实验革兰染色细菌基本形态特殊结构
3实验三细菌革兰氏染色
实验三细菌革兰氏染色及特殊结构观察一、实验目的：1、了解革兰氏染色法的原理，并熟练掌握其操作步。
2、了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。
3、通过革兰氏染色进一步理解细菌细胞壁的结构特点。
4、巩固在油镜下观察微生物的个体形态。
5、学习并掌握芽孢染色法。
6、学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
二、主要仪器设备及材料：1、菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌斜面2、试剂：草酸铵结晶紫染色液，路哥氏（Lugol）碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液，香柏油，二甲苯，生理盐水，5%孔雀绿3、仪器与材料：生物显微镜，载玻片，盖玻片，酒精灯，火柴，小试管（75mm×10mm），烧杯（300mL），滴管，接种环，擦镜纸，镊子，电炉三、原理：微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
细菌的形态构造和观察--项目实训：革兰氏染色法
脱色：95%乙醇脱色20-30s, 至乙醇液不呈紫色
复染：番红复染1min,用水冲 洗
干燥后镜检
八、项目实训：革兰氏染色法
３ 染色结果
八、项目实训：革兰氏染色法
４ 染色影响因素
➢ 掌握好乙醇脱色程度，若脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时， 阴性菌被误染为阳性菌；
➢ 菌龄也影响染色结果，若细菌培养时间太长，已死亡或自溶，导致细胞壁通透性 的改变而呈现假阴性反应。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂 量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁， 酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。
项目一 细菌的构造和形态观察
八、项目实训：革兰氏染色法
１ 基本原理
八、项目实训：革兰氏染色法
２ 操作步骤
涂片、干燥、固定
初染：草酸铵结晶紫染色 1min,用水冲洗
微生物学基础
原核微生物的构造和形态观察
项目一 细菌菌鉴定的重要方法，可将全部细菌分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类； ➢ 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁化学组成和结构不同： G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因 脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能 被酒精脱色，仍呈紫色。
实验一：细菌基本形态与结构
操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）
Aseptic area 10-20cm
外焰 内焰 焰芯
细菌涂片的制备
器具：接种环（上）和接种针（下）
2—5mm
柄约22cm
5—8cm
金属柄约14.5cm
绝缘柄 约7.5cm
安装环(针)的螺口(约8mm)
细菌涂片的制备
菌液采取法
三、实验器材
示教玻片、显微镜、擦镜纸、 香柏油、二甲苯
四、实验步骤
（一）普通光学显微镜 的使用
显微镜的构造 （1）支持部分：镜臂、镜筒、精细调节 （2）放大部分：接目镜、接物镜 （3）照明部分：反光镜、取光器、滤光
镜
（一）普通光学显微镜的使用
1、油镜的使用方法 （1）低倍镜观察 （2）光圈调最大 （3）标本上滴加香柏油0.5-1滴 （4）转换油镜头浸入油滴中
幽门螺杆菌
（三）细菌的特殊结构观察
芽胞示教片：破伤风梭菌。 鞭毛示教片：变形杆菌。 荚膜示教片：肺炎双球菌。
产芽芽孢胞细菌的种类
芽孢 菌体 （营养细胞）
破伤风梭菌×1000
鞭毛
变形杆菌鞭毛×1000
细菌荚膜示意图
荚膜的观察：
负染色
细菌标本染色检查法
细菌染色
活菌染色
死菌染色
（一）普通光学显微镜的使用
2、使用完毕显微镜及标本片的处理 （1）油镜用过后，应立即用擦镜纸
将镜头和玻片擦拭干净 （2）如油渍已干，须用擦镜纸蘸少
许二甲苯溶液拭去油渍，再用干擦镜 纸拭净镜头
油镜的使用与保护
1.原理 2.方法
（二）细菌的三种基本形态
球菌：双球菌、链球菌、葡萄球菌 杆菌：球杆菌、链杆菌、分支杆菌 螺形菌：霍乱弧菌、螺杆菌
实验一油镜的使用`革兰染色及特殊结构的观察
实验一油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察细菌个体微小，必须借助显微镜来观察其形态结构。
但是活细菌为无色半透明状态，在普通光学显微镜下不易观察清楚，常用染色的方法使细菌着色，使之与背景形成鲜明对比，再在显微镜下观察，可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。
观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。
目的和要求：1、熟悉显微镜油镜的使用方法。
2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构3、学习革兰染色法实验材料：标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。
实验原理：使用油镜时，需在玻片上滴加香柏油。
这是因为油镜的放大倍数较高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质物体（玻片→空气→透镜）时，部分光线会发生折射而散失，进入镜筒的光线少，视野较暗，物体观察不清。
如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则使进入油镜的光线增多，视野亮度增强，物象清晰。
实验方法及注意事项：1、用油镜时，勿将镜臂弯曲倾斜，以免油滴或菌液流淌外溢，影响观察造成污染。
2、用低倍镜对光，自然光线用平面镜（光源不宜采用直射日光，因直射日光的强度太大容易刺激眼睛），人工光源用凹面镜，同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。
染色标本油镜检查时，应将光圈完全打开，集光器上升至载物台相平，使光亮度很强。
3、标本片放在载物台上，用标本推进器或压片夹固定。
4、低倍镜找出标本的范围，然后在待检部位上加一滴香柏油，转动镜头转换器，将油镜头置于工作位置，从侧面观察并缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，然后眼睛移至目镜，缓慢向上移动粗调节器（只应上升，不能下降，以免压碎标本和损坏镜头），待看到模糊物象时，再用细调节器转动至物象完全清晰为止。
5、观察完毕，取下标本片，立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。
若油已干，应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头，再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
细菌的形态学检查
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革兰染色法
结晶紫、碳酸钠初染，30秒 碘液媒染30秒
丙酮酒精数滴，脱色约5秒
碱性复红液2~3滴，5秒钟
待干，镜检。
注：每一步均需 细流水冲洗。
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• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
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• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
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革兰氏染色意义：
注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
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细菌形态示意图绘图要求
绘细菌的
形态 排列 染色性 特殊结构
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目 录 末页
1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
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（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀 死细菌。
玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆 样速度通过三次，时间约3秒钟。
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革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（碘液）
脱色（95%乙醇） 复染（复红）
• 玻璃折射率： n=1.52
• 香柏油折射率： n=1.515
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二、细菌标本染色检查法
革兰氏染色的实验报告（共9篇）
革兰氏染色的实验报告(共9篇)革兰氏染色实验报告革兰氏染色法的原理及其练习摘要：革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，所以学习微生物学，进行革兰氏染色实验是很重要的。
为保证染色结果的正确性，采用规范的的染色操作方法是十分必要。
本实验主要对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）进行革兰氏染色，观察它们的染色特征，辨别是革兰氏阴性还是阳性，从而掌握其染色方法。
染色方法与过程很清晰，但实验结果中金黄色葡萄球菌(S.aureus Rosenbach）多组呈现假阴性。
本实验的主要目的是熟悉并掌握革兰氏染色方法及原理，但要想做出很好的染色得多加练习。
本实验还可以锻炼显微镜操作技术和无菌操作技术。
关键词：革兰氏染色大肠杆菌(E.coli) 金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach) 枯草杆菌(B.subtilis)引言革兰氏染色是微生物学中最重要的鉴别染色方法，它可以直接将细菌分为革兰氏阴性和革兰氏阳性。
革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构组成与结构的差异所决定的。
经过一定的染色过程后，革兰氏阳性的细菌会因为细胞壁肽聚糖的含量高，脂质含量低而保持第一次染色的蓝紫色。
革兰氏阴性细菌细胞壁的脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，蓝色被洗脱，复染后变为红色。
革兰氏染色原理很简单，染色时需注意要注意使用处在活跃生长期的细菌，涂片不宜过厚，严格控制脱色时间。
大肠杆菌(E.coli)是革兰氏阴性细菌，金黄色葡萄球菌(S. aureus Rosenbach)与枯草杆菌(B.subtilis)都是革兰氏阳性细菌，染色后在显微镜下容易区别。
同时它们的形态各异，可以根据具体颜色和形态差异来判断染色是否成功。
本实验还涉及到高倍油镜的使用。
实验2 细菌的染色和形态观察
微生物学实验二
细菌的染色和形态观察
（验证性实验）
微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
上节课实验结果观察
显微镜油镜头的使用与保护
示教：细菌的基本形态与特殊结构的观察
操作：单染色、革兰染色 材料：葡萄球菌、大肠杆菌肉汤培养物 载玻片 2张 /人 1支/6人
教学目标
了解：
1.显微镜油镜镜头的使用与保护
革兰染色的原理：
等电点学说
化学学说 通透性学说
等电点学说：
革兰阳性菌的等电点（PI 2-3)比革 兰阴性菌的等电点(PI 4-5)低，在pH=7 的染液中，革兰阳性菌所带的负电荷比 阴性菌多，因而摄取碱性染料比较多且 牢固，不易被酒精脱色。
化学学说 ：
革兰阳性菌的细胞内含有某些特殊化 学物质，一般认为是核糖核酸镁盐，能与 染料和碘液结合成为稳定的化学物，不易 被酒精溶解脱色。
思考题
1. 革兰染色的过程如何？
2. 有时候革兰阳性菌被染成革兰阴性菌的色调，
这是为什么？
革兰染色的步骤
1：制片 3：固定 2：干燥 4：染色： 初染：结晶紫 1分钟
媒染：碘液
脱色：95%酒精
1分钟
半分钟
复染：稀释复红
半分钟
革兰染色结果判断
紫
球
碘
阳
酒
杆
红,
阴,
一
阳
一
紫
半
阴半Leabharlann 红脑 淋 卡，白 抗 胞 除外
革兰氏染色的意义：
将细菌分为革兰阳性、阴性两大类。
分析细菌的致病性。 指导临床用药。
革兰染色法过程
1、涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌 苔在盐水中乳化，涂成直径约为0.5cm 的膜。 2、干燥：在远离火焰上方微微烘干。 3、固定：火焰固定。 4、革兰染色过程： 初染：结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 5、镜检：阳紫阴红 球阳杆阴
细菌的形态结构实验图片
特殊组分
革兰阳性菌
磷壁酸(teichoic acid) 磷壁醛酸
特殊蛋白： A蛋白、M蛋白
Wall teichoic acid
(LTA)
微孔蛋白
革兰阴性菌
外膜
（outer membrane）
脂蛋白
LIPID BILAYER
脂质双层
脂多糖LPS
脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）
物质，为疏水性多糖或蛋白质的多聚体，用理 化方法去除后并不影响菌细胞的生命活动 ≥0.2μm荚膜，＜ 0.2μm 微荚膜 化学组成：多糖/多肽 形成条件：营养丰富 染色：不易着色，负染（墨汁）
鞭毛（flagellum）
概念：许多细菌菌体上附有细长并呈波状 弯曲的丝状物。鞭毛长5~20μm，直径 12~30nm
（1）脂质A（lipid A） 为一种糖磷脂，由D-氨基葡萄糖双
糖组成的基本骨架，不同细菌骨架 一致。 内毒素毒性与生物学活性成分 无种属特异性
（2）核心多糖（core polysaccharide）
位于脂质A的外层 有属特异性，同一属细菌相同
（3）特异多糖（specific polysaccharide）
或称胞质膜（cytoplasmic membrane）， 细胞壁内侧，包绕细胞质
结构：磷脂、蛋白质
不含胆固醇
功能
中介体（mesosome） 是部分细胞膜内陷、 折叠、卷曲形成的囊 状物，多见于革兰阳 性细菌
细胞质（cytoplasm）
细胞膜包裹的溶胶状物质，或称原生质（protoplasm）， 由水、蛋白质、脂类、核酸及少量糖和无机盐组成，其中 含有许多重要结构。
最外层，由数个至数十个低聚糖 （3~5个单糖）重复单位所构成的 多糖链。
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【操作步骤】 革兰染液染色
初染 媒染 脱色 复染
冲洗
冲洗
冲洗
结晶紫 1’ 1’
冲洗
碘液 1’
95% 乙醇 30”
复红
滤纸干燥
油镜观察
革兰染色
甲 菌
＋ ＋ 紫色（ G ） 紫色（ G ）
初染
媒染
脱色
革兰氏染色步骤示意图 乙醇 稀释复红 结晶紫 碘液
乙 菌 红色（G-）
复染
革兰染色步骤示意图
【结果】
实验内容
油镜的使用与保护 细菌染色标本观察 （革兰染色法） 细菌基本形态观察 （球菌、杆菌、螺形菌） 细菌特殊结构观察 （荚膜、鞭毛、芽胞）
一、普通光学显微镜的使用
显微镜的构造图 油镜头的辨认 油镜的使用方法 显微镜的维护
一、油镜的使用与保护 1.原理
2.方法
四，细菌的三种基本形态
鞭毛
变形杆菌鞭毛×1000
细菌荚膜示意图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
荚膜的观察：
负染色
三，细菌标本染色检查法
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法
细胞壁染色法
抗酸染色
革兰氏染色
革兰染色法
由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。
【菌种】大肠杆菌+葡萄球菌
5—8cm
金属柄约14.5cm
绝缘柄 约7.5cm
安装环(针)的螺口(约8mm)
细菌涂片的制备
菌液采取法
细菌涂片的制备
菌液采取法
【操作步骤】
一、细菌涂片的制备
一般制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。
涂片 干燥 固定
固定的目的：
使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘
得更牢固； 可改变菌体对染料的通透性； 加热固定可杀死细菌，比较安全。
【试剂】生理盐水、革兰染液
【其他材料】酒精灯、接种环、玻片、吸水纸、显微镜等 【方法】1、细菌涂片标本的制片 2、革兰染液染色 3、油镜下观察结果
操作原则：无菌操作（烧灼灭菌）
Aseptic area 10-20cm
外焰 内焰
焰芯
细菌涂片的制备
器具：接种环（上）和接种针（下）
2—5mm 柄约22cm
显微镜下的杆菌
弧菌
霍乱弧菌
Figure 3 - Gram stain of Gram – Cholera cells
五，细菌的特殊结构观察
芽胞示教片：破伤风杆菌。 鞭毛示教片：变形杆菌。 荚膜示教片：肺炎双球菌。
产芽孢细菌的种类 芽胞
芽孢 菌体 （营养细胞）
破伤风梭菌×1000
球菌：葡萄球菌。
杆菌：大肠杆菌。
螺形菌：霍乱弧菌。
细菌的三种基本形态示意图
⊕
葡萄球菌：
Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.
杆菌(bacillus)
Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells
细菌被染成紫色者，称为革兰阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰阴性菌；
阳性菌——紫色
阴性菌——红色
实验报告
简要写出革兰染色原理、操作步骤， 绘制革兰染色镜下细菌图 绘制细菌的基本形态及其特殊结构图