PCR电泳结果宽带的原因分析
PCR常见问题、原因分析及其对策
镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。
电泳拖带的原因
电泳拖带的原因电泳出现拖尾现象电泳出现拖尾现象，英文成为smear，就是弥散。
琼脂糖凝胶电泳拖尾是怎么回事？1：样品浓度过高。
这种情况稀释一下就行了。
提质粒的时候常出现这种情况。
2：蛋白杂质阻碍DNA的泳动。
提基因组DNA时常出现这种情况。
以上两种情况，拖尾都是在电泳条带的后面。
3：样品破碎或是被降解4：存在RNA这两种情况，拖尾都是在电泳条带的前面。
PCR产物电泳拖尾，主要从以下两个方面考虑：1、PCR产物自身原因：往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。
对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP 的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
2、电泳体系的问题：（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。
（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。
（3）电压太高。
（4）适当把你的胶的浓度加大。
（根据你的片断大小而定）（5）观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照。
PCR拖尾及假阳性的原因及对策拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
PCR产物电泳结果分析
产物检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
假阴性，不出现扩增条带：PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。
PCR条带弥散原因
1、PCR体系中存在污染2、电泳槽中电泳缓冲液不净3、电压不稳定4、如果PCR的模板是经过酒精提取的质粒等相关DNA，则酒精没有除净5、退火时间过长或过短，延伸时间过短等配1000ml的DEPC处理水，加1mlDEPC。
磁力搅拌器搅拌过夜。
第二天高压蒸汽灭菌 121摄氏度，25min DEPC分解成二氧化碳和酒精，封闭冷藏备用。
最好分装小瓶来用，尽量避免污染。
你的PCR结果电泳弥散，可能是非特异性扩增多，即出现非特异性扩增带。
也就是：PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度不合适（有些帖子一味的说Mg2+离子浓度过高会引起非特异性扩增，这是问题的一个方面，Mg2+离子浓度过低也同样会引起非特异性扩增）、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关（过多循环一般是超过25次循环）。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：首先可以提高镁离子的浓度，由1.0mmol/L起以0.05mmol/L为单位逐渐上升，最高不超过10.0mmol/L。
提高镁离子的浓度无效的话，调整引物浓度（你的PCR结果电泳拖尾，可能是非特异性扩增多，因此应适当降低引物浓度），适当增加模板量，减少循环次数。
减低酶量或调换另一来源的酶。
适当提高退火温度。
以上都不行则要重新设计引物。
每种调整均可以分梯度进行PCR优化问题汇总PCR在产物序列中引入了错误？参考见解：1 聚合酶忠实性低：使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
2 循环数太多：降低循环数。
3 四种dNTP的浓度不同：制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。
使用预混合物。
PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象？参考见解：1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。
电泳原因分析
1.cDNA产量的很低可能的原因：*RNA模板质量低*对mRNA浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足*同位素磷32过期*反应体积过大，不应超过50μl2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系*与反应起始时RNA的总量及纯度有关*建议在试验中加入对照RNA*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。
由于RNA 模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。
3. 产生非特异性条带*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。
在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
4. 产生弥散（smear）条带*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。
5. 产生大分子量的弥散条带*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）6. 在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。
RT-PCR的电泳荧光条带分析
RT-PCR的电泳荧光条带分析本实验是应用于 RT- PCR 的电泳荧光条带分析方面。
本实验所要研究的核心问题是 PCR 的结果如何与已知基因的 DNA 相对比，由此找出 PCR 扩增子之间的差异和缺失的基因序列，最后确定基因突变类型、位点以及进一步研究其功能的可能性等。
在生物化学中， PCR 的意思是聚合酶链式反应，也就是将 DNA 聚合酶加到含有引物的 DNA 上，通过聚合酶的作用使单链 DNA 断裂成为具有一定长度和一定碱基序列的 DNA 片段，这些片段被不同特异性的酶切割并连接起来形成扩增产物，然后再经过电泳检测产物的荧光强度，根据产物的荧光强度，从而判断是否存在突变或者基因的缺失等信息。
在生物体内，基因组 DNA 的复制主要依靠 DNA 聚合酶，它能够催化多个脱氧核苷酸的延伸，这种酶具有专一性，只识别特定的核苷酸序列，且能够自我复制。
因此，在 PCR 反应中，当 DNA 聚合酶与引物相互配对时，会发生单链的延伸，但随着 DNA 聚合酶的逐渐延伸， DNA 链上某一区域的核苷酸数目越来越少，直至该区域完全被切除，这样，经 PCR 扩增后便得到了一系列的带有核苷酸顺序的 DNA 片段，每一个片段都代表一个基因，这些基因决定了细胞的某一特征，这种现象称为基因突变。
因此， PCR 技术可以提供一种快速、高效地分离基因组 DNA 的方法，但 PCR 技术也存在很大的局限性：首先，它需要 PCR 扩增体系包括引物和模板，且需要 PCR 扩增子之间具有明显的差异；其次，PCR 扩增子必须是可逆的，即扩增子中必须有某些核苷酸序列可以与引物结合而导致其自身的断裂；第三， PCR 反应只适用于细菌等低等生物，而不能用于高等生物。
PCR 技术在遗传病诊断、人类疾病的基因治疗、药物筛选、基因突变研究等领域有广泛的应用前景。
PCR产物电泳结果分析
PCR产物电泳结果分析PCR产物电泳结果分析是一种常见的分子生物学实验技术，用于分析PCR反应的结果以确定目标基因的扩增情况。
PCR（聚合酶链反应）是一种在体外合成DNA的技术，它可以通过放大目标DNA片段的数目，从而使其变得可见，以进一步研究特定基因在不同生物体中的表达水平或基因突变。
PCR产物电泳是一种常见的分析技术，用于检测PCR反应的扩增结果。
在PCR反应中，所用的引物会在目标DNA序列的两端结合，然后由DNA聚合酶在引物的作用下，沿模板DNA链扩增新的DNA链。
扩增后的DNA产物可以通过电泳技术，根据DNA片段的大小进行分离，然后通过染色剂（如SYBR Green）或比色剂（如溴化乙锭）来可视化。
在进行PCR产物电泳结果的分析时，我们通常会关注以下几个方面：1.DNA分子大小：根据PCR反应的设计，目标DNA片段的大小是已知的。
因此，我们可以根据电泳图谱中的带状图案来确定PCR产物的大小。
通常，DNA片段越大，迁移距离就越短。
我们可以使用一个已知大小范围的DNA分子量标准，以便对PCR产物的大小进行估计。
2.PCR产物强度：根据PCR反应中的初始模板DNA浓度以及引物的特异性和扩增效率，PCR反应的产物数量会有所不同。
因此，PCR产物的强度可以反映出PCR反应的效率以及目标基因在所用模板DNA中的相对丰度。
强度较弱的带可能是由于引物特异性不佳、扩增效率低或存在PCR抑制物等原因导致的。
因此，强度较弱的产物不一定具有生物学意义。
3.杂交带或非特异扩增：在一些情况下，PCR反应可能会出现非特异性扩增，即扩增出多个目标DNA片段。
这可能是由于引物特异性不佳或模板DNA中存在高度同源的序列导致的。
在电泳结果中，我们可以看到多个杂交带，这种情况下，我们需要进行进一步的操作，如克隆和测序，以确认目标基因的扩增情况。
4.假阳性或假阴性：PCR反应是一种高度敏感的技术，但在一些情况下，它也可能出现假阳性或假阴性的结果。
PCR产物电泳结果异常分析
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
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PCR电泳结果宽带的原因分析
刘子发
(剑阁县人民医院,四川剑阁628300)
[中图分类号]Q503 [文献标识码]B [文章编号]1003-403X(1999)03(增)20035201
自1985年美国科学家Karry.B M ellis发明PCR技术以来,由于其高度的特异性、敏感性,因此在临床实验诊断中得到迅速普及。
使临床实验诊断达到分子水平。
PCR技术本身是优秀的,但由于实验条件、人员素质不一致,电泳结果观察判定不准确引起的假阳生、假阴性时有发生,尤以相应片段宽带结果最常见,对结果的正确判断影响较大。
笔者从DNA模板浓度、样品的处理、复性温度等探讨其对电泳结果的影响,现报道如下。
1 D NA模板浓度
朱沛轩等报道DNA模板浓度过高,电泳结果易形成宽带。
笔者将30例凡电泳结果相应片段为宽带的原标本,重新用同样方法提取DNA模板,与相应片段的10份阳性对照一起,采用稀释DNA模板浓度的方法,扩增电泳。
结果:相应片段宽亮度减弱,宽带仍存在20例,宽带完全消失7例,宽带仍存在,亮度未减弱3例;阳性对照9份亮度减弱,1份为阴性。
笔者认为PCR电泳结果宽带虽与DNA模板浓度过高有一定联系,但稀释DNA模板浓度消除相应片段宽带同时也使假阴性增多,故不能单纯通过稀释DNA模板浓度消除相应片段的宽带现象。
2 样本的处理
处理样本的目的是纯化样本中的核酸,除去杂质,使待扩增的靶序列DNA暴露和浓缩。
理论上讲:PCR对模板DNA纯度及完整性要求并不高,但待扩增的拷贝数极少或样本杂质太多,由于自身高灵敏性和操作精细性,使得PCR结果变异很大。
笔者将不易判断的相应片段宽带电泳结果的原标本,采用不同方法,重新处理样本。
结果很不一致。
有些方法得到明显、清晰、无宽带、易观察判断的电泳结果;有些则还是很难判断的宽带结果。
说明样本的处理方法不同,对PCR电泳结果影响不一样。
必须根据不同样本、检测目的及本实验室条件不断探索、对比。
因此,选择最佳样本处理方法,不能过份依赖试剂盒操作说明书。
3 复性温度
扩增循环中变性、复性、延伸三步的温度设置都很重要。
笔者单从复性温度对PCR电泳结果的影响进行探讨。
将30例标本各分成三份分别组成三组。
A组以56℃复性;B组以52℃复性;C组以45℃复性,其它条件等同。
结果:A组阳性结果易判断,无相应片段宽带现象,但阳性率低,占17%(5 30);B组相应片段宽带结果较多,占50%(15 30),能明确判定阳性者只有2例,占8%;C组相应片段宽带较少,只1例,阳性结果明显易判定者占33%(10 30)。
说明复性温度降低非特异扩增增加,相应片段宽带结果较多,不易观察结果;复性温度过高非特异扩增虽降低,但阳性率也低。
故应根据具体检测目的、引物长短设置好复性温度,降低非特异性扩增使结果易判定,提高准确度。
4 讨论
PCR电泳结果如为宽带,即使位置与阳性对照一致,也不能轻意下阳性结论。
DNA模板浓度过高虽可影响电泳结果的判断,但通过稀释DNA模板浓度的方法,易引起假阴性。
故笔者认为:应尽量多提取DNA模板,而稀释DNA模板浓度的方法消除相应片段为宽带的电泳结果不可取。
样本的处理对结果影响很大,应不断探索、对比,对具体标本、检测项目找到最适合本实验室条件的样本处理方法。
不能盲从于试剂盒操作说明。
采用最佳的DNA模板提取方法是消除难判断的宽带、拖尾等电泳结果的主要手段。
复性温度设置不当,也可引起相应片段宽带结果。
应根据引物长短、具体检测目的设置好复性温度。
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第18卷第3期(增) V o l.18N o.3
四川省卫生管理干部学院学报JOU RNAL O F S I CHUAN CON T I N U I N G EDU CA T I O N COLL
EGE O F M S
1999年9月
Sep11999。