10基因工程抗体

2020/4/12
基因工程抗体的制备过程
• 首先是获得抗体基因片段，可从B细胞 DNA库中筛选；用探针从杂交瘤细胞、 免疫脾细胞的DNA库或cDNA库中筛选； 或以PCR法直接扩增等。
• 然后将抗体基因片段导入真核细胞（如 杂交瘤细胞）或原核细胞（如大肠杆菌 ），使之表达具有免疫活性的抗体片段 。
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3．引入辅助因子法
• 很多天然酶活性中心都含有金属离子。Lerner 等将金属离子引入抗体酶，成功地催化了肽键 的选择性水解。
• 用三乙撑胺Co3+盐作为金属离子辅因子，所用 半抗原分子带有一肽键。且通过羧酸根及仲胺 基与金属离子相连。将此半抗原通过共价键连 接在载体蛋白上免疫动物后产生的抗体，在金 属离子复合物作为辅因子的参与下，这些抗体 酶能选择性水解甘氨酸和丙氨酸之ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的肽键， 其转化数达6×10－4。
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优点
• 这类抗体具有分子量小，作为外源性蛋 白的免疫原性较低；在血清中比完整的 单克隆抗体或F(ab)2片段能更快地被清 除；无Fc片段，体内应用时可避免非特 异性杀伤；能进入实体瘤周围的微循环 等优点。
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（四）Ig相关分子
• 原理：可将抗体分子的部分片段（如V区 或C区）连接到与抗体无关的序列上（如 毒素），就可创造出一些Ig相关分子
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• Landry等用可卡因水解的过渡态类似物 －磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗 体能催化可卡因的分解，其催化活性和 血液中催化可卡因的丁酰胆碱酯酶差不 多，水解后的可卡因片段失去了可卡因 刺激功能。因此，用人工抗体酶的被动 免疫也许能阻断可卡因上瘾，达到戒毒 目的。
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• 这种单抗与反应物的过渡态结合降低了 反应的活化能，从而加速该反应的进行 。如催化碳酸脂水解的抗体MOPC167即 以此法制备。
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2．抗体结合位点化学修饰法
• 对抗体酶进行结构修饰的关键是找到一种温和 的方法在抗体结合位置或附近引入具有催化功 能的基团。
• 游离巯基就是适合的基团之一，它具有高亲核 性，易于氧化，及能通过二硫化物进行交换反 应或亲电反应而选择性修饰的特点。
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• 在亲和性和结合特异性方面，抗 体－抗原的相互作用与酶-底物的 相互作用相似。
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• 抗体与处于稳定、低能构型的抗原作用，而酶 与处于不稳定、高能的过渡态底物结合。酶结 合能量帮助打开底物分子的化学键。
• 抗体酶的结构应该与底物过渡态互补。但这种 过渡态往往只存在短时间，所以研究者必须先 制备底物过渡态的稳定低能类似物，然后制备 抗体酶。
1. 将小鼠杂交瘤细胞的免疫球蛋白(Ig)VH基因与人Ig的 CH基因连接
2. 导入骨髓瘤细胞，使之表达嵌合重链 3. 再将小鼠杂交瘤细胞的Ig VL基因与人的CL基因相连 4. 转染含嵌合重链的小鼠骨髓瘤细胞 5. 筛选分泌鼠－人嵌合抗体的骨髓瘤细胞
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所分泌的嵌合抗体与原杂交瘤细胞分 泌的抗体特异性和亲和力相同，但减 少了抗体中的鼠源性成分
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（五）噬菌体抗体（phage antibody ）
• 噬 菌 体 表 面 展 示 技 术 （ phage display technology）。
• 是将已知特异性的抗体分子的所有V区基 因在噬菌体中构建成基因库，用噬菌体 感染细菌，模拟免疫选择过程，具有相 应特异性的重链和轻链可变区即可在噬 菌体表面呈现出来。
（二）重构抗体（reshaping antibody ）
• 目的：为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗 体内的含量
• 改造：将鼠抗体的超变区基因嵌入人抗 体 Fab 骨 架 区 的 编 码 基 因 中 ， 再 将 此 DNA片段与人Ig恒定区基因相连，然后 转染杂交瘤细胞，使之表达嵌合的V区抗 体。
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催化抗体（catalytic antibody ）
• 催化抗体也叫抗体酶（abzyme），是具 有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗体 的高度选择性和酶的高效催化性
• 1986年Lerner和Schultz两个研究小组各 自独立发表了他们关于抗体酶的第一篇 报告以来，抗体酶的研究已取得了相当 广泛的成功。
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应用事例
可将有治疗作用的毒素或化疗药物取代抗体 的Fc片段，通过高变区结合特异性抗原，连 接上的毒素可直接运送到靶细胞表面，起 “生物导弹”的作用。
Byrn构建的“CD4免疫粘附素”即是这一类 抗体分子，他是将CD4基因与IgG1 C区在体 外重组而表达出的Ig相关分子，它可封闭人 HIV gp120蛋白与CD4＋ T细胞的结合，在治 疗人的爱滋病上具有潜在价值。
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4．基因工程抗体技术
• 该技术在抗体酶制备中具有诱人的前景 。应用噬菌体抗体展示技术或全套抗体 基因库，并辅以计算机模拟，为筛选特 定目的高效催化抗体提供了丰富的资源 和技术支撑。
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（三）催化抗体的应用
• 用病毒特异蛋白质片段的过渡态模拟物 免疫动物，产生能特异水解病毒蛋白质 的抗体酶，使病毒无法繁殖，从而达到 预防和治疗的目的。
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• 催化抗体制备技术的开发预示着可以人 为生产适应各种用途的，特别是自然界 不存在的高效催化剂，对生物学、化学 和医药等多种学科有重要的理论意义和 实用价值。
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（二）催化抗体的制备
• 催化抗体（抗体酶）技术是化学和免疫 生物学的研究成果在分子水平交叉渗透 的产物，是将抗体的极其多样性和酶分 子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质 分子设计的新方法，故而显示出较高的 理论和实用价值，成为酶工程领域中的 研究热点。
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展望
• 基因工程抗体由于将抗体基因置于人的操作之 下，抗体分子的大小、亲和力的高低、对细胞 毒性的强弱，以及是否接上其它有用的分子等 都可根据治疗和诊断的要求进行设计，这是杂 交瘤技术所不及的，因此有着强大的生命力结束仅依靠免 疫获得抗体的状况。
• 本质：实际上也就是在人抗体可变区序 列内嵌入鼠源抗体的高变区基因序列， 通过这种置换为人类抗体提供了一个新 的抗原结合部位。
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（三）单链抗体（single-chain antibody ）
• 又称FV分子。 • 目的：基因工程手段构建更小的具有结
合抗原能力的抗体片段，即FV分子或单 链抗体蛋白。 • 本质：是由VL区氨基酸序列与VH区氨基 酸序列经肽连接物（linker）连接而成。 此外肽连接物还可将药物、毒素或同位 素与单链抗体蛋白相融合。
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目前基因工程抗体有
• 嵌合抗体（chimeric antibody） • 重构抗体（reshaping antibody） • 单链抗体（single-chain antibody） • Ig相关分子 • 噬菌体抗体（phage antibody） • 全套抗体（the immunoglobulin repertoire）基
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目前制备催化抗体有以下四种方法：
• 1．细胞融合法 • 2．抗体结合位点化学修饰法 • 3．引入辅助因子法 • 4．基因工程抗体技术
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1．细胞融合法
• 首先通过化学反应合成反应物的过渡态 类似物，这类类似物通常是半抗原，经 与载体蛋白偶联，研制针对该过渡态类 似物的特异单抗，亦即抗体酶。
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• 随着DNA重组技术以及其它分子生物学 技术的发展，人们利用基因工程技术来 制备抗体分子，这种抗体分子称为基因 工程抗体，这是分子水平的抗体。
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优点
• 是按人类设计所重新组装的新型抗体分 子，可保留或增加天然抗体的特异性和 主要生物学活性，去除或减少无关结构 （如Fc片段），从而可克服单克隆抗体 在临床应用方面的缺陷（如鼠源单克隆 抗体在人体内使用会引起抗体产生而降 低其效果，Fc片段的无效性和副作用）
因库
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（一）嵌合抗体（chimeric antibody ）
• 嵌合抗体是指在同一抗体分子中含有不 同种属来源抗体片段的抗体，又称杂种 抗体。
• 迄今构建的嵌合抗体多为“鼠－人”类 型，也就是抗体的Fab或F(ab)2来源于鼠 类，而Fc片段来源于人类。
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嵌合抗体制备过程简介