检测马西尼罗热病毒抗体的重组E蛋白-ELISA的建立
elisa的基本原理方法类型及应用
elisa的基本原理方法类型及应用酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种免疫学的诊断技术，属于发光免疫分析（ FIA）的一种，它能判断待测物质是否含有某种抗原或抗体。
ELISA 是由分子生物学家Peter Perlman在 1969 年发明的，它是由免疫学家和检验室专业人士经过不断改进和发展形成的一种常见的检测工具。
ELISA 试验有三个主要步骤：配制板（Prepare Plate）、抗体配体结合（Antibody-Antigen Binding）和检测（Dectection）。
首先在特定医学实验室中将待测抗原或抗体与其他分子结合在反应基片或其他特定容器上。
随后，将特异性的抗体结合该特定的抗原或其抗体，以形成特异性的蛋白质复合物；最后，将一种特定的发光抗体，经过特定的化学或物理反应，与试剂相结合，从而检测到这种抗原和其抗体。
ELISA 有两种基本类型：一种是检测抗原的ELISA，也被称为酶免疫吸附法（EIA）；另一种是检测抗体的ELISA，也被称为免疫印迹分析（IIA）。
酶免疫吸附法（EIA）的主要特点是反应的时间比较短，因此可以快速地检测特定抗原。
它的原理是将适当浓度的待测抗原与抗原试剂相结合，然后将相互作用的悬液加到对应的孔板上，再将对应的特异性抗体悬液加到孔板中，当抗体与抗原发生作用时，会形成一个抗体复合物，并产生一个抗原复合物；最后，将作用到抗原复合物上的特异性发光强度肽或其他发光物质，最终显示出抗原浓度水平，以便进行分析。
而免疫印迹法（IIA）的主要特点是可以对相对浓度较低的抗体进行检测，可以精确地评估特定的抗体水平。
原理是将含有特定酶质的试剂加到孔板上，然后将抗原悬液加入酶质中，将含有特定抗体的悬液加入酶质中，当与特定抗原结合时，形成抗体复合物，将特定发光抗体结合到抗原复合物上，从而检测特定抗体水平。
ELISA 应用非常广泛，在生物学、药物学、流行病学等一些领域中都有应用，并且能够检测出抗原和抗体的小量组分，能够准确的检测出抗原和抗体，从而更有效的同时体现出检测的准确性。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析生物样本中的特定蛋白质、抗体或其他分子。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂准备、样本处理、板涂覆、洗涤、标记物添加、洗涤、底物添加和测量等步骤。
二、实验前准备1. 准备所需试剂和材料，包括ELISA板、标准品、样本、缓冲液、洗涤缓冲液、底物液等。
2. 检查仪器设备是否正常工作，如酶标仪、洗板机等。
3. 温度控制，确保实验室温度稳定在适宜的范围内。
三、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需要，配制适当的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三乙胺缓冲盐水）、BSA（牛血清蛋白）溶液等。
2. 标准品的稀释：根据实验要求，将标准品按照一系列浓度稀释，制备标准曲线。
四、样本处理1. 收集待测样本，如血清、尿液等。
2. 根据实验要求，对样本进行预处理，如离心、稀释等。
五、板涂覆1. 取出ELISA板，将每个孔加入适量的涂层抗体或抗原，覆盖整个孔底。
2. 将板密封，放置在4℃的冰箱中，静置一夜或按照实验要求的时间。
六、洗涤1. 取出ELISA板，将涂层液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
七、标记物添加1. 向每个孔加入适量的标记物，与待测物相互作用。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，使标记物与待测物结合。
八、洗涤1. 取出ELISA板，将标记物液倒掉。
2. 向每个孔加入适量的洗涤缓冲液。
3. 将洗涤缓冲液倒掉，重复此步骤3次，确保洗涤干净。
九、底物添加1. 向每个孔加入适量的底物液，使其与酶标记物反应。
2. 将板密封，放置在室温下静置一段时间，观察颜色的变化。
十、测量1. 使用酶标仪测量每个孔的吸光度值。
2. 根据实验设计和标准曲线，计算出待测样本中特定物质的浓度。
十一、数据分析与结果解释根据测量结果和标准曲线，进行数据分析和结果解释，得出实验结论。
一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒[发明专利]
![一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/d05236c3bd64783e08122bdf.png)
专利名称：一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒专利类型：发明专利
发明人：陈西钊,孙明,张丽,马永缨,迟立超,秦亚嫚申请号：CN201410690160.3
申请日：20141125
公开号：CN104498438A
公开日：
20150408
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒，本发明获得了分泌西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.8508，所得到的西尼罗病毒单克隆抗体具有灵敏度好、特异性强、效价高等优点，可用于鉴定待测病毒是否为西尼罗病毒，鉴定待测样本是否含有西尼罗病毒。
所述单克隆抗体可用于制备西尼罗病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。
申请人：北京世纪元亨动物防疫技术有限公司
地址：100094 北京市海淀区北清路68号院中区13号楼
国籍：CN
代理机构：北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司
代理人：曹治丽
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马疱疹病毒1型gG蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用
动物医学进展,021 ,42(4)=31-34Progress in Veterinary Medicine马疱疹病毒1型gG 蛋白间接ELISA 检测方法的建立及应用王旭蕾，胡 月，加尔肯，车传忠，刘建华，郑学功，王雪竹，冉多良*收稿日期：2020-05-07基金项目：新疆农业大学研究生科研创新项目(XJAUGR2018020)作者简介：王旭蕾(1993 — )，女，新疆库尔勒人，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治工作。
*通讯作者(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052)摘 要：为了解新疆马疱疹病毒1型(EHV-1)的流行情况，需要建立一种检测抗体的间接ELISA 方法。
采用纯化后EHV-1 XJ2015株的g G 蛋白作为检测抗原，优化反应条件后建立检测EHV-1血清抗体的间接ELISA 方法，并对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验及商品化试剂盒的应用效果对比。
结果表明，该方法仅与EHV-1阳性血清发生反应，不与马疱疹病毒4型、马流感病毒和马动脉炎病毒阳性血清发生反应，血清稀释1 ：1 600后，仍可以检测到阳性，组内及组间变异系数均小于5% .与试剂盒进行检测结果比 较，符合率为93.35%。
建立了 EHV-1 g G 蛋白间接ELISA 检测方法，可为EHV-1的快速诊断、流行病学调查及防控工作提供技术支撑。
关键词：马疱疹病毒1型；gG 蛋白；间接ELISA ；抗体检测中图分类号：S852.652文献标识码：A 文章编号：007-5038(202 1 )0，1-003 1-01马鼻肺炎(Equine rhinopneumonitis , ER)是马属动物的发热性急性传染病的总称.引发该病的病原体主要是马疱疹病毒1型(EHV-1)和马疱疹病毒4型(EHV-4)[12]. EHV-1是一种引起马匹不同临床综合征的病原体，具有高度传染性，主要引起呼吸 系统和神经系统疾病的发生，母畜流产和新生儿死亡[34°近年来，新疆的马产业在不断地发展，据2014年一2017年新疆地区的调查显示，ER 在新疆广泛流行，严重制约着新疆养马业的发展. EHV-1引起的疾病发病率和病死率较高，但却没有针对EHV-1的血清学检测方法[511],对EHV-1的防控工作带来巨大的困难. gG 基因部分氨基酸的同源 性低可区分EHV-1和EHV-4[12-13]，由于两种病毒之间广泛的免疫交叉反应[14],在实验室常规检测 中，无法从血清学角度区分[1].目前国外已有商品化的EHV-1/4的ELISA 抗体分型试剂盒，但价格昂 贵,不适用于大量检测血清样本，而国内没有类似的试剂盒[1215].因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏 感且能大量检测血清样本的EHV-1抗体的方法。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法
操作步骤如下： （1） 将特异性抗体与固相载体联结 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质
（2） 加受检标本 保温反应 标本中的抗原与固相抗体结合 形成固相抗原抗体复合物 洗涤除去其他未结合物质
（3） 加酶标抗体 保温反应 固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关
ELISA 方法的基本原理和操作步骤
自己收集整理的 错误在所难免 仅供参考交流 如有错误 请指正！谢谢 ELISA 方法的基本原理和操作步骤 基本原理
1971 年 Engvall 和 Perlmann 发 表 了 酶 联 免 疫 吸 附 剂 测 定 （enzyme linked immunosorbent assay ELISA）用于 IgG 定量测定的文章 使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中 微量物质的测定方法 这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 在测定时
是为阳性反应
（六）应用亲和素和生物素的 ELISA 亲和素是一种糖蛋白 可由蛋清中提取 分子量 60kD 每个分子由 4 个亚基组成 可以和 4 个生物素分子亲密结合 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin） 生物素（biotin）又称维生素 H 分子量 244.31 存在于蛋黄中 用化学方法制成的衍生物 生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化 的产物 亲和素与生物素的结合 虽不属免疫反应 但特异性强 亲和力大 两者一经结合就极为稳定 由于 1 个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置
快速检测西尼罗病毒胶体金免疫层析试纸条方法的建立
免疫层析试纸条由样品垫 、结合垫 、硝酸纤维 素膜及吸收垫 4个部分组成 。样品垫和结合垫用玻
璃纤维 ,吸收垫用吸水滤纸 。以浓度为 1. 38mg /mL 的兔抗 WNV NS1蛋白多克隆抗体在硝酸纤维素膜 上划线作为质控带 ; 以浓度为 0. 9mg /mL 的 WNV NS1蛋白在硝酸纤维素膜上划线作为检测带 ,参数 0. 1μL /mm 划线 ,指控带与检测带间距约为 7mm。 划线后 ,将硝酸纤维素膜置于 37℃培养箱中孵育 2h。将吸收垫 、样品垫及结合垫 、硝酸纤维素膜叠 加 ,组装成完整的层析条 , 然后切割层析条 , 宽度
关键词 西尼罗病毒 ;胶体金试纸条 ;免疫层析法 中图分类号 R181. 2
Establishm en t of the Rap id D etection of W est N ile V irus w ith Gold - imm unochroma tography W ang Yanfang1, 2 , J iang Baoqin2 , Xing Fubin2 , Yang Pengfei2 , Zhang L ip ing2 , Ping Ruijin2 , X ian Q ingjie1, 2 , Hu Kongxin2
检测马传贫病毒跨膜蛋白主要免疫决定区抗体间接ELISA诊断方法的建立
摘 要 ：本试验 以纯化的重组马传 贫病毒跨 膜蛋 白主要免疫 决定区蛋 白作 为诊 断抗 原建立 了间接
ＥＩ ＬＳ Ａ诊断方法， 确定其最佳工作条件为每孔包被重组抗原 ２ ｇ兔抗马 Ｉ ， ｇ Ｇ酶标抗体以 １： （（ 血清以 ４ ）） （， ） １： ０ ４ 倍稀释 ， 底物作用时间为 １ ｍ ｌ判定标准为 Ｐ Ｎ值大于 ２ 且 Ｏ ｆ ｉ； １ ｌ ／ ， Ｄ值大于 ｎ ． ２的血清为阳性 ， 否则判 为 阴性 。本 试验 所建 立的诊 断 方法 与琼扩 试验 以及 以琼扩 抗原 作 为 包被 抗原 的 Ｅ ＩＡ试验 进 行 了比较 ， ＬＳ 表 明该诊断方法敏感性更高。特异性和重复性试验表明该诊断方法具有良好 的特异性 和重复性。通过对 ４匹
（．ａｂｎ ｅ ｒ ａ ｅｅｒｈ ｎｔｕｅ ｆ Ａ Ｓ Ｈ ｒｉ １００ ， ｈ ａ２ ｈ ａｏａ ｒ ｎｍ ｌ ｅａｈ ｅｔｆ ａ ｉ Ｍｅｉ ｌ １ ｒｉＶ ｔ ｉ ｌ Ｒ ｓａｃ ｓｔｔｏＣ Ａ ， ａｂ ５ ０ １Ｃ ｉ ； ． ｅ ｂｒｔ ｙ ｉ ａ Ｄ ｐｒｎ ｎ ｏ Ｈ ｒ ｎ ｄ ａ Ｈ ｅｎ７ Ｉ ｉ ｎ ｎ Ｔ Ｌ ｏ Ａ ｂ ｃ Ｕ ｉ ｒｉ， ｒｉ １０ ０ ，ｈｎ） ｎｖ ｓｙ ｂｎ ５ ０ １ ｉ ｅ ｔＨａ Ｃ ａ
ｏ ｔ ＭＴ ｒｔｉ ｃａｅ ｇｔｅ ａ ｂｔ ｎｉｈ ｒｅ ｇ ｏｊｇｔ ｉ ｅｏｉａｅ ｓ１ ０ ， ｅ ｅａ ｒ １ ０ ｆｈ Ｔ Ｒｐｏ ｎ ｏｔ ｉ ２ ，ｈ ｂ ｉａ ｔ ｏｓ Ｇｃ ｎｕａｅ ｗｔ ｐ ｒｓ ｓ ： ０ ０ ｔ ｒ ｅ ： ｅ ｅ ｄｓ ｒ － Ｉ ｄ ｈ ｄ ｉ ４ ｈ ｓ ａ ４
０Ｄ ｖ ｌ ｅｏ ｅ ． ａ ｅｅ ｍｉ ｅ ｓ ｃ ｍｐ ｅ ｅ ｓ ｅｐ ｓｔ ｅ ｓａ ｄ ｒ ｏ ｅ ＥＬ Ｓ Ｔ ｅ ｉ Ｌ Ｓ Ｓｍｏ ｅ ｓ ｎ ｉ ｖ ａｕ ｖ ｒ ２ ｗ ｓｄ ｔｒ ｎ ｄ ａ ｏ ｒｈ ｎ ｉ ｏ ｉ ｖ ｔｎ ａ ｄ ｆｒｔ Ｉ Ａ． ｈ Ｅ Ｉ Ａ ｉ ０ ｖ ｉ ｈ ｒ ｅ ｓｔ ｅ ｉ
检测马白细胞介素-18双抗体夹心ELISA方法的建立
ＩＳ １０ ８ ３ 胞 与 分 子免 疫 学 杂 志 （ ｈｎＪＣ ｌＭｏ Ｉ ｍ ｎ１２ ０ ， ４＂ Ｓ Ｎ ０ ７— ７ ８细 Ｃ ｉ ｅ ｌｍ ｕ ｏ）０ ８ ２ ［ ｌ ４
・
论著 ・
文章 编号 ： ０ ７— ７ ８ ２ ０ ）４— ３４— ３ １０ ８ ３ （ ０ ８ ０ ０ ６ ０
毒表达的重组 马 ＩＮ ＾ Ｈ ｅＦ 一 和杆状病毒表达的重组 Ｆ一 ｙ（ ｙＩＮ ）
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疫学研究 提供 了方法 ， 为下一步 Ｅ Ｌ１ ＬＳ 也 Ｉ 一８Ｅ ＩＡ试剂 盒 的商
品化 开 发 Biblioteka 定 了坚 实 基 础 。 ｎｌｉ ｉ均购于 ＰＥ Ｃ ｙ ｔｎＫｔ ａｏ ＩＲ Ｅ公 司； Ｒ Ｈ Ｐ标记的链霉 亲和素和邻
苯二胺 （ Ｐ ） Ｏ Ｄ 均购于 Ｓ ｍ ｉ ａ公司；健康的和感染 ＥＡ ｇ ＩＶ的马血 清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所周建华研究员惠赠。
１２ 方 法 ．
［ 关键词］ 马白细胞介素一８ 单克 隆抗体 ；夹心 Ｅ ＩＡ １； ＬＳ ［ 中图分类号］ Ｒ ９ ．１ ３２ １ ［ 文献标 识码 ］ Ｂ
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农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(2):323~326*基金项目： 奥运科技 （2008） 行动计划专项 （No.2004BA904B06） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.高级兽医师， 博士， 主要从事动物及动物产品的检验检疫研究。
Email ： ＜jiangyan@ ＞ 收稿日期：20060413 接受日期：2006712 ·研究论文· 检测马西尼罗热病毒抗体的重组 E 蛋白 ELISA 的建立 *姜 焱 1 **, 张常印 1 , 王凯民 1 , 张敬友 1 ,唐泰山 1 , 陈国强 1 , 张鹤晓 2(1.江苏出入境检验检疫局，南京 210001;2.北京出入境检验检疫局， 北京 100021) 摘要： 重组质粒pETE 转化大肠杆菌（ ）BL21(DE3)， 经1.0mmol/L IPTG 诱导， 外源基因以包涵体的形式获得高效表达。
通过 Western blot 检测证明表达产物具有良好的抗原性。
以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板， 建立了检 测西尼罗热病毒(WNV)抗体的间接 ELISA 方法。
结果表明， 抗原的最佳稀释度为8.6滋 g/mL ， 血清的最佳稀释度为1颐 100， 待检 血清阳性标准初步定为：＞2.1×的样品判为阳性。
用此方法检测了450份血清样品， 结果全为阴性。
关键词： 重组E 蛋白；马西尼罗热病毒抗体； 间接 ELISA 中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:10061304(2007)02032304Establishment of a Recombinant E Protein ELISA forDetecting the Antibody of EquineJIANG Yan 1 **,ZHANG Changyin 1 ,WANG Kaimin 1 ,ZHANG Jingyou 1,TANG Taishan 1 ,CHEN Guoqiang 1 ,ZHANG Hexiao2The recombinant pETE plasmid,which includes the gene fragment of the part region of Equine(WNV)'s E protein,was transformed intoBL21(DE3),and expressed in very high level as inclusion body after induced with1.0mmol/L IPTG.The indirect ELISA for detecting WNV E protein antibody was established after the antigenicity of the recombinant protein was proved by Western blot.The optional working circumstances for the ELISA (antigen concentration 8.6滋 g/mL;serum di lution 1颐 100)were tried out with chess titration.The tested serum of positive criterion of this ELISA was(the tested serum)/(the negative serum)>2.1.Four hurdred and fifty samples were detected by this method and the results werenegative.Equineantibody;recombinant E protein;indirect ELISA西尼罗病毒( ,WNV)是 1937 年 12月从非洲乌干达西尼罗地区 1 例发热女患者的血液 标本中首先分离的，并因此而得名(Smithburn .，1940)。
最初， 人们只认为它是非洲的一种地方病， 直 到 1957 年以色列发生 WNV 脑膜脑炎爆发后， 才真 正认识到该病毒的危害。
此后WNV 感染波及非洲、 欧洲、 中东、 西亚、 中亚、 大洋州和北美洲等广大地 区， 流行呈扩大趋势(Adernson.， 1999； Hubalek， 1999)。
马是易感动物，且感染的死亡率达 35%。
美国目前通过使用一些检测方法对鸟、蚊子、 人类等宿主进行定期监控，以达到预防的目的。
我国 至今尚未发现本病， 但具有感染和传播该病的环境，值得提高警惕， 防止该病毒从国外传入。
目前检测人的 WNV 方法有 RTPCR 、荧光 RTPCR 、 NASBA 、 中和试验、 ELISA 等，但检测马的 WNV 的方法至今未见报道。
因此迫切需要一种简 便、 迅速， 便于应用的诊断试剂盒， 以满足我国用于 临床样品的监控。
ELISA 方法具备快速、 高效、 特异 性强、灵敏度高等优点，可以同时检测多份血清样 品。
E 蛋白是 WNV 病毒粒子表面最重要的结构蛋 白， 其表面的抗原决定簇与保护性免疫、 血凝反应和 血清特异性、 膜融合、 病毒的毒力、 宿主范围、 组织嗜 性有关。
本实验利用 IPTG 对含有 E 蛋白抗原域的原核农 业 生 物 技 术 学 报 2007年表达载体 pETE进行诱导表达， 并利用 His·Bind R Purification Kit对表达产物进行了纯化， 同时， 通过 方阵滴定初步建立了检测 WNV抗体的间接 ELISA 方法， 并对临床样品进行了检测， 为试剂盒的标准化 和商品化奠定基础。
1材料和方法1.1 质粒、 宿主菌及血清重组质粒 pETE为自行构建， 通过 RTPCR方 法扩增马西尼罗病毒( ,WNV)的部分 E蛋白基因，经过测序证实该基因以完整的阅读框 正确的插入到 pET32a表达载体多克隆位点 R玉和 d芋位点中；大肠杆菌（ ） BL21为本室保存； 马的 WNV阳性血清和阴性血清 自行制备；待检血清由北京出入境检验检疫局和南 京农业大学提供。
1.2 试剂DAB显色试剂盒购自南京生工生物工程有限 公司；抗马的二抗为武汉博士德生物工程有限公司 产品；His·Bind R Purification Kit为 Novagen公司 产品， 其它试剂均为分析纯。
1.3IPTG 诱导表达按文献 （Sambrook， 1989） 进行诱导。
各取 出马的 MNV阳性血清和阴性血清 1mL,12000 r/min离心 30s,弃上清，沉淀重悬于 100滋 L1伊 SDSPAGE凝胶电泳上样缓冲液中， 100 ℃变性 3 min， 进行 SDSPAGE电泳。
1.4 表达产物的纯化按照 His·Bind R Purification Kit说明书进行。
1.5MNV 高免血清的制备按参考文献 （殷震和刘景华， 1997） 用 WNV的 灭活病毒与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等量混 合， 制成油包水疫苗免疫 2kg以上的雄兔。
初免 10 d后，用弗氏不完全佐剂与 WNV的灭活病毒制成 油苗再免疫 3次， 最后一次免疫 7d后采血， 分离血 清， -20 ℃保存。
1.6 表达产物 Western blot 实验按文献 （Sambrook， 1989） 的方法进行。
1.7 间接 ELISA 检测方法的建立间接 ELISA方阵测定按文献（Smithburn, ., 1940） 的方法进行。
根据间接 ELISA方阵结果确定 抗原、抗体的最适稀释度，蛋白抗原稀释至 8.6滋 g/mL， 待检血清、 阳性血清和阴性血清作 1颐 100稀 释。
2结果 2.1pETE 载体的构建将 pET32a(+)、 RTPCR产物用 R玉和 d 芋消化的酶切产物回收、 连接、 转化、 提取质粒， 用 R玉和 d芋消化，经琼脂糖凝胶电泳可看到 318和 5900bp2条带， 与所设计的大小相符(图 1箭头所示)。
图 1.重组表达载体的酶切鉴定Fig.1.Identification of recombinant expression vector byrestriction enzyme digestion1and4,marker DL2000and marker Ⅳ;2and3,recombinant expression vectors digested by R玉and d芋.2.2 表达产物的 SDSPAGE重组质粒 pETE转化 BL21， 经 IPTG诱 导后， 获得高效表达。
如图 2显示， 在 32kD处出现 1条明显的蛋白条带， 大小与预期结果相符， 其它 3个对照均无该蛋白带。
图 2.表达蛋白的SDSPAGE分析Fig.2.SDSPAGE of protein expressed from recombinantplasmids in BL21(DE3)1,BL21(DE3);2,pET32a(+);3,pET32aE(uninduction);4,pET32aE (expressed products after4h induced by1mmol/L IPTG);5,proteinmarker.2.3 纯化后表达产物的 SDSPAG E用 6倍柱体积 1伊Elute Buffer洗脱目的蛋白。
取小量进行 SDSPAGE，结果在 32kD处出现 1条 清晰的特异性蛋白条带， 杂蛋白很少(图 3)， 表明表 达产物的纯化良好。
2.4Western blot 检测324第 2 期 姜 焱等: 检测马西尼罗热病毒抗体的重组 E 蛋白ELISA 的建立 表 1间接 ELISA 滴定结果Table 1The results of the indirect ELISA titration1~6,1颐 100； 1颐 200； 1颐 400； 1颐 800； 1颐 1600； 1颐 3200； 7~12,1颐 100； 1颐 200； 1颐 400； 1颐 800； 1颐 1600； 1颐3200,respectively. 对表达产物进行 Western blot 分析，结果与 WNV 特异性猪抗血清呈现阳性反应(图 4)，且无非 特异性条带出现， 证明表达产物抗原性较好。