ScFv复合物中的高亲和力ScFv。