实验三 柠檬酸发酵实验
柠檬酸发酵的原理
柠檬酸发酵的原理柠檬酸是一种有机酸，化学式为C6H8O7。
它常见于柠檬、橙、柚子等柑橘类水果中，具有酸味和鲜味。
柠檬酸的发酵是指通过微生物在适宜环境条件下对柠檬酸底物进行代谢分解，产生新的化合物、气体或能量的过程。
柠檬酸发酵的过程可以分为两个阶段：引入柠檬酸菌和发酵反应。
首先，柠檬酸发酵的关键是引入柠檬酸菌。
柠檬酸菌是一类嗜酸性细菌，它们广泛存在于自然界中，常见于各种水果、土壤、植物等环境中。
这些细菌具有代谢柠檬酸的能力，并能分解柠檬酸为其他代谢产物。
在适宜的生长条件下，柠檬酸菌会在培养基中生长和繁殖。
柠檬酸菌需要一定的温度、pH值以及营养物质供应，如碳源、氮源、矿物盐等。
这些条件对于维持菌体生长和代谢活性都非常重要。
当柠檬酸菌引入培养基后，它们会开始与柠檬酸底物进行代谢，进而引发柠檬酸的发酵。
柠檬酸发酵可产生以下代谢产物。
首先，柠檬酸菌代谢柠檬酸的初始酶是柠檬酸酶，将柠檬酸分解为顺式-脱氢异柠檬酸。
柠檬酸酶存在于柠檬酸菌的细胞内。
随后，顺式-脱氢异柠檬酸经过酶促反应被还原为'顺式'脱氢酶异柠檬酸，再被脱氢酶反应转化为柠檬酸。
接下来，由于柠檬酸发酵过程中柠檬酸的分解和合成是相互竞争的，此时代谢产物多取决于柠檬酸菌生长条件的调节。
在有氧条件下（即有足够的氧气供应），柠檬酸将被完全代谢为二氧化碳和水，释放能量。
此时发酵的产物主要是气体，如二氧化碳。
这种情况下，柠檬酸发酵可以在其它微生物中应用。
然而，当在缺氧条件下进行柠檬酸发酵时（如在发酵罐中），由于氧气供应不足，柠檬酸菌会进一步代谢柠檬酸。
在此情况下，发酵的产物主要是有机酸，如乳酸、丙酸等。
这种发酵过程称为无氧呼吸。
结合柠檬酸菌自身特点和提供的环境条件，可以选择调控发酵过程中柠檬酸的转化路径，实现不同发酵产品的生产。
总结起来，柠檬酸发酵的原理是通过引入柠檬酸菌并在适宜条件下提供营养物质，利用柠檬酸菌的代谢能力，将柠檬酸转化为新的化合物。
柠檬酸发酵及产物提取
综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。
但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。
二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。
3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。
4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。
5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。
6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。
四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。
2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。
3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。
7 麦明谦 柠檬酸的发酵
柠檬酸的发酵一．实验简介柠檬酸又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸或2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，是水果中含量极为丰富的一种有机酸。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸，黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径为：首先将玉米中的淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP途径转变为丙酮酸，丙酮酸再由氧化酶氧化成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰CoA,然后在柠檬酸合成酶的作用下生产柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰离子等金属离子的条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA循环中的a-酮戊二酸脱氢酶受到阻遏，TCA循环变成“马蹄形”代谢汇集于柠檬酸处，使柠檬酸大量积累，达到生产的目的。
二．实验的试剂和材料玉米淀粉、黑曲霉、a-淀粉酶、水、碳酸钙、无菌水、0.1429mol/LNaoH、酚酞指示剂三．实验仪器及设备三角瓶300ml 、玻璃棒、电子称、摇床、水浴锅、高压灭菌移液管、带塞的三角、接种环四．实验步骤1.黑曲霉孢子悬液的制备:(1)培养基的配制①配方：硝酸钠1.5g 磷酸氢钾0.5g 硫酸镁0.25g 氯化钾0.25g 硫酸亚铁0.005g 蔗糖15g 琼脂10g 蒸馏水500ml PH 5.0-6.0②称量：按照培养基配方，依次准确地称取药品，放入烧杯中。
③熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述烧杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。
④定容：将加热后的培养基倒入量筒中，用自来水进行定容，至500ml。
⑤调PH：待培养基稍冷却后，用精密的PH试纸测量培养基的原始PH，若偏酸，用1mol/LnaoH边滴边加边搅拌，使之达到PH5.0-6.0；若偏碱，则用1mol/L调节。
⑥分装：用分装装置将培养基装入培养皿中，高度在培养皿高度的三分之一左右。
⑦灭菌：将培养皿用牛皮纸包扎好，放在0.1Mpa，121℃，20min 高压蒸汽灭菌。
实验三 柠檬酸发酵
实验二柠檬酸发酵【课前预习】复习微生物学及实验过程、发酵工程、生物分离工程所学到的微生物培养及生物物质分离的分离方法，了解影响微生物生长及生物物质提取过程中的各种影响因素。
【实验目的】1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；3. 通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
【实验要求】1. 10-15 人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
2. 总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
其理论反应式为：C6H12O6+1.5O2C6H8O7+2H2O【实验用品】1. 实验主要仪器设备摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；析天平；蒸发器；分光光度计；比色管；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡萄糖；草酸铵结晶紫液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
发酵工程应用实例 柠檬酸发酵
a 麸曲培养基： 新鲜小麦麸皮1kg，加水1.1~1.3L。液体培养基与第二级扩大培 养基所用液体培养基相同。 b琼脂固体培养基： 与斜面培养基相同。
② 表面发酵
（1）一般发酵法 • 根据菌种的产酸能力，液层一般在8~12cm，一次性发酵至结束。
（2）置换法 • 一次发酵结束，将酸液从菌膜下排走，然后在菌膜下通入无菌
水，静止1小时，待菌膜中酸液渗入水中，排走洗水至贮酸桶， 再通入置换液，液层视菌种生产能力而定，一般在6~8cm。
② 表面发酵
（3）添加法 • 有两种方法：一是分菌膜生长期和产酸期，生长期的液层3cm左右，
a 浅盘发酵
③ 固体发酵
a 浅盘发酵
• 浅盘固态发酵在发酵室内进行，发酵时也叫曲房，需要配置 无菌空调设备，室内放置盘架，以8~10层为宜，架盘层垂直 间距为15~20cm。
• 浅盘发酵的容器可以采用发酵盘（曲盘、竹盘等）曲盘的厚 度在6~8cm，材料可以是木质，铁质或不锈钢等，盘底最好是 多孔篩板，以利于通气。
在薯干粉发酵柠檬酸中，初始pH不加调节,约5.5。当接入菌 种后，菌种生长繁殖，消耗氮源和铵离子，使培养基的PH下降， 前期pH下降较快，活力强的菌种微生物培养12h后，ph可以降至 2.5-3.0，24小时后可以降至2.2-2.3，这时会有少量的柠檬酸产 生，但要到48小时后柠檬酸才大量产生，才使pH下降至2.0以下。
• 置换法一般是采用糖浓度低而营养较丰富的培养液先培养菌盖， 待菌盖形成之后再更换发酵培养基。可更换1次也可数次，发 酵液用来提取柠檬酸。
柠檬酸发酵实验
食品生物工程与设备实验指导书编者：西北农林科技大学食品科学与工程学院二00九年五月《生物工程与设备》综合性实验大纲一、实验课开设目的。
通过综合性实验要求学生掌握发酵的过程及发酵产物的分离提取的方法及一般步骤，增强学生的动手能力，培养工程素养。
二、实验课学时分配。
本课程总学时36，其中讲课27，综合性实验6。
序号实验题目学时1柠檬酸的发酵、提取及精制6合计6三、实验课教材、参考数目1、理论讲授教材梁世中主编,生物工程设备,中国轻工出版社,2002年2月。
2、实验指导书自编实验指导书3、参考书(1)程丽娟,薛泉宏,微生物学实验技术,兴界图书出版公司,2000年4月。
(2)贾世儒主编，生物工艺与工程试验技术，中国轻工业出版社，2002年9月。
四、实验内容及要求实验柠檬酸的发酵、提取及精制(6学时)柠檬酸的发酵一、目的要求了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产方法。
二、基本原理用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等。
本实验以糖为发酵原料，黑曲霉为产生菌。
黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强。
ph1.6～1.7时尚能生长。
且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以在pH2-3为宜。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等。
若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中和法测定柠檬酸发酵中的总酸。
柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
三、实验材料1．菌种黑曲霉斜面菌种3支。
2．器材柠檬酸发酵培养液硝酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS040.25g，蔗糖150g，lmol／L HCl17ml，水1000ml。
取100ml上述培养液，加入500ml三角瓶中，包扎灭菌。
Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L／L H2S04中)；0.1mol／L标准NaOH 0.1mol／L H2S04;酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml 量筒；广泛pH试纸；玻璃棒；牛角勺；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平。
柠檬酸液态发酵及提取工艺
柠檬酸液态发酵及提取工艺综述摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。
液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。
发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。
国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。
关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺一、前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。
分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。
极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。
柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。
另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。
它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。
柠檬酸发酵
柠檬酸发酵【实验目的】 1. 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸液体发酵及中间分析方法。
2. 了解并记录黑曲霉培养过程中培养基中基质的变化与产物的形成情况；【实验原理】黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化生成乙酸和二氧化碳，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬合成酶的作用下生成柠檬酸。
黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄形”，代谢流汇集于柠檬处，使柠檬酸大量积累并排出菌体外。
【实验用品】1. 实验主要仪器摇床；离心机；超净工作台；恒温培养箱；灭菌锅；分析天平；蒸发器；分光光度计；容量瓶；滤布；布氏漏斗；滴定管；水浴锅；试管、烧杯、500ml 三角瓶等若干0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，0.1429mol/LNaOH，1%酚酞试剂，pH 计，3,5 二硝基水杨酸试剂，葡液(A 液：1％结晶紫95％酒精溶液：B 液：1％草酸铵溶液。
取A液20mL，B 液80mL混合，静置48 小时后使用2. 材料菌种黑曲霉【方法步骤】1.柠檬酸发酵菌种培养基1升（蔗糖合成培养基：蔗糖140g， NH4NO3 2g， KH2PO4 2g， MgO4.7H2O 0.25g， FeCl3.6H2O 0.02g， MnSO4.4H2O 0.02g，麦芽汁20ml，用水定溶至1000ml）分装、灭菌。
1.4 接种活化的黑曲霉孢子（约0.5%）接种入培养基中，在33-36℃，200-300r/min的摇床中20h左右，培养后菌体浓度应达60万～150万/ml，菌丝球为致密形的，菌球直径不应超过0.1mm，菌丝短，且粗壮，分支少，瘤状，部分膨胀为优。
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实验三柠檬酸发酵实验
一、目的要求
1.了解利用黑曲霉生产柠檬酸的原理与流程，掌握柠檬酸的发酵生产工艺与发酵分析方法。
2. 通过本实验能较熟练地掌握真菌发酵的接种、培养与发酵产物的分析测定等技术。
二、基本原理
CH2—COOH
｜
1.柠檬酸结构式：HO—C—COOH
｜
CH2—COOH
柠檬酸分子式：C6H8O7
2. 黑曲霉产柠檬酸多，耐酸力强；pH1.6~1.7时尚能生长，且酸度大时产生葡萄糖酸、草酸等副产物较少，故进行柠檬酸发酵时，培养液以pH2~3为宜。
用于柠檬酸生产的原料有淀粉、废糖蜜等；本实验以糖等为发酵原料，黑曲霉为产生菌（合成途径见图1）。
在一般发酵中，均产生多种酸，其中，低碳链的直链脂肪酸如甲酸、乙酸等称为挥发酸，而乳酸、柠檬酸等称为非挥发酸。
挥发酸和非挥发酸的总和称总酸。
酸的测定方法常采用中和法、电位滴定法及比色法等；若待测液色泽很深，可采用外指示剂法。
本试验用中柠檬酸的定性检验用Deniges试剂。
2C6H12O6+3O2→2C6H8O7+4H2O
HOOCCH2C(OH)(COOH)CH2COOH+3NaOH———NaOOCCH2C(OH)(COONa)CH2COONa+3H2O
三、实验材料
1．菌种黑曲霉斜面菌种。
2．实验器材
0.1mol/L标准NaOH；0.1mol/L H2S04；
Deniges试剂(HgO 1g溶于20ml 0.2L/L H2S04中)（有毒）；
酒精灯；滤纸，漏斗；烧杯：200ml，500ml；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，滴管，天平。
3. 柠檬酸发酵培养基：硫酸铵2.0g，KH2P04 1.0g，MgS04 ·7H2O 0.25g，蔗糖150g，水1000ml；pH控制在5.5~6.5左右，加1mol／L NaOH约2滴。
取50ml上述培养液，加入250 mL三角瓶中，包扎灭菌，待用。
四、实验步骤（实验内容）
1．菌种活化：
菌种活化：对于已长久保存的菌种，需经斜面培养基活化培养一次，即取保存的斜面菌种黑曲霉，移至斜面培养基，经25~28℃斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子。
发酵用的种子制备：用同样方法，移接斜面培养基，得到的培养物作为发酵用的种子。
2. 种子液的制备：取活化好的斜面菌种，无菌操作（不要在无菌室），取5ml无菌水至黑曲霉斜面，用接种环轻轻刮下孢子，轻轻振荡制成孢子悬浮液。
3．发酵：无菌操作（不要在无菌室），取柠檬酸发酵培养基（液）3瓶，吸取3 ml孢子悬浮液接种于柠檬酸发酵培养液中。
摇床转速250 rpm，26~28℃摇床培养5~7d，另1瓶不接种留作对照。
观察发酵过程中pH的变化并记录。
（注意：当pH3左右是积累柠檬酸的最佳时期）
4．发酵液预处理
取发酵液经过滤将3瓶培养液过滤，菌丝用蒸馏水略加洗涤后弃去。
5. 发酵产物的检验与分析
定性检验：取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液l mL，在酒精灯上缓缓加热至沸。
逐滴加入20 g/L KMn04溶液，若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。
6．柠檬酸含量的初步测定
酸度滴定法：将过滤液充分摇匀，用吸管吸取10ml放入150ml三角瓶中，加2滴酚酞指示剂，用0.1mol/L NaOH滴定酸度。
对照亦按同法滴定。
二者消耗NaOH毫升数的差额乘以0.64，即得柠檬酸(g／L)的大约数。
计算公式：C NaOH×(V滴定发酵液-V滴定对照) ×10-3
C柠檬酸= ━━━━━━━━━━━━× 192
3 × 10 ×10-3
式中 C柠檬酸――柠檬酸的浓度(g／L)
C NaOH――NaOH标准溶液浓度(mol／L)
V滴定发酵液――滴定发酵液所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)
V滴定对照――滴定对照所用的0.1mol／L NaOH标准溶液体积(m1)
五、实验结果与与讨论
1、影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因素有哪些？
2、记录发酵过程产酸变化情况并进行结果分析(pH变化曲线)；
3、柠檬酸定性、定量测定结果与分析，并对菌种产酸能力等进行评定。