PAS染色液糖原染色液实验原理方法 PH1144 Phygene
糖原染色实验
1. 掌握糖原染色的原理、操作、 注意事项、 结果判断及临床意义；
2. 熟悉正常细胞、病理细胞的染色情况及临 床意义。
糖原染色(过碘酸---雪夫氏反应法) periodie acid-PAS
原理：
细 胞 内 糖 类 (1,2- 乙 醇 基 )→ 过 碘 酸 ( 氧 化 ) →双醛基 + Schiff液→无色品红→紫红色化 合物定位于胞浆。
试剂：
1. PAS固定液：含甲醇等 2. PASⅠ液：含过碘酸等 3. PAS Ⅱ液：含碱性品红、偏重亚硫酸钠 4. 苏木素复染液：
操作：
1. 涂片滴加固定液5~8滴，5分钟流水冲洗待干； 2. 滴加Ⅰ液染色10分钟，流水冲洗待干； 3. 放置入Ⅱ液内室温暗处放置30分钟，流水
冲洗数分钟； 4. 苏木素复染8~10分钟，流水冲洗待干，镜检。
结果判断：
阳性---细胞胞浆内出现红色沉淀物 （颗粒、块状物或均匀红色）
阴性---胞浆内无红色沉淀物–) →早幼粒→中性分叶粒阳性渐强； 嗜酸粒颗粒本身不着色，但颗粒间的胞浆 呈红色；嗜碱粒(+)大小不一颗粒；
2.红系：( – )；淋巴系：多数(+)； 3. 单核系：原单( – )，幼单+成熟单(+)~(++)； 4.巨核系：红色颗粒或红色团块(+)；
注意事项
1. 标本和器材应避免带醛基和还原性的物质
污染，以免假阳性；
2. 滴加Ⅰ液后水洗应充分，涂片完全干燥后 才能放置入Ⅱ液内。
作业
实验要求、原理、操作步骤、 实验结果、注意事项、讨论
血小板细颗粒状或小团块状(+)。
临床意义：
1. 帮助鉴别巨红细胞贫血和红白血病：前者(–)，后者(+) 2. 帮助鉴别急性白血病：
三种糖原染色方法的灵敏度比较
三种糖原染色方法的灵敏度比较【关键词】糖原染色；过碘酸-席夫反应；高碘酸-雪夫反应；雪夫试剂；PAS 法糖原染色对鉴别诊断急性白血病、骨髓增生异常综合征等血液病具有重要价值[1]。
糖原染色法的雪夫试剂配制方法有多种，包括标准法[2]、亚硫酰氯法[3]及陈啸梅法(冷配法)[4]等典型方法。
遂对3种染色法的灵敏度进行比较，以避免选用不灵敏的方法。
1 材料与方法1．1 实验方法取同一患者的骨髓片3张，分别用标准法、亚硫酰氯法及陈啸梅法雪夫试剂进行糖原染色。
为了确定特别重要的雪夫试剂(Schiff液)质量，必须统一反应条件以进行准确比较，即3种染色法骨髓片均选用95%乙醇固定15 min、10 g/L(44 mmol/L)过碘酸22℃氧化60 min[5]、入雪夫试剂(席夫染液)中22℃水浴染色60 min[5]等最关键步骤。
1．2 患者选择及计算积分患者共20例。
其中，慢粒(CML)、原发性血小板增多症(ET)、缺铁性贫血(IDA)及特发性血小板减少性紫癜(ITP)共5例，急性淋巴细胞白血病L1型(L1)、L2型(L2)共8例，急性早幼粒细胞白血病完全缓解(M3CR)仅1例，巨幼细胞贫血(MA)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、溶血性贫血(溶贫)共6例，均以中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞判断阳性程度[1]及计算积分(阳性指数)[1]。
1．3 统计学分析对积分结果进行随机区组设计资料的Friedman秩和检验，以标准法为共同对照组进行多样本的两两比较。
用PEMS 3．1统计软件分析。
2 结果标准法(1组)、亚硫酰氯法(2组)及陈啸梅法(3组)积分均数及中位数依次降低(见表1)，随机区组设计资料的Friedman秩和检验示校正χ2=27．564 1，P=0．000 0，说明1～3组染色积分相比较差异具有极显著性；以1组为共同对照组进行多样本的两两比较(q’检验)，1组与2组q’值为1．976 4，P＜0．05，1组与3组q’值为5．138 7，P＜0．01。
糖原(PAS)染色
糖原(PAS)染色[原理]过碘酸能使细胞内乙二醇基氧化成二醛，醛基与雪夫氏溶液起反应，使无色品红结合成红色反应，沉着含糖原的细胞结构上，标本上所能显红色的糖类主要为多糖包括糖原、糖蛋白、粘多糖和糖脂等。
[试剂](1)由上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司提供。
(2)试剂组成:固定液4.5ml；过碘酸溶液20ml；雪夫氏溶液20mg。
(3)苏木素。
[操作](1)新鲜或陈旧血片、骨髓片于固定液内3-5分钟，水洗、晾干。
(2)滴加过碘酸于涂片上氧化10分钟，水洗、晾干。
(3)放入雪夫氏溶液中，置37度水浴箱5-10分钟。
(4)取出后流水冲洗10-20分钟，晾干、镜检。
(5)苏木素复染。
[结果观察]糖原在细胞浆内可染成红色，其判断标准随细胞不同而异。
有核红细胞判断：(-)：无红色阳性颗粒和浅红色物质。
(+)：胞浆中有少数分散红色阳性颗粒，或呈浅红色反应，比正常红细胞色深。
(++)：胞浆中有1或2个浓的红色颗粒环，或胞浆中有1一10个中等大的颗粒，或弥漫的红色物。
(+++)：胞浆中有11—20个红色中粗颗粒或染深红色。
(++++)：胞浆中红色颗粒明显增多且较粗，致密或呈紫红色物质。
淋巴细胞的判断:(-)：胞浆内无粉红色颗粒。
(+)：胞浆内有1一10个红色小颗粒或弥漫的浅红色物质。
(++)：10个以上红色颗粒。
编写：胡芙蓉制定日期：2009.01.01(+++)：胞浆中含有较多红色颗粒及小块紫红色物质。
(++++)：胞浆中含许多红色颗粒及小块紫红色物质。
[临床意义](1)用于营养性巨幼细胞贫血与红(白)血病的鉴别，前者的正常红细胞及有核红细胞常为阴性，而后者可呈强阳性反应。
(2)用于鉴别急性淋巴细胞性白血病与急性非淋巴细胞性白血病，前者的原淋巴细胞和幼稚淋巴细胞可见大块红色物质。
后者的原始阶段细胞常为阴性。
(3)高雪氏细胞呈强阳性，而尼曼匹克氏细胞呈微弱阳性。
[附注](1)雪夫氏液变红即不能再用，以免细胞出现假阳性。
糖原的显示(PAS)反应
切片经二甲苯和各级酒精复水后，入0.5%的过碘 酸溶液中作用15分钟，取出后水洗。
注意：过碘酸的氧化是整个实验中最关键的步骤，过碘酸的作用时间与反应 环境温度有关，当室温较高时，反应较快，过碘酸的作用时间应适当缩短， 当室温较低时，反应较慢，过碘酸的作用时间应适当延长。
糖原的显示(PAS反应)
山东师范大学生命科学学院 邢维贤
❖ 实验目
目的要求
• 通过PAS反应，了解糖原显示的基本原理、 方法以及糖原在细胞中的分布。
实验用品
1．器材：石蜡切片机，盖玻片、载玻片、染色缸等． 2．试剂
切片充分洗净后入Schiff‘s试剂中进行显色。作用15分 钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将 切处理品入三级新配制的亚硫酸中进行冲洗，取出后 水洗，镜检。
对照片的设置
• 为了确保实验结果的可信性，在实验中需 设置阴性对照片。
• 对照片在复水后，用唾液淀粉酶37℃水解 30—60分钟，取出后水洗，再入过碘酸处 理。
实验结果
实验报告
• 绘图表示糖元在细胞中的分布情况； • 在实验过程中，过碘酸处理能起到什么作
用，它和Feulgen反应中HCl的作用有何异 同？
糖原D-PAS染色液(淀粉酶消化法)
糖原D-PAS 染色液(淀粉酶消化法)简介：糖原染色是病理学中常规的染色方法之一，McManus 在1946年最先使用高碘酸-雪夫技术显示黏蛋白，该法常用来显示糖原和其他多糖，该染色试剂盒不仅能够显示糖原，还能显示中性黏液性物质和某些酸性物质以及软骨、垂体、霉菌、真菌、色素、淀粉样物质、基底膜等。
糖原D-PAS 染色液的特点在于糖原PAS 染色之前经淀粉酶处理，糖原消化时需要两张相同的切片，脱蜡后一张切片用含有淀粉酶的适当缓冲液处理，另一张仅用缓冲液处理。
然后两张切片均用PAS 法染色，消化后染色消失表明存在糖原。
组成：操作步骤(仅供参考)：1、两张相同切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇入水。
2、一张切片入37℃淀粉酶溶液处理1h 。
3、流水冲洗两张切片各5～10min 。
4、入过碘酸溶液，室温放置。
5、自来水冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次。
6、入Schiff Reagent ，置于室温阴暗处浸染。
7、自来水冲洗10min 。
8、入Mayer 苏木素染色液染细胞核。
9、(可选)酸性乙醇分化液分化。
10、自来水冲洗，更换蒸馏水清洗使其返蓝。
11、二甲苯透明，中性树胶封固。
编号 名称DG0009 5×50ml DG0009 5×100ml Storage试剂(A): 淀粉酶溶液 50ml 100ml 4℃ 试剂(B): 过碘酸溶液 50ml 100ml 4℃ 避光 试剂(C): Schiff Reagent 50ml 100ml 4℃ 避光 试剂(D): Mayer 苏木素染色液 50ml 100ml 4℃ 避光试剂(E): 酸性乙醇分化液 50ml100ml RT使用说明书1份染色结果：糖原、中性，唾液黏蛋白红紫色各种糖蛋白红紫色未处理的切片，糖原呈亮红色或红紫色；淀粉酶处理的切片，糖原阴性。
注意事项：1、切片脱蜡应尽量干净，否则影响染色效果。
需使用一张阳性对照片验证酶的活性。
2、过碘酸氧化时间不宜过久，氧化时温度以18～22℃最佳。
过碘酸-雪夫(PAS)染色
过碘酸-雪夫（PAS）染色实验原理胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodicacid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于细胞内多糖所在处。
该反应称为过碘酸-雪夫(PAS)阳性反应，以前也称为糖原染色。
实验方法材料：1.高碘酸氧化液：HIO4·2H2O1g,蒸馏水加至100ml。
此液溶解后保存于冰箱中待用。
2.Schiff试剂：将1g碱性品红溶于200ml煮沸的蒸馏水中。
摇荡5分钟，冷却至600C左右，过滤，并向滤液中入1mol/LHCl20ml，混匀。
冷至 250C时，加2g偏重亚硫酸钠（或钾）（Na2S2O5）。
将此液置带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24小时。
加1g活性碳，摇动1分钟，滤纸过滤。
保存于冰箱中。
3.亚硫酸液100g/L偏重亚硫酸钠6ml1mol/L盐酸5ml蒸馏水100ml每次用前新鲜配置。
4.20g/L甲绿甲绿2g蒸馏水加至100ml5.淀粉酶嚼石蜡刺激分泌唾液离心取上清液，内含淀粉酶，将麦芽糖淀粉酶0.1~1.0g溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.0）100ml中。
方法：1.固定新鲜干燥的涂片用品5%乙醇固定10min，蒸馏水冲洗，待干；2.如涂片需要消化，可加唾液或麦芽糖淀酶，置室温消化60min，然后用蒸馏水冲洗；3.10g/L高碘酸氧化15～20min,蒸馏水冲洗，待干；4.置雪夫染液中室温染色30～60min；5.用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用自来水冲洗2～3min，待干；6.20g/L甲绿复染10～20min；7.水洗，待干，镜检。
实验结果计算（1）中性粒细胞糖原含量参考标准：（-）胞质无颗粒（+）胞质呈淡红色，无颗粒（++）胞质呈红色，有少量颗粒（+++）胞质呈暗红色，颗粒较密（++++）胞质呈紫红色，颗粒极密（2）淋巴细胞系：大多数淋巴细胞呈阴性反应，少数为（+）的阳性反应。
PAS染色法
PAS染色法—概况、原理PAS染色法概况PAS染色法（P eriodic A cid-S chiff stain）在组织学上,主要用来检测组织中的糖类。
过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。
PAS染色法原理PAS染色又称过碘酸雪夫染色，糖原染色。
一般用来显示糖元和其它多糖物质。
原理：过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛,再与Schiff氏液的无色品红结合，红色，定位于胞浆上。
PAS染色法—应用、制作PAS染色法—应用随着医学实验技术的发展，近年来,糖原染色应用的范围更加广泛,如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质，心肌病变及其他心血管疾病的诊断,糖原累积病诊断和研究，糖尿病的诊断和研究,用于某些肿瘤的诊断等。
除用于糖原的鉴定和黏液的显示外，还可以观察肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液物质、阿米巴滋养体和霉菌的着色。
临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据.PAS染色法-制作1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精Carnoy固定液：纯酒精60 ml冰醋酸10ml氯仿30ml2. 染色液1）过碘酸酒清夜配法: 过碘酸(HIO .2H O）0.4g95％酒精35ml M/5醋酸钠(2。
72g+蒸馏水100ml）5ml蒸馏水10ml。
保存于冰箱内，用棕色瓶,可用两周.2）Schiff氏液：0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中，时时摇动三角瓶5分钟，使之充分溶解。
冷却至50℃后过滤，加入10毫升1N盐酸。
冷却至25℃,加入0.5—1克偏重硫酸钠，在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存。
3）Schiff氏酒精液配置Schiff氏液11.5ml1N HCI 0。
5ml纯酒精23ml4) 亚硫酸水1％偏重亚硫酸钠10ml1N HCI 10ml蒸馏水180ml的树胶溶解。
PAS染色法-实验效果准备1、10g/L过碘酸液2、Schiff染液：碱性品红0.5g ，DH2O 100ml煮沸后，待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品红溶解,冷至50℃加入1M的盐酸20ml，混匀。
糖原PAS染色液使用说明
糖原PAS染色液使用说明1.储存条件：-保持在室温下阴凉、干燥的地方；-避免阳光直射。
2.试剂配制：-糖原PAS染色液由两部分组成：糖原PAS染色液A和糖原PAS染色液B。
两者混合后即可使用。
-将糖原PAS染色液A和糖原PAS染色液B以1:1的比例混合。
3.样本制备：-取细胞样本，例如组织切片或细胞悬液；-依据实验需求，将样本制备成厚度为3-5μm的组织切片；-如果使用细胞悬液，则需要将细胞悬液离心，将沉淀后的细胞制备成细胞块。
4.染色步骤：-取一个玻片，将制备好的组织切片或细胞块平铺在玻片上；-用去离子水或磷酸缓冲液轻轻洗涤玻片上的样本，去除杂质；-用组织纸轻轻吸去多余的水分；-用移液管将糖原PAS染色液滴在样本上，确保样本完全覆盖；-在室温下将标本浸泡于糖原PAS染色液中15-30分钟。
时间过长可能导致染色过度；-将玻片用去离子水轻轻冲洗几次，以去除未结合的染色剂；-用组织纸轻轻吸去多余的水分。
5.染色结果观察：-将制备好的玻片在显微镜下观察；-糖原呈现红色至紫色的细小颗粒，分布在细胞质中；-根据颗粒的密度和分布情况，可以初步评估细胞内糖原的积累程度。
6.染色控制：-在染色过程中，正常细胞应该在细胞质中有较少的糖原颗粒；-通过对正常对照样本进行染色，可以确定阴性对照的糖原表达水平；-阴性对照样本应不显示糖原颗粒或仅有极少量的糖原颗粒。
7.离子蓝后染色：-如果需要对细胞核进行染色，可以在糖原染色后使用离子蓝（如伊红或核快蓝）进行核染色；-样本浸泡在离子蓝染色液中5-10分钟；-将玻片用去离子水轻轻冲洗几次，然后用组织纸吸去多余的水分；-在显微镜下观察并拍摄所需的染色结果。
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PH1144|PAS染色液（糖原染色液）
Glycogen(PAS)Stain kit
Catalog No：PH1144Size：☐4×50mL|☐4×100mL Store at RT
糖原染色是病理学中常规的染色方法之一，McManus在1946年最先使用高碘酸-雪夫技术显示黏蛋白，该法常用来显示糖原和其他多糖，该染色液不仅能够显示糖原，还能显示中性黏液性物质和某些酸性物质，以及软骨、垂体、霉菌、真菌、色素、淀粉样物质、基底膜等。
过碘酸（又称高碘酸）是一种强氧化剂，它能氧化糖类及有关物质中的1，2-乙二醇基，使之变为二醛，醛与Schiff试剂能结合成一种品红化合物，产生紫红色。
由于高碘酸还可氧化细胞内其他物质，使用时应注意选择好高碘酸浓度和氧化时间，使氧化控制在即能把乙二醇基氧化成醛基，又不至于过氧化，这是很关键的步骤。
本糖原PAS染色液的特点：采用特有配方技术，大大增强了染色效果；性能稳定，特异性强；操作简捷，仅需1h左右。
试剂组分
Components4×50mL4×100mL Storage
试剂（A）过碘酸溶液50mL100mL4℃避光
试剂（B）Schiff Reagent50mL100mL4℃避光
试剂（C）苏木素染色液50mL100mL RT避光
试剂（D）酸性乙醇分化液50mL100mL RT
Manual1份1份/
自备材料：1、10%福尔马林固定液；2、蒸馏水；3、乙醇
有效期12个月
使用参考
1、常规固定，常采用10%的福尔马林，常规脱水包埋。
2、石蜡切片脱蜡入蒸馏水；冰冻切片直接入蒸馏水。
3、自来水冲洗2～3min，再用蒸馏水浸洗2次。
4、置于过碘酸溶液中，室温放置5～8min，一般不宜超过10min。
5、自来水冲洗1次，再用蒸馏水浸洗2次。
6、样本放入Schiff Reagent，置于室温阴暗处，浸染10～20min。
7、自来水冲洗10min。
8、样本置于苏木素染色液中，染细胞核1～2min。
9、酸性乙醇分化液分化2～5s。
10、自来水冲洗10～15min后，更换双蒸水清洗，使其返蓝。
11、逐级常规乙醇脱水。
二甲苯透明，中性树胶封固。
染色结果
PAS反应阳性物质（糖原或多糖）红色或紫红色
细胞核蓝色
细胞质深浅不一的红色
备注：颜色深浅很大程度上取决于样品在过碘酸溶液和Schiff Reagent中作用时间的长短。
阴性对照(可选)：
1、取淀粉酶1g溶解于PBS(pH5.3)100ml，处理30～60min，与其他切片共同入过碘酸溶液。
结果应为阴性。
2、(备选方案)取唾液片(过滤后用)处理30～60min，与其他切片共同入过碘酸溶液。
结果应为阴性。
3、(备选方案)如果对照片采用其自身样本，对照片不经过碘酸溶液这一步，直接入Schiff Reagent。
结果应为阴性。
注意事项
1、切片脱蜡应尽量干净，否则影响染色效果。
2、过碘酸氧化时间不宜过久，氧化时的温度以18～22℃最佳。
3、过碘酸溶液和Schiff Reagent应置于4℃密闭保存，使用时避免接触过多的阳光和空气。
使用前，最好提前30min取出恢复到在室温后，避光暗处使用。
4、酸性乙醇分化液应经常更换新液，其分化时间应该依据切片厚薄、组织的类别和酸性乙醇分化液的新旧而定，另外分化后自来水冲洗时间应该足够。
5、在过碘酸溶液和Schiff Reagent中作用时间非常重要，该依据切片厚薄、组织的类别等决定。
6、本染色液常用于常规组织切片染色，对于真菌、细胞、极其薄的切片，建议采购糖原PAS染色试剂盒（细胞真菌专用），因为其过碘酸溶液和苏木素溶液浓度更低，不宜过染。
7、冷冻切片染色时间尽量要短。
8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。