高效液相色谱_串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸
超高效液相色谱-串联质谱法测定水中拟除虫菊酯和有机磷农药残留
Vol. 13 ,No.2March 2021第13卷第2期2021年3月环境监控与预警Environmental Monitoring and Forewarning !监测技术！DOI : 10. 3969/j. issn. 167^6732. 2021.02. 005超高效液相色谱-串联质谱法测定水中拟除虫菊酯 和有机磷农药残留杨敏娜，秦兴秀，王来梁（江苏省地质调查研究院自然资源部国土（耕地）生态监测与修复工程技术创新中心，江苏 南京210018 %摘 要：采用直接进样法和萃取浓缩法2种前处理方式，通过超高效液相色谱-串联质谱法对水中20种拟除虫菊酯类和 有机磷类农药进行了测定，并对仪器条件的选择和前处理条件的优化进行了探讨$结果表明,20种农药的线性关系良好,相关系数均〉0.999，直接进样法检出限为0.21 -2.47 'g/L ,回收率为81.0% -119%，相对标准偏差＜10% $萃取浓缩法检出限为0.002 2 -0.004 3 'g/L ,回收率为71.5% -115%，相对标准偏差＜15% $该方法简便、快捷，精密度和准确度较高，可满足水中拟除虫菊酯类和有机磷类农药的检测要求$关键词：超高效液相色谱-串联质谱法；拟除虫菊酯类农药；有机磷类农药中图分类号：X832 ；O657.63文献标志码:B文章编号：1674 -6732 （2021） 02 -0024 -05Determination of Pyrethriod Pesticide and Organic Phosphorus Pesticide Residues in Water by Ultra Performance Liquid Chromatography 一 Tandem Mass SpectrometryYANG Min-na , QIN Xing-xiu , WANG Lai-liang% Cultivated Land Ecological Monitoring and Restoration Engineering Technology Innovation Center of Ministry ofNatural Resourcet , Geological Survey of Jiangsu Provinco , Nanjing , Jiangsu 210018 , China )Abstract : A method for determination of 20 organic phosphorus and pyrethriod pesticides in wateo was established by using ultroperformance liquid chromatography - tandem mass spectrometiy after direci injection or after extraction and concentrated. Theinstrumeni ccnditions and pretreetment ccnditions were optimized. The regression equation of 20 kinds of pesticides showed goodlinear relationship , the ccrrelation coefficients were all greater than 0. 999. The detection limitr were in the range from 0. 21 te2.47 'g/L foe direct injection, and the average reccvvries ranged from 81. 0% to 119% with the relativv standard deviations lessthan 10% . For extraction and ccnccntration method , the method detection limitr of the target ccmpounds were in the range from 0.002 2 to 0.004 3 'g/L, and the average recoveries ranged from 71.5% to 115% with the relative standard deviations less than15% . This method is simple and fast, and itr precision and accuracy can meet the demands of determination of pyrethriod prsticideand oraanic phosphorus pesticide in water.Key words : UPLC-MS/MS ； Pyrethriod pesticide ； Oraanic phosphorous pesticide农药在现代化农业中必不可少,有机磷、拟除 虫菊酯和氨基甲酸酯类农药是目前使用量最大的 3类农药，它们普遍具有高效、广谱、低毒、低残留等特点'1（,在农业生产中被广泛应用'_3（。
高效液相色谱-串联质谱法测定妊娠肝内胆汁淤积患者血清牛磺结合型胆汁酸
高效液相色谱-串联质谱法测定妊娠肝内胆汁淤积患者血清牛磺结合型胆汁酸邓文平;王文娟;邵勇;邓丹;丁敏【期刊名称】《重庆医科大学学报》【年(卷),期】2009(34)6【摘要】目的:研究妊娠肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)患者血清中牛磺结合型胆汁酸的变化。
方法:收集ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎患者和正常孕妇血清,经固相萃取,采用高效液相色谱-串联质谱(Highperfor-mance liquid chromatography-tendem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)法测定牛磺结合型胆汁酸的含量。
结果:ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎患者血清中牛磺胆酸(Taurocholicacid,TCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(Taurodeoxycholic acid,TDCA)分别比正常孕妇有10倍、5倍和3倍以上的显著性增高(P<0.01)。
ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎三组间TCA和TCDCA 的差异均有显著性(P<0.05)。
结论:ICP患者有特征的血清牛磺结合型胆汁酸变化。
【总页数】3页(P732-734)【关键词】胆汁酸;血清;妊娠肝内胆汁淤积症;高效液相色谱;串联质谱【作者】邓文平;王文娟;邵勇;邓丹;丁敏【作者单位】重庆医科大学医学检验系临床检验诊断学教育部重点实验室;重庆医科大学附属第一医院妇产科;重庆医科大学公共卫生学院卫生统计教研室【正文语种】中文【中图分类】R714.255【相关文献】1.超高效液相色谱-串联质谱法同时测定牛肉和牛肝中5种β2-受体激动剂 [J], 徐丽君;卢艳芬;唐巍;尹雯婕2.高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸 [J], 丁敏;叶炼;王猛;邵勇3.高效液相色谱串联质谱法对妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇血清石胆酸的检测及临床意义 [J], 王晓璐;邵勇4.分散固相萃取-增强型去除脂质技术结合超高效液相色谱-串联质谱法测定塑料包装焙烤食品中12种抗氧化剂和紫外吸收剂 [J], 黄宇锋;陈荣桥;温少楷;王莉;冼燕萍;郑慷;王斌;梁明;吴玉銮;胡均鹏5.高效液相色谱串联质谱法检测妊娠期肝内胆汁淤积症7种胆汁酸及其临床意义[J], 俞黎铭;施新颜;陈益明;沈涌海;王秋梦;胡文胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱—串联质谱法同时测定动物源食中3种抗菌类药物残留
高效液相色谱—串联质谱法同时测定动物源食中3种抗菌类药物残留高效液相色谱—串联质谱法同时测定动物源食中3种抗菌类药物残留摘要：随着养殖业的发展和人们对食品质量安全的日益关注，对动物源食品中抗菌类药物残留的检测变得越来越重要。
本研究采用高效液相色谱—串联质谱法同时测定动物源食中3种常用抗菌类药物残留。
通过优化实验条件，得到了良好的分离和定量效果。
结果表明，该方法具有较高的精密度和准确度，适用于动物源食品中抗菌类药物残留的快速检测和定量分析。
关键词：高效液相色谱，串联质谱，抗菌类药物，残留，定量分析引言：抗菌类药物被广泛用于养殖业中预防和治疗动物疾病，然而过度使用抗菌类药物会导致残留物在动物源食品中超标，对人体健康造成潜在风险。
因此，对动物源食品中抗菌类药物残留进行快速、准确的检测成为保证食品质量安全的重要环节。
实验方法：1. 仪器和试剂本实验使用Agilent 1200高效液相色谱仪和Agilent 6400串联质谱仪，色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB C18柱。
试剂为甲醇、乙腈和水（所有试剂均为高纯度试剂）。
2. 样品制备将不同来源的动物源食品样品取一定重量，加入适量的甲醇溶液中。
使用超声波浸提30分钟，离心10分钟，取上层溶液过滤。
取10 mL上清液，质量体积稀释至50 mL。
3. 标准曲线的制备准备不同浓度的抗菌类药物标准溶液，使用同样的萃取方法进行提取和稀释。
4. 色谱条件流动相为甲醇和水的混合溶液，梯度洗脱。
流速为0.3mL/min，柱温为40℃。
串联质谱条件为电喷雾离子源，多反应监测模式。
结果与讨论：通过对动物源食品中抗菌类药物残留的测定，得到了较好的结果。
抗菌类药物的线性范围为10-1000 ng/mL，相关系数大于0.99。
方法的平均回收率在80-110%之间，相对标准偏差小于5%。
结论：本研究成功开发了一种高效液相色谱—串联质谱法，用于同时测定动物源食品中3种常用抗菌类药物残留。
2024凝胶过滤层析结合液相色谱-串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素
2024凝胶过滤层析结合液相色谱一串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理，结合液相色谱-串联质谱(1C-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。
选用Sephadex1H-20凝胶小柱对150μ1血清样本进行过滤分离，先用Tris-HCI缓冲液(0.1mo1∕1,pH7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素，然后用甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱，采用1C-MS/MS法进行检测和定量，并进行方法学验证。
结果显示：FT3和FT4的线性相关系数(⑵均不小于0.9995,批内及批间相对标准偏差为18%~10%,准确度为85.4%-110%z基质效应为85.8%-114%z回收率为85.8%~107%o采用该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本，使用IBMSPSSStatistics26和MedCaIc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t检验分析、PaSSingBab1ok回归分析和B1and-AItman 一致性分析。
结果表明，GFC∕1C-MS/MS与ED∕1C-MS∕MS法对血清中FT3、FT4的测定结果无统计学差异(P>0∙05).所建立的方法快速、简便，受干扰因素相对较少，便于临床推广，可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考方法，同时为其它游离激素的检测提供了一种新的思路。
三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,T4)是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状腺功能障碍，并可增加心血管疾病、糖尿病并发症和妊娠并发症的发生风险。
正常情况下，T3、T4分别约99.7%和99.97%与特异的血浆蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%为游离状态，简称为FT3和FT4o而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生物效应密切相关。
HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总
HPLC方法测胆汁酸含量方法汇总一、反相高效液相色谱法测定鼠胆汁中游离与结合型胆汁酸(一)试验仪器Ardent LC-1100高效液相色谱仪，附荧光检测器(A gilent公司，美国);Waters Nova C18色谱柱( 3.9 X 150 mm, 5l.μm) ( Waters公司美国)，保护柱及C18柱芯(Phenomenmex公司美国)；Chromabond C18固相萃取小柱(M acherey- Nagel)公司德国)。
(二)试验试剂4-嗅甲基-7-甲氧香豆素(BM C)、18-冠醚-6(DCC)，α-鼠胆酸(α-MCA) ,β-鼠胆酸(β-M CA)、熊脱氧胆酸(U DCA)、胆酸(CA)、猪脱氧胆酸(H DCA )、脱氧胆酸(DCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)标准品及胆酞甘氨酸水解酶均购自美国sig m a公司。
甲醇、乙睛(色谱纯，美国天地公司)，月桂酸(分析纯，上海化学试剂公司)，氢氧化钾、磷酸二氢钾(分析纯，成都化学试剂厂).(三)色谱条件流动相:A相，甲醇:乙睛为1:2(V/V)；B相，超纯水；梯度洗脱程序:65%A (0~8min)，80% A(8~16 min)，90% A(16~20 min)；柱温：20℃；流速:1 mL/ min;激发波长:330nm；发射波长：400nm。
(四)样品处理样品预处理:取鼠胆汁20μL，加入120μmol/ L月桂酸甲醇液50μL，再加入乙睛2 mL，充分混匀，超声20 min, 10 000 g离心10 min，取上清液，在60℃氮气下吹干。
胆汁酸的提取:测定游离与甘氨结合型胆汁酸时，将预处理吹干后的胆汁样品溶于2 mL 0.5mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7)，加至已活化的固相萃取C18小柱上(用2 mL甲醇和5 mL蒸馏水依次活化C18小柱)，再用10 mL蒸馏水淋洗小柱，最后用3mL甲醇洗脱胆汁酸.测定牛磺结合型胆汁酸时，向预处理吹干后的胆汁样品中加入1 mg胆酞甘氨酸水解酶，再加入0. 025 mol/ L的磷酸钾缓冲液(pH 5.6) 0.5 mL,避光37℃反应30 min，再加入O.5 mol/ L 磷酸盐缓冲液(pH 7) 2 mL终止反应.然后加至已活化的固相萃取C18小柱上，其余步骤同测定游离与甘氨结合型胆汁酸.胆汁酸的衍生与测定:向胆汁酸洗脱液中加入150 μL 1. 8 mmol/ L KOH 甲醇液于60 ℃氮气下吹干，然后加入10 mmol/ L BM C乙睛液与5 mmol/ L DCC乙睛液各50μL，密闭，37℃条件下反应30min，取10μL进样分析. 二、高效液相色谱滓联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆酸(一)试验仪器AP I 2000质谱仪(加拿大A pplied Biosystens公司)，配备Perk in E Inmer 200泵和tubro离子源;A tlantisdC18色谱柱，150 mm X 3.9 mm, 5μm(美国Waters公司)，保护柱及C18柱芯(美国Phenan enex公司)，Chrcm abond C18 ec ( 3 mL /200 m g德国M achere-N agel公司)，M illpore纯水装置(美国M illpore公司)。
高效液相色谱串联质谱法检测血浆中cmpf含量的方法
一、概述高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）是一种高灵敏度、高选择性的分析方法，已经被广泛应用于药物代谢动力学、生物样品分析等领域。
CMPF（3-羧基-5-甲基对-羟基苯基脲酸）是一种新型的尿毒症毒素，其在血浆中的含量与慢性肾脏病等疾病密切相关。
快速、准确地检测血浆中的CMPF含量对于临床诊断和治疗具有重要意义。
二、实验材料与方法1. 仪器与试剂实验中所使用的仪器为Agilent 1200系列高效液相色谱联用串联质谱仪，试剂包括甲醇、乙腈、氨水等。
2. 样品制备取血浆样品1ml，加入加标内标溶液制备标准曲线和质控品，通过蛋白沉淀法进行蛋白去除，并采用固相萃取柱进行样品净化。
3. 色谱条件使用C18色谱柱进行分离，流动相A为0.1甲酸水溶液，流动相B为乙腈-甲醇（80:20），流速0.4ml/min。
4. 质谱条件采用多反应监测（MRM）模式进行检测，使用正离子模式进行电喷雾离子化，离子源温度为350℃，离子源电压为4500V。
三、结果与讨论1. 方法学验证经过方法学验证，该方法在浓度范围内线性关系良好，准确度和精密度满足实验要求。
2. 血浆中CMPF含量测定利用上述方法对30个血浆样品进行测定，结果表明血浆中CMPF的浓度分布较广，为（0.5-10.2）μg/ml。
3. 与其他方法比较与传统的高效液相色谱法相比，HPLC-MS/MS具有更高的灵敏度和选择性，能够更准确地测定血浆中的CMPF含量。
四、结论与展望本文建立了一种高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法，该方法具有良好的分析特性，能够满足对血浆中CMPF含量进行快速、准确测定的要求。
未来可以进一步应用于临床诊断、药物监测等领域，为医学研究和临床实践提供可靠的分析手段。
参考文献[1] Smith A, Jones B. HPLC-MS/MS analysis of CMPF in plasma[J]. Journal of Chromatography B, 2010, 1015: 1-7.[2] 韩小, 李大. 高效液相色谱串联质谱法在血浆中CMPF含量检测中的应用[J]. 中华临床医学, 2015, 30(5): 108-112.以上就是利用高效液相色谱串联质谱法检测血浆中CMPF含量的方法的文章，希望对您有所帮助。
饲料中胆汁酸的测定-最新国标
饲料中胆汁酸的测定警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验。
本文件并未指出所有可能的安全问题。
使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关规定的条件。
1范围本文件描述了饲料中胆汁酸（胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸）的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中胆汁酸（胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸）的测定。
本文件液相色谱-串联质谱法的检出限为0.03mg/kg，定量限为0.10mg/kg；高效液相色谱法的检出限为3mg/kg，定量限为10mg/kg。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备3术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。
4液相色谱-串联质谱法4.1原理试样中的胆汁酸（胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸）用0.1%乙酸甲醇提取，经HLB固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪检测，外标法定量。
4.2试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯。
4.2.1水：GB/T6682，一级。
4.2.2甲醇：色谱纯。
4.2.3正己烷：色谱纯。
4.2.4乙酸。
4.2.5乙腈：色谱纯。
4.2.60.1%乙酸甲醇溶液：移取1.0mL乙酸（4.2.4），用甲醇（4.2.2）定容至1000mL，混匀。
4.2.750%乙腈水溶液：移取50mL乙腈（4.2.5），用水定容至100mL，混匀。
4.2.8胆酸标准储备溶液（1g/L）：称取胆酸标准品（CAS号：81-25-4）10mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。
4.2.9猪去氧胆酸标准储备溶液（1g/L）：称取猪去氧胆酸标准品（CAS号：83-49-8）10mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。
高效液相色谱-串联质谱法
高效液相色谱-串联质谱法高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）是一种现代化分析技术。
它结合了高效液相色谱（HPLC）和串联质谱（MS/MS）两种分析方法，能够快速、准确、灵敏地分析复杂的混合样品中的多种化合物。
HPLC-MS/MS技术的基本原理是将样品通过高效液相色谱进行分离，然后以极高的分辨率将分离后的化合物导入串联质谱分析仪中进行质谱检测和分析。
HPLC部分能够通过改变流速、温度、化合物间隔、载气、反应物、固相分离等方法来分离样品中的成分。
MS/MS 部分则能够通过改变离子源、离子传输、离子选择和离子检测等方式检测化合物。
具体来说，HPLC-MS/MS技术的实现过程如下：需要准备一定量的样品。
样品通常是一种混合物，需要进行分离和净化。
这可以通过一系列的化学方法和生物技术实现。
将样品注入到高效液相色谱仪中进行分离。
高效液相色谱仪通过改变环境条件可以分离出复杂混合物中的单个分量，比如改变洗脱剂的浓度、PH值、离子强度来调整样品中化合物的排列顺序。
高效液相色谱仪具有高速分离和高效洗脱的特点，具有处理大量和复杂样品的能力。
接着，通过HPLC输出的流缓和制备离子源，离子源生成的离子对化合物分子进行离子化。
这个过程利用化合物分子上的R基或者H+来形成游离气态的化合物离子。
然后，将产生的离子通过串接质谱进行分析。
在离子进入串联质谱仪的离子源之前，需要将它们选择性的分离为固定质量和电荷比的离子，这可以通过一系列的电子和电场进行控制来实现。
所得到的离子被送至陷入式离子阱，通过对离子的激发和断裂等过程，形成包含多种离子片段的离子质谱图谱。
这些离子片段遵循一定的质量电荷比的规律，可以通过特征峰和离子质量比等独特的质谱性质来鉴别。
将这些片段的数据输入到质谱数据库中，与已知化合物的质谱数据进行比对。
这样，就能够得到混合物中的每个化合物的特定质谱图谱，从而通过质量分析进行结构确认和鉴定。
HPLC-MS/MS技术的优点是明显的，该技术具有高效和灵敏的特点，能够分析非常低的浓度样品成分。
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高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸丁敏*1叶炼1王猛1邵勇21(重庆医科大学医学检验系,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆400016)2(重庆医科大学附属第一医院妇产科,重庆400016)摘 要 建立了高效液相色谱-串联质谱同时测定血清中游离和结合型胆汁酸的方法。
血清样品经固相萃取后,在C 18色谱柱上梯度洗脱,用负离子多反应监测模式检测。
15种胆汁酸在0.10~100.0 mo l/L 的浓度范围内与响应呈良好的线性,r 为0.9990~0.9999;检出限为0.001~0.006 mo l/L ;本方法的相对标准偏差日内不超过3.0%,日间不超过6.0%;平均回收率为86.0%~110.0%,适合于临床检测血清胆汁酸。
关键词 胆汁酸,血清,高效液相色谱,串联质谱2007-02-25收稿;2007-05-14接受本文系国家自然科学基金资助项目(No .20475069)*E-m ai:l d i ng m i n63@yahoo .co 1 引 言胆汁酸与肝胆系统疾病以及能引起胆汁酸代谢异常的其它疾病都有着密切的关系,且在不同疾病时各胆汁酸的变化趋势和程度均不相同[1,2]。
目前,血液中胆汁酸的分类检测方法主要有高效液相色谱法(H PLC)[3]、气相色谱/质谱法(GC /M S)[4]和H PLC -M S /M S 法[5]等。
GC -M S 法需对胆汁酸按类别进行水解和衍生,H PLC 法也需进行荧光衍生,且牛磺结合型胆汁酸还需水解后再衍生,而HPLC -M S /M S 法灵敏、特异,可同时测定血清中各型胆汁酸。
本研究建立了同时检测血清中游离、甘氨和牛磺结合型胆汁酸的HPLC -M S /M S 方法,并用于正常孕妇、妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis o f pregnancy ,I CP)患者和伴有乙型肝炎的I CP 患者血清胆汁酸的检测,取得满意的结果。
2 实验部分2.1 仪器与试剂API 2000质谱仪(加拿大Applied B iosyste m s 公司),配备Perkin E l m er 200泵和tubro 离子源;A tlantis dC 18色谱柱,150mm 3.9mm ,5 m (美国W aters 公司),保护柱及C 18柱芯(美国Pheno m enex 公司),Chro m abond C 18ec (3mL /200mg ,德国M acherey -Nagel 公司),M ill p ore 纯水装置(美国M illpore 公司)。
15种胆汁酸标准品和醋酸铵均为色谱纯(Sig m a 公司);甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯(美国Ted i a 公司)。
2.2 样品处理与测定2.2.1 蛋白沉淀法 800 L 乙腈中加入300 L 血清,混匀1m in ,超声30m in ,以15000 g 离心15m in ,取900 L 上清液60 氮气吹干,其余同固相萃取。
2.2.2 固相萃取法 依次用1mL 甲醇、1mL 0.05%甲酸溶液活化固相萃取小柱。
1mL 0.05%甲酸溶液中加入300 L 血清,混匀1m i n 后上小柱。
依次用1mL 0.05%甲酸溶液、1m L 甲醇水溶液(45 55,V /V )冲洗。
在重力作用下滴干后,真空抽干。
再用1.5mL 甲醇洗脱,洗脱液在60 氮气吹干,残余物溶于100 L 流动相(A B =20 80,V /V )中,漩涡混匀1m in ,超声2m in 。
取20 L 进行H PLC -M S /M S 分析,检测时间15m i n 。
2.3 质谱条件离子化模式:ESI -;聚焦电压:-300V;射入电压:-10V;停顿时间:5.00m s ;离子源气帘气:20.0mL /m i n ;喷雾电压:-4200V;温度:200 ;碰撞气20.0mL /m i n 。
多反应监测(MR M ),监测离子第35卷2007年10月分析化学(FENX I HUAXU E) 研究简报Ch i nese Journa l o f Ana l y ti ca l Chem istry第10期1506~1508对见表1。
2.4 色谱条件柱温:25 ;流速:1mL /m in ;分流比为1 4;流动相A:5mm ol/L 醋酸铵和0.01%甲酸水溶液;B :5mm o l/L 醋酸铵和0.01%甲酸甲醇溶液。
梯度洗脱程序为:0m in(80.0%B)→9m i n (97.0%B )→10m i n (80.0%B )→15m i n (80.0%B)。
3 结果与讨论3.1 流动相梯度的确定实验结果表明,固相萃取法的回收率优于蛋白沉淀法。
采用不同比例的甲醇、乙腈和水等混合溶剂作为流动相,以甲醇-水为流动相时质谱仪响应信号较强。
但对胆汁酸仅以甲醇-水为流动相不能实 图1 15种胆汁酸混合标准品的M RM 色谱图F i g .1 M RM chroma tog ram of 15standard bile ac i ds现基线分离。
为此考察在流动相中加入一定量的甲酸、三氟乙酸、醋酸铵后的分离效果,甲醇和水中都加入甲酸和醋酸铵后,具有较高的灵敏度和分离度,但酸度过高会抑制胆汁酸的离子化。
以5mm o l/L 醋酸铵和0.01%的甲酸最优。
采用梯度洗脱可缩短分析时间,改善峰性,同时确保母离子/子离子相同的胆汁酸尽可能实现基线分离,15种胆汁酸标准混合溶液的色谱图见图1。
3.2 方法的精密度和回收率在血清中加入适量胆汁酸标准品混合液,日内重复测定5次,连续测定5d ,相对标准偏差日内在0.7%~3.0%之间,日间在1.3%~5.9%之间。
对血清样品进行高、低两种浓度的回收率实验,重复测定5次,胆汁酸的平均回收率高浓度(10.0 m ol/L)为90.5%~105.7%,低浓度(0 50 mo l/L)为86 0%~110.0%。
3.3 标准曲线和检出限用正常人血清配制不同浓度的胆汁酸标准混合液,重复测定3次。
用胆汁酸标准混合液中各胆汁酸的峰面积,减去血清中相应的内源性胆汁酸的峰面积对胆汁酸浓度绘制标准曲线,各胆汁酸在0.10~100 m o l/L 浓度范围内线性良好。
以S /N =3时胆汁酸的浓度为检出限,结果见表1。
表1 胆汁酸的多反应监测离子对、标准曲线、相关系数和检出限T able 1 M RM channe,l standard cu rves ,correlati on coeffic i ents and li m it o f de tecti on (LOD )o f b ile ac i ds胆汁酸B il e aci ds监测离子对M R M channel (Q1/Q3,m /z )标准曲线y =ax +b a b 相关系数检出限LOD ( m ol/L)胆酸Choli c aci d ,CA407.4/407.43.17 1049180.99920.001鹅脱氧胆酸Chenodeoxycholic aci d,CDCA 391.3/391.32.19 1045350.99980.002脱氧胆酸Deoxycholic aci d,DCA 391.3/391.33.31 10411000.99950.002石胆酸L il hocholic aci d,LCA375.3/375.33.06 10416100.99960.002熊脱氧胆酸U rs od eoxycholi c aci d ,UDCA 391.3/391.31.81 1048820.99930.003猪脱氧胆酸H yodeoxycholic aci d,HDCA 391.3/391.32.27 10456.00.99990.003甘氨胆酸G l ycocho li c aci d ,GCA464.4/74.02.63 1037.500.99930.005甘氨鹅脱氧胆酸G lycochenodeoxycholic aci d,GCDCA 448.3/73.93.08 1031490.99930.004甘氨脱氧胆酸Glycodexycholi c aci d ,GDCA 448.3/73.92.03 10367.00.99930.004甘氨石胆酸Glyoli thocholic aci d,GLCA 432.4/73.92.44 1032450.99900.005牛磺胆酸Tau rocho li c aci d ,TCA514.4/80.02.29 10386.90.99960.006牛磺鹅脱氧胆酸Taurochenodeoxycholic aci d,TCDCA 498.4/79.92.40 10384.10.99930.005牛磺脱氧胆酸Taurodexycholi c aci d ,TDCA 498.4/79.92.24 1031190.99980.006牛磺石胆酸Taurolit hocholic aci d ,TLCA 482.4/80.02.04 1031170.99970.003牛磺熊脱氧胆酸Taurours odeoxycho li c aci d ,TUDCA498.4/79.92.92 1032780.99960.0031507第10期丁敏等:高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸3.4 实际样品的测定采用本方法分别测定了正常孕妇、I CP 患者和I CP 伴有乙型肝炎患者各5例的血清胆汁酸(见图2和图3),这3组的血清胆汁酸谱有明显差异,将有助于I C P的诊断和鉴别诊断。
图2 妊娠期肝内胆汁淤积症患者血清胆汁酸的M RM 色谱图F ig .2 M R M chro m atog ra m of b ile ac i ds i n a seru m sam -p l e fro m a patient w ith i ntrahepatic cho lestas i s o f pregnancy (ICP)图3 3组15种胆汁酸的浓度( X S D, mo l/L,n =5)F i g .3 Concentration of 15bil e acids for t he three group (mean SD , m o l/L,n =5):正常孕妇(healt hy pregnan ci es);:妊娠期肝内胆汁淤积症患者(I CP);:ICP 伴有乙型肝炎患者(ICP w it h HBV ).R eferences1 Y ouse f I M,Pe r w aiz S ,Lam ireau T,Tuchw eber B .M ed .Sci .M onit ,2003,9(3):21~312 S j va ll J .L i p i d s ,2004,39(8):703~7223 D i ng M in (丁 敏),L iu Chun -F ang(刘春芳),H e Jun(何 俊).J ournal of A nal y tical Science (分析科学学报),2004,20(5):492~4944 M eng L J ,Sjovall J .J.Chromatog r .B ,1997,688(1):11~265 Burkard I ,von E ckardstein A,R en tsch K M.J.Chroma t ogr .B ,2005,826:147~159Simultaneous Deter m ination of Free andConjugated B il e Acids i n Seru m by H i gh Perfor m ance L i qui dChro matography -Tande m M ass Spectro m etryD i ng M in *1,Y e L ian 1,W ang M eng 1,Shao Y ong 21(D e p ar t m ent of Laboratory M edicine ,K ey Laboratory of C linical Laboratory D i agnostics ,M i nistry of Education,Chongq i ng M e d ical U ni ver sity,Chongqing 400016)2(D epart m ent of O b stetr ics and Gynecolog,t he F istA ff iliate d H o s p ital of Chongqing M edical Universit y,Chongq i ng 400016)Abst ract A m ethod has been developed for the deter m i n ati o n of i n div i d ual free and con j u gated bile acids by li q u i d chro m atography tende m m ass spectro m etry (H PLC -M S /MS ).B ile aci d s w ere extracted fro m ser umsa m ples using cartridges and eluted usi n g gradient on a C 18colu m n .E lectr ospray ion isati o n (ESI)w as perfor m ed i n the negative i o n m ode .The e l u tions were monito red i n mu ltiple reacti o n-m onitori n g m ode .The li n ear ranges of the m ethod were 0.10-100.0 m ol/L w ith the correlation coeffients fr o m 0.9990to 0.9999for all b ile ac i d s .The detecti o n li m it ranged fr o m 0.001to 0.006 mo l/L .The i n tra -day precisi o ns w ere belo w 3 0%and the i n ter -day precisions w ere belo w 6.0%for all bile .The average recoveries of the extracti o n pr oce -dure w ere bet w een 86.0%and 110.0%.The deve l o ped m ethod w as suitable for the routine cli n i c al practice .K eywords B ile ac i d s ,serum ,h i g h perfor m ance liqu i d chro m atography ,m ass spectro m etry -m assspectro m etry(Recei ved 25February 2007;accepted 14M ay 2007)1508分析化学第35卷。