血管生成实验步骤实验方法完善版
肿瘤细胞诱导血管生成模型具体步骤及详细说明
肿瘤细胞诱导血管生成模型具体步骤及详细说明肿瘤血管生成是指肿瘤微环境诱导的在原有血管基础上生成以毛细血管为主的血管系统，并在肿瘤组织内建立血液循环的过程。
肿瘤血管生成与肿瘤微环境密切相关，受多种促血管生成因子和（或）血管生成抑制因子的调节。
1、鸡胚准备和接种组织：选择北京白鸡种蛋，洗净，用l：1000苯扎溴铵（新洁尔灭）液浸泡3分钟，置37.8土0.5℃培养箱中孵育。
鸡胚发育第7天，蛋壳消毒后，标记制作2cmX3cm左右观察窗。
接种组织视研究目的而定，一定要在接种当日取材，充分清洗除去血污和粘液，再剪成1——2mm 组织小块。
2、组织接种：在制备鸡胚观察窗的次日，即鸡胚发育第8天进行组织接种。
每个鸡胚可接种5—7个组织小块于接种部位CAM表面，再用透明胶纸封好，继续孵育。
3、接种组织的收获与观察：组织接种后每12小时观察一次，到组织接种第11天（鸡胚发育第18天）收获接种组织，取出鸡胚，置接种组织连同周围的CAM于解剖显微镜下观察，并用10％甲醛固定保存，部分组织可作石蜡切片，用作血管生成研究的免疫组化染色等。
4、CAM的血管生成表现：组织接种24小时后，CAM血管开始向接种组织生长，随培养时间的延长，血管数目及直径均明显增加；第2天，新细小血管直接趋向组织；第3天，新生血管形成以接种组织为中心，10——20条放射状血管网；尔后，CAM血管继续明显增加。
非接种部位与接种部位比较，CAM 血管数目少，大血管与小血管呈脉样均匀分布；而接种部位的CAM血管在接种组织周围弥散样增加，以组织为中心向周围呈放射状分布，在首先与组织发生联系的区域CAM血管更多。
第4天，可见新生细小CAM血管生长形成中、粗血管，并在中、粗血管继续分支出细小血管，形成新的血管网。
CAM血管管腔结构清晰，可区别动、静脉。
注意事项该类体外实验研究，有很多人为因素影响，不能代表体内生理反应，因为内皮细胞在生长因子存在的条件下培养了很长一段时间，已被激活。
血管生成
血管生成实验（HUVEC细胞）1.第一天：胰酶消化对数期细胞1，终止后离心收集于50ml离心管内，制成细胞悬液2，细胞计数3调整其浓度至3×104/mL。
将细胞悬液制备好后，用吸管或移液管轻轻吹打混匀，于6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液。
2.第二天：分别加入含有不同浓度的化合物4；将matrigel胶置于4℃过夜融化，同时将枪头和96孔板于-20℃预冷备用3.第三天：第三天铺胶的时候，把枪头剪下去一小节，96孔板放在冰上再往里加胶，加胶时要慢慢加，吸胶时也要慢，不要有气泡a.用预冷的枪头吸取matrigel胶50 μL/well加到预冷的96孔板中5 ，注意使胶平铺在整个孔底；b.将96孔板放入37 ℃培养箱放置1 h使胶凝固；c.半个小时后(自己把握时间，避免细胞处于悬液状态太久)处理以用不同浓度化合物处理24 h后“1”项下6孔板细胞，胰酶消化，计数并稀释，将密度调为1×105 cells/mL；d.以100 μL/well接种于预先铺好的matrigel胶的孔里，继续培养12 h, 24 h；e.倒置显微镜下观察细胞的变化并拍照记录小管的形成情况，每孔随机摄取3个视野。
脚注说明：1.对数期细胞：培养皿中细胞融合率在90%左右即可使用；2.胰酶消化……制成细胞悬液步骤见“MDA-MB-231细胞培养SOP”3，1），2），3）项下所述步骤，3）项下的前半部分，至….打散细胞团块，混和均匀后”；3.见“细胞计数SOP”步骤；4.详见细胞筛选用不同浓度化合物试液的配制方法SOP；5.整个过程在冰上进行，并避免形成气泡；若胶太黏稠，可将枪头的尖端剪掉一小段；一般就是12h，18h，24h各观察一次，看看小管形成的情况买来的胶直接用，不用稀释我们用的是BD的metrigel买来后，小心的分装一下，放在-80比较好，分装时也注意不要用太多气泡。
血管新生，这么多种实验你都知道吗？
血管新生，这么多种实验你都知道吗？有同学在后台留言说要我们介绍一下血管新生的实验，正好最近在Angiogenesis杂志上发表了一篇关于血管新生实验使用和数据解读的综述性指南：Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.Angiogenesis. 2018 May 15. doi: 10.1007/s10456-018-9613-x.对大家来说，血管新生实验（angiogenesis assays）是大家接触比较多的实验了，那么你知道有多少种做法吗？这篇综述从以下31部分总结了常见的实验方法：这里面包括了体内、体外的细胞与动物水平的实验。
下面我们就挑选一些文章图所展示的技术进行简单介绍：1. Endothelial cell proliferation assays（内皮细胞增殖实验）通过对常规96孔板上的HUVEC细胞进行计数或者MTT细胞活性检测，大家应该比较熟悉了。
2.Three-dimensional assays of vascular morphogenesis(血管形态的三维实验)在纤维（fibrin）基质上观察内皮细胞出芽和管腔形成。
3. Aortic ring assay of angiogenesis.(新生血管动脉环实验)A和B分别为大鼠动脉在胶原凝胶上培养的对照和VEGF刺激组形态。
4. Microvessel density and histopathological growth patterns （微血管密闭和病理生长模式）通过CD31对正常肝（a）/结直肠癌肝转移（b）和(c)组织进行染色，通过不同方法（b——replacement growth pattern和c——desmoplastic growth pattern）计算微血管密度模式，相同的颜色表示相同模式。
血管内皮细胞成管实验步骤
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观察血管结构实验报告
一、实验目的1. 了解血管的基本结构；2. 掌握血管的分布特点；3. 分析血管的功能及其与结构的关系。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：人体血管切片、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管、镊子等；2. 实验仪器：显微镜、解剖显微镜、解剖刀、解剖剪、解剖镊等。
三、实验方法1. 将血管切片置于载玻片上，用滴管滴加适量的生理盐水，覆盖盖玻片；2. 将载玻片置于显微镜下，观察血管的结构特点；3. 分析血管的分布特点、功能及其与结构的关系。
四、实验结果与分析1. 动脉（1）结构特点：动脉管壁较厚，由内向外分为内膜、中层、外膜三层。
内膜由内皮细胞构成，中层为平滑肌层，外膜为结缔组织层；（2）分布特点：动脉分布广泛，从心脏出发，分支成各级动脉，直至毛细血管；（3）功能：将心脏的血液输送到全身各部位，保证各组织器官的血液供应。
2. 静脉（1）结构特点：静脉管壁较薄，由内向外分为内膜、中层、外膜三层。
内膜由内皮细胞构成，中层为平滑肌层，外膜为结缔组织层；（2）分布特点：静脉分布广泛，与动脉伴行，收集全身各部位的血液，运送回心脏；（3）功能：将全身各部位的血液送回心脏，保证血液循环的连续性。
3. 毛细血管（1）结构特点：毛细血管管壁最薄，由单层内皮细胞构成，管腔极小，只允许红细胞单行通过；（2）分布特点：毛细血管分布广泛，遍布全身各组织器官；（3）功能：进行物质交换，将氧气、营养物质输送到组织细胞，将代谢废物、二氧化碳等物质运回血液。
4. 血管功能与结构的关系血管的结构与其功能密切相关。
动脉的厚壁和弹性有利于血液的快速输送；静脉的薄壁和较大的管腔有利于血液的回收；毛细血管的细小管腔和单层细胞结构有利于物质交换。
五、实验结论通过本次实验，我们了解了血管的基本结构、分布特点以及功能。
血管的结构与其功能密切相关，共同保证了血液循环的顺利进行。
六、实验讨论1. 动脉和静脉在结构上的区别是什么？答：动脉和静脉在管壁厚度、管腔大小等方面存在差异。
离体血管实验报告
一、实验目的1. 了解离体血管实验的基本原理和方法。
2. 观察和分析血管在不同理化因素作用下的变化。
3. 掌握实验数据的记录和分析方法。
二、实验原理离体血管实验是研究血管生理和病理生理的重要方法。
通过模拟体内环境，将血管取出体外，观察和分析血管在不同理化因素作用下的变化，从而揭示血管的生理和病理机制。
三、实验材料1. 动物：成年大鼠2. 实验仪器：手术显微镜、剪刀、镊子、注射器、针头、试管、离心机、CO2培养箱、显微镜等3. 实验试剂：生理盐水、肝素钠、RPMI-1640培养基、EDTA、NaOH、HCl等四、实验方法1. 取成年大鼠，处死并迅速取出心脏，将心脏放入含有生理盐水的容器中，清洗血管。
2. 使用手术显微镜和剪刀，将心脏周围的脂肪和结缔组织去除，暴露血管。
3. 使用镊子将血管从心脏上分离下来，剪成约2-3mm的血管段。
4. 将血管段放入含有肝素钠的生理盐水中，防止血管内血栓形成。
5. 将血管段放入含有RPMI-1640培养基的培养皿中，置于CO2培养箱中培养。
6. 根据实验目的，分别对血管进行以下处理：a. 调整培养基的pH值b. 调整培养基的温度c. 添加EDTAd. 添加NaOH或HCle. 添加不同浓度的药物7. 观察血管在不同处理下的变化，包括血管收缩、舒张、通透性等。
8. 使用显微镜观察血管的形态变化。
9. 收集实验数据，进行统计分析。
五、实验结果1. 调整培养基的pH值后，血管收缩程度明显增加。
2. 调整培养基的温度后，血管舒张程度明显增加。
3. 添加EDTA后，血管通透性增加，红细胞渗出。
4. 添加NaOH后，血管收缩程度增加。
5. 添加HCl后，血管舒张程度增加。
6. 添加不同浓度的药物后，血管收缩或舒张程度发生改变。
六、实验结论1. 离体血管实验可以模拟体内环境，研究血管在不同理化因素作用下的变化。
2. pH值、温度、EDTA、NaOH、HCl和药物等理化因素可以影响血管的收缩、舒张和通透性。
毛细血管生成研究中的实验工具技术与方法研究
毛细血管生成研究中的实验工具技术与方法研究介绍毛细血管是组成人体微循环系统的重要组成部分，是维持细胞生存的重要管道之一。
毛细血管生成（Angiogenesis）是一种生理学过程，维持组织的正常发育、生长和修复，但是它在某些病理状态下也会出现。
对毛细血管生成的研究，不仅能够揭示其生物学机制，而且对于心血管疾病、肿瘤等多种疾病的治疗也有重要的意义。
因此，建立适合的毛细血管模型，掌握一系列的研究实验工具技术和方法，对于毛细血管生成的研究至关重要。
现有的实验工具技术和方法1. 观察溶血性活性物质（heme oxygenase-1, HO-1）对于血管再生的影响为了评估HO-1对血管再生的影响，一种基于大鼠背部的血管再生实验已被开发。
在该实验中，研究人员将二氧化碳（CO2）加压冷冻器（Cryopen CO2）用于通过冻结以诱导皮肤血管的损伤。
以促进血管再生，分别使用皮下注入HO-1表达载体，再次用于诱导皮肤中血管的再生。
2. 使用转基因鼠进行胃黏膜毛细血管生成的研究通过使用转基因鼠进行胃黏膜毛细血管生成的分析，多个研究小组可成功地在转基因鼠中诱导黏膜毛细血管的直径增加，即毛细血管扩张，同时也发现有更多的毛细血管形成，表明转基因鼠中的毛细血管基因已被激活。
这些实验结果有助于进一步牵引出解释饮食和其他因素对于胃部物质吸收之影响的理论，并提示在诸如胃溃疡和消化系统疾病的治疗方面将有很大进展的空间。
3. 神经网络技术在毛细血管形成中的应用神经网络技术是一种基于模拟人脑运作方式的计算机技术，适用于模拟线性和非线性的时间序列，是一种广泛应用于预测、分类和聚类数据的技术。
最近，这种技术在毛细血管生成的研究中逐渐地应用了起来。
以血管内皮生长因子（VEGF）作为主要输入因子，采用神经网络技术构建了预测毛细血管生成的模型，并对其进行了验证。
实验结果显示，引入神经网络技术可以从VEGF的角度，准确地预测毛细血管生成的情况。
结论对于毛细血管生成的研究，需要掌握多种实验工具技术和方法，以便更好地对其生物学机制进行解析。
血管形成实验的原理
血管形成实验的原理
血管形成实验是一种用于研究和观察血管生长和形成过程的实验方法。
其原理基于以下几点：
1. 细胞和组织培养：实验通常使用培养皿或培养板，在其中培养细胞或组织。
细胞可以来自动物或植物的血管内皮细胞，可以通过嫁接、细胞培养或其他方法获取。
2. 活体或体外实验：血管形成实验可以在动物体内或体外环境中进行。
在体内实验中，通常将培养的细胞或组织植入动物体内，观察其在动物体内的血管发育情况。
在体外实验中，细胞或组织会直接在培养条件下生长和形成血管。
3. 血管生长因子和分子介导：实验通常会添加不同的生长因子和分子，以模拟和促进血管形成的过程。
例如，VEGF (血管内皮生长因子) 能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，进而诱导血管的形成。
4. 观察血管形成：实验过程中会使用显微镜观察和记录血管的形成过程。
可以观察到血管内皮细胞的分裂和迁移，血管管腔的形成，以及血管的网络结构和形态。
通过进行血管形成实验，研究者可以更好地理解血管的发育和异常形成的机制，并在血管相关疾病的预防和治疗中发现新的靶点和策略。
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无论原发性肿瘤还就是继发性肿瘤,一旦生长直径超过1~2 mm,都会有血管生成。
这就是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。
多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。
因此,血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展与扩散转移。
于就是体外的血管生成实验就能很好的模拟肿瘤的血管发生过程,并且适合研究药物对这一过程的影响实验。
图一血管生成镜检图
一、实验材料与实验方法
1、实验材料
2、实验方法:
2、1实验流程介绍
图二实验流程图
(提前将Matrigel融化,铺于ibidi血管生成载玻片的下孔中,待胶凝后,将细胞悬液加入血管生成载玻片上孔中,成管后使用显微镜观察。
)
2、2耗材结构介绍
图三血管生成载玻片纵截面示意图
(Matrigel铺在下孔,细胞铺在Matrigel上,上孔充满培养基)
2、3数据分析流程介绍
图四实验结果收集与分析流程图
(在特定的时间点采集图片,并且进行图像分析(Wimasis全自动分析)测量小管长度,成环数,细胞覆盖面积与结点。
之后在对测量结果进行统计分析以说明实验结果。
)
一、实验步骤
1、准备基质胶
1、实验前一天将Matrigel置于冰盒中,放入4。
C冰箱,使胶能过夜缓慢融化。
(注意:同样要准备一些4。
C预冷的枪头用于吸取Matrigel)
2、开始实验前,将Matrigel始终保持放在冰盒中。
3、打开灭菌包装,取出ibidi血管生成载玻片。
4、每孔中加入10μl Matrigel。
注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。
由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液枪不准确,有可能打入10μl的胶,却不能填满血管生成载玻片的下孔——这样,必然会影响到实验的成像结果。
如何判断就是否加入了合适体积的Matrigel:
我们只需用一张格子纸就能知道自己的移液枪调整到多少能正好把下孔填满。
如上图所示,垂直透过每个孔瞧下面的格子纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满,格子被放大了,那么胶就加多了,格子没发生什么变形,这才就是刚刚加满下孔的状态。
2、凝胶
1、盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。
2、准备一个10cm的培养皿,放入浸过水的纸巾,制成一个湿盒。
3、将ibidi血管生成载玻片放入培养皿中,盖上培养皿盖。
4、将整个培养皿放入培养箱中,静置30分钟左右,等待胶凝结。
5、等待同时准备细胞悬液。
3、铺细胞
加入细胞的量直接影响实验结果,所以在正式实验开始之前,要对不同类型的细胞与使用数量进行预实验。
获得最佳比例的细胞密度。
我们今天的实验使用HUVEC细胞,每孔种10000个细胞即可。
1、准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液,充分混匀。
2、将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。
3、每孔加入50μl的细胞悬液,注意保持枪头垂直在上孔的上方,不要接触下孔的凝胶。
可以使用排枪。
4、同样用格子纸查瞧就是不就是加了足够量的液体,如果没有,加入无细胞的培养基,使上孔液体正好加满。
5、盖上盖,静置,一段时间后,所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。
4、采集图像并统计结果
可以按照细胞的生长速度定时采集图像,并且对其成管长度,覆盖面积,成环数,结点数进行测量与记录,并且对其进行统计分析
5、免疫荧光染色
根据需要,可以对成管结果进行免疫荧光染色。
小心的移除上孔内培养基,注意不要碰到胶或者细胞网络。
加入50μl用无血清培养基稀释的calcein (12、5 µl calcein stock 1 µg/µl),使其终浓度为 6、25 µg/ml (1:160)。
在室温下避光孵育30分钟。
使用PBS清洗三次,注意,PBS要缓缓加入上孔,以免冲击掉细胞。
使用 485 nm/ 529 nm进行免疫荧光成像。
实验优势
1、这个实验方法能节省更多基质胶,降低实验成本;
2、分上下孔的ibidi血管生成载玻片能去除凹液面,使成像效果更好。
图五成像对比
(左侧ibidi血管生成载玻片无凹液面,整个视野成像清晰;右侧96孔板有凹液面,中间清晰周围模糊。
)。