细胞周期的检测方法
2014-5-6 PI法细胞周期检测
细胞周期检测（PI法）一、实验方法原理细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。
一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。
因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。
通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。
PI 为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
细胞周期示意图如（图一）所示（图一）二、材料及准备工作1.材料准备试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括RNase-A 贝博试剂盒中包括PI 贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS 自配2. 试剂配制10XPBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4）以1L量为例：NaCl 80gNa2HPO4·12H2O 32.3gNaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。
PI染色检测细胞周期实验步骤
PI染色检测细胞周期实验步骤细胞周期是细胞分裂和增殖的过程，通常可以通过PI（propidium iodide）染色来检测。
PI是一种DNA结合染料，能够与DNA结合形成荧光化合物，通过检测荧光信号的强度可以推断细胞处于细胞周期的哪个阶段。
以下是PI染色检测细胞周期的实验步骤：材料和试剂：1.培养皿：可容纳细胞的培养皿。
2.培养基：细胞所需的培养基。
3. Propidium iodide（PI）：DNA结合染料。
4. RNase A：消化RNA的酶，可用于将RNA从细胞样品中降解。
5.细胞刮板：用于收集细胞。
6.离心管：用于离心细胞样品。
7.显微镜幻灯片：用于观察染色后的细胞。
步骤：1.准备培养皿：在培养皿中加入适量的培养基，使其能够完全覆盖细胞。
2.培养细胞：将需要检测细胞周期的细胞加入培养皿中，按照细胞的培养要求进行培养，培养至细胞密度适合进行实验。
3.收集细胞：用细胞刮板或其他方法，将细胞从培养皿中收集到离心管中。
4.细胞固定：将收集到的细胞进行固定，可以使用70%乙醇或其他细胞固定剂进行处理，固定时间通常为30分钟。
5.细胞孵育：将固定的细胞在4℃下孵育过夜，以保证细胞完全固定。
6. 细胞溶解：在离心管中加入RNase A（最终浓度一般为1mg/ml），以降解细胞中的RNA，避免对细胞周期分析结果的干扰。
7. 细胞染色：在离心管中加入适量的PI溶液（一般最终浓度为50μg/ml），将PI与DNA结合，产生荧光信号。
8.染色孵育：将含有PI的细胞溶液在4℃下孵育30分钟至1小时，使PI完全结合到DNA上。
9.细胞分析：将染色后的细胞用离心机离心，去除上清液，保留细胞沉淀。
10.流式细胞仪分析：将细胞沉淀重新悬浮在PBS缓冲液中，使用流式细胞仪进行细胞周期分析，记录和分析PI的荧光信号的强度。
11.显微镜观察：将细胞沉淀取出，在显微镜幻灯片上制备细胞悬液，并使用荧光显微镜观察细胞的DNA染色情况。
PI染色法检测细胞周期
PI染色法检测细胞周期一．实验原理及试剂配置1.实验原理P I , 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA 消化后, 通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的P I 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同, 通常正常细胞的G 1/ G 0 期具有二倍体细胞的DNA 含量( 2N) ,而G 2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量( 4N) ,而S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。
因此，通过流式细胞术P I染色法对细胞内DNA 含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G 1/ G 0 期，S 期和G 2/ M 期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。
值得注意的是，PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时, 必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性, 才能使P I进入细胞内与细胞内的核酸结合。
乙醇通常为终浓度为70 %的冷乙醇。
2.试剂配制RNase A，注意分装保存，防止反复冻融。
PI 购自Sigma公司货号P-4170，通常用过滤除菌的PBS配置成500μg/ml的储液避光保存备用，细胞染色时用PBS稀释到50μg/ml。
二．实验步骤1.细胞的收集：将处理好的细胞样品组用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞呈单细胞悬液，DMEM+10%FBS终止消化后，200g离心3min沉淀细胞。
2.细胞的固定：将离心收集的细胞用500μL预冷的PBS悬起，200g离心3min沉淀细胞，弃上清，以充分去除残留的FBS和胰酶；加入-20℃预冷的70%乙醇500μL悬浮细胞，于4℃固定30min或-20℃固定过夜。
（此处，加乙醇时应注意边加入变吹起细胞，放置固定时细胞结成团，难以吹散而影响后续的检测）3.RNA的去除：将固定好的细胞，200g离心5min沉淀细胞弃去上清液；500μL预冷的PBS悬浮细胞，200g离心3min沉淀细胞，弃去上清液；用500μL 100μg/ml的RNase A 在37℃下温育30min以充分降解细胞内RNA。
PI染色法测细胞周期
PI染料与DNA结合
PI染料能够选择性地结合DNA，通过 荧光显微镜可以观察到染色后的细胞 核。
数据分析
通过特定的软件对数据进行处理和分 析，可以获得细胞周期的分布情况。
细胞周期分析
通过对染色后的细胞核进行荧光强度 和面积的测量，可以分析细胞的细胞 周期状态。
PI染色法的应用
肿瘤研究
通过PI染色法可以研究肿 瘤细胞的细胞周期变化， 为肿瘤的诊断和治疗提供 依据。
05
注意事项
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中进行，以减少有毒气体的吸入。
02
实验过程中应佩戴实验服和化学防护眼镜，以防止试剂溅到皮
肤或眼睛。
实验后应将废液倒入指定的废液收集容器中，不要随意倾倒。
03
实验操作注意事项
确保细胞浓度适中， 以保证计数准确性。
在洗涤过程中要彻底 去除多余的染料，以 免影响计数结果。
02
PI染色法原理
PI染料的特性
01
02
03
高荧光强度
PI染料具有高荧光强度， 能够有效地与DNA结合， 发出强烈的荧光信号。
专一性
PI染料只与DNA结合，不 与其他细胞成分结合，具 有专一性。
细胞膜通透性
PI染料能够透过细胞膜， 与细胞核中的DNA结合， 实现对细胞核的染色。
PI染色法的原理
干燥细胞
让涂片自然干燥，以便更好地观察染色效果。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察涂片，记录不同时期细胞的 染色情况。
04
结果分析
细胞周期各期的划分
G1期
细胞开始生长，DNA合成前期 ，细胞体积逐渐增大。
S期
DNA复制期，细胞核内DNA含 量加倍。
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一--PI法
组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法schoman无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。
主要操作步骤如下：1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。
2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。
3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。
4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。
5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。
注意事项：1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。
如组织难以消化，可加入适量胶原酶。
另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。
2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。
3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。
4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。
其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。
在此不赘述。
yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA 结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。
应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。
偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。
细胞周期测定实验
细胞周期测定实验细胞计数法：实验方法原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。
它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。
分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。
实验材料细胞试剂、试剂盒胰酶甲醇培养液冰醋酸Giemsa染液仪器、耗材CO2培养箱普通显微镜培养皿盖玻片吸管实验步骤一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。
二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。
三、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。
四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。
五、计算分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%展开注意事项1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。
其他一、Giemsa染液配制称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。
56℃中保温90-120分钟。
加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。
使用时按要求用PBS稀释。
一般稀释10倍。
BrdU参入法实验方法原理细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。
从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。
细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。
如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。
细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。
计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。
实验材料细胞试剂、试剂盒BrdU 甲醇冰醋酸Giemsa染液秋水仙素SSC 柠檬酸三钠NaCl仪器、耗材冰箱玻片水浴锅锅盖紫外灯光学显微镜实验步骤一、试剂配制1. BrdU配制BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。
细胞周期检测方法
细胞周期检测方法细胞周期检测是指利用特定的实验方法和技术来研究和分析细胞的生命周期和不同阶段的变化。
细胞周期是指细胞从一个时间点开始进行DNA复制，到下一个DNA复制结束之间的时间段。
细胞周期检测方法可以帮助我们了解细胞的增殖、分化和死亡过程，并在生物医学研究中发挥重要作用。
本文将介绍几种常用的细胞周期检测方法。
一、流式细胞术流式细胞术是一种常见的细胞周期检测方法，通过利用细胞在流式细胞仪中流动时吸收和散射光的不同特性来分析细胞的周期。
在流式细胞术中，可以使用DNA 染料（如普罗津红或荧光素）将细胞的DNA染成不同浓度的颜色，根据DNA 含量的不同来分析细胞处于不同的细胞周期阶段。
此外，流式细胞术还可以利用蛋白标记和单克隆抗体来检测特定细胞周期蛋白的表达水平。
流式细胞术准确、快速、灵敏，可以同时检测大量的细胞，因此被广泛应用于细胞周期的研究和生物医学领域。
二、免疫荧光染色法免疫荧光染色法是一种利用免疫学技术和荧光探针对特定蛋白进行定位和分析的方法。
在细胞周期检测中，可以利用特定蛋白的表达来反映细胞处于不同的细胞周期阶段。
例如，细胞周期蛋白D（Cyclin D）在G1期表达增加，在细胞周期的S期和G2期表达较低。
通过使用与Cyclin D特异性结合的荧光探针，可以在细胞中观察和分析Cyclin D的表达情况，从而判断细胞处于细胞周期的哪个阶段。
三、细胞核酸染色法细胞核酸染色法主要利用染色剂（如乙锭、Hoechst33342等）染色DNA分子，观察和分析细胞核的形态和DNA含量的变化来判断细胞的细胞周期阶段。
在染色前后使用不同颜色的荧光染料来观察和分析细胞核的变化。
通过测量细胞核中DNA含量的变化，可以确定细胞处于细胞周期的哪个阶段。
此外，细胞核酸染色法还可以与流式细胞术或免疫荧光染色法相结合使用，进一步提高细胞周期的检测准确性和灵敏度。
四、蛋白质组学方法蛋白质组学方法是一种通过比较和分析细胞中蛋白质的表达、修饰和互作来研究细胞功能和生命周期的方法。
流式检测细胞周期protocol
PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。
试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。
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1、收集样本细胞，细胞数量在 10X105 个以内。 1、 用冷 PBS 洗涤细胞两次。 2、 75％冰冻乙醇-20℃固定 1 小时或 4℃固定过夜。 3、 用冷 PBS 洗涤细胞一次。 4、 用 200-500ul 冷 PBS 重悬细胞。 5、 加入 Rnase A 溶液 20ul 37℃水浴 30 分钟。 6、 400 目筛网过滤。 7、 加入 400ul 染液，轻轻混匀后 4℃避光孵育 30 分钟-1 小时。 8、 流式检测结果。最大激发波长为 488nm。
BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133
产品说明书
JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒
参考文献：
● 马玉樊 卢婷利等. 中国细胞生物学学报,
二氢青蒿素对人成骨肉瘤 MG-63 细胞凋亡的诱导作用. 2011, 33(12): 1324–1330
● 张春晶 顾立刚等. 黄芩苷干预甲型 H1N1 流感病毒感染诱导的 A549 细胞周期分布及凋亡. 病毒学报, 2011, 2.
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