细胞周期的流式检测方法
全程服务（六）流式细胞仪周期检测
全程服务（六）流式细胞仪周期检测大家总是想让自己的实验数据有不动声色的高级感，流式细胞仪检测就是细胞生物学的必备高级技能。
周期实验是检测药物、基因或蛋白对细胞周期影响的一种检测方法，具体要怎么做呢？且听我道来。
实验原理细胞周期（Cell Cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。
细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。
表1 细胞周期细胞周期特征间期G1期DNA合成前期S期DNA合成期G2期DNA合成后期分裂期M期有丝分裂前、中、后、末期G0期分裂结束后暂时离开细胞周期流式细胞仪用PI染色法检测细胞周期。
由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。
PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。
因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期，S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过软件计算各时相的细胞百分率（如图1所示）图1 流式周期检测图说明技术应用检测异倍体的肿瘤细胞，检测药物、基因或蛋白等对细胞周期的影响。
实验步骤1. 细胞收集：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ ml以1 ml接种24孔板或2 ml接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，用常规胰酶消化并收集于离心管中，然后用PBS洗涤细胞2-3次，制备成单细胞悬液。
2. 细胞固定：1000 rpm离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，用PBS洗涤两次后加入250 µl PBS使细胞重悬，再逐滴加入750 µl预冷的无水乙醇（-20℃），使其终浓度为75% 4℃放置过夜固定。
细胞周期和DNA倍体流式细胞术分析
细胞周期和DNA倍体流式细胞术分析细胞周期是指细胞从一个有丝分裂开始到下一次有丝分裂开始所经历的一系列连续的时期。
细胞周期通常被分为四个阶段：G1期（Gap1期，细胞生长期）、S期（DNA合成期）、G2期（Gap2期，前期细胞准备期）和M期（有丝分裂期）。
细胞周期具有非常重要的生物学意义，它决定了一个细胞的生长、分化和复制过程。
了解细胞周期的调控机制对于研究细胞增殖、肿瘤发生机制等具有重要的意义。
DNA倍体流式细胞术是一种通过荧光染料标记DNA，利用流式细胞术分析细胞DNA含量和细胞周期的技术。
该技术通过细胞破碎和DNA染色使细胞DNA可见，并将细胞通过流式细胞术导入流式细胞仪中进行分析。
DNA倍体流式细胞术可以帮助我们了解细胞的DNA含量和倍体状态，从而推测细胞的生活循环和增殖能力。
DNA倍体流式细胞术的主要步骤包括：1.细胞处理：将细胞收集并进行预处理，使其达到适宜测量的状态；2.细胞固定：使用适当的化学物质固定细胞，以便于后续的染色和分析；3.DNA染色：通过DNA染色剂（如荧光素染剂）染色细胞DNA，使其可见；4.流式细胞术：将染色后的细胞通过流式细胞仪分析流式细胞术；5.数据分析：根据细胞染色的荧光强度和形态学特征来判断细胞周期和DNA倍体状态。
细胞周期和DNA倍体流式细胞术在分析细胞生命活动和基因组复制状态方面具有广泛的应用前景。
首先，细胞周期和DNA倍体流式细胞术可用于研究肿瘤的发生和发展机制。
在肿瘤细胞中，由于基因突变等原因，细胞周期的调控失去平衡，细胞周期的不正常分布和DNA倍体异常常常出现。
通过检测细胞周期和DNA倍体状态，可以更好地了解肿瘤细胞的生物学特性，从而为肿瘤治疗提供理论依据。
其次，细胞周期和DNA倍体流式细胞术还可用于研究细胞分化和发育过程。
细胞分化和发育是多个细胞周期的连续进行，通过细胞周期和DNA 倍体状态的测量，可以揭示不同细胞类型的分化和发育过程的调控机制，进一步推测细胞分化和发育的时序和关系。
流式检测细胞周期protocol
PI染色检测细胞周期
1、HepG2细胞培养至70%左右，细胞铺板（60mm小皿），8万/皿，饥饿48小时，加药处理96h（加药组10万/皿）
2、收集培养基，2ml胰酶消化细胞，新培养基3ml重悬，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心
3、弃去上清，加入1ml预冷的PBS充分重悬细胞，转移到1.5ml的EP管
4、混匀，4°，600g，5min离心
5、弃去上清，用250ul预冷的PBS重悬细胞，充分重悬，加入至750ul冰浴的无水乙醇，轻轻吹打混匀；
6、用封口膜封口，—20°，4h，最好过夜，可在—20°保存1w左右；
7、染色：
㈠、除去封口膜，加入500ulPBS重悬细胞，4°，600g，5min离心；
㈡、弃去上清，加入1ml预冷的PBS洗涤一次；
㈢、同上离心，弃去上清；
㈣、每管加入200ul PBS +2ul RnaseA（100µg/ml）溶液缓慢充分混匀后，室温，避光孵育30min, 再加2.5ul PI(250µg/ml)，室温避光15min；
㈤、24h内流式检测。
试剂：RnaseA，beyotime,10mg/ml,ST576
PI, beyotime,20 mg/ml,ST512。
PI单染流式细胞术检测细胞周期
1.消化：将细胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化1-3min，（时间尽可能长，以减少吸管吹打），待消化充分，弃去胰酶，加入PBS5ml。
2.收集细胞：吸管吹打，移入离心管。
3.低速度离心：1000转5min弃去上清。
4.反复漂洗离心：加入PBS5-8ml，低速离心，同上步，重复3次，以除去细胞碎片。
5.获得单细胞悬液：加入1mlPBS，调整单细胞悬液至1-5*10^6/l，吸管吹打，制成单细胞悬液，4度保存。
6.PI染液制备：100ml去离子水加入5mgPI。
调PH值7,2-7。
4度棕色瓶保存。
4度避光保存。
7.、加入-20度预冷的乙醇。
4度过夜。
8.1000转5分钟离心弃去上清，
9.加入3mlPbs重悬。
10.1000转5分钟离心弃去上清，
11.加入100ulRNA酶37度水浴孵育30min
12.加入500ulPI染液4度避光孵育30min
13.上机前轻弹试管，，设立PI单染细胞组，检测。
流式检测细胞周期的原理
一．细胞周期的检测1、原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。
（n----2n）2、我们使用PI来标记DNA。
PI的通到是FL23、荧光信号的表示方法，有荧光的宽度（W），荧光的高度（H），和荧光信号的积分面积（A）.我们使用荧光的积分面积（A）来检测细胞周期的变化.因为，即使DNA的含量相同的两个细胞，如果细胞的形状差异较大，荧光信号的高度是不相等的。
但是积分面积一定相等。
4.接下来我以二倍体细胞为例降解，流式检测细胞周期的过程。
首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有G1期，S期,G2期和M期。
我们来分析下各个时期DNA含量的变化。
G0期DNA数目为n.G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成, DNA数目为n.S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目从n变为2n.G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2nM期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n.从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，s期，G2/M期.我们利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果G0/G1期处于50的位置，那么G2/M期处于100的位置。
期间的为S期。
4、但是有个问题值得我们注意。
我们的样本很容易聚集有时候两个G1期的细胞会聚集在一起形成粘连体，通过激光照射区时，其荧光强度会和G2期的相同，这就需要排除粘连体。
我们BD公司的专利技术可以使粘连体通过检测区的荧光宽度比G2期的长。
我们利用W对A的散点图分析，如果G0/G1期在50的位置，那么G2/M期在100的位置，其他的位置为粘连体和一些不符合检测的细胞及碎片等。
我们通过画门来得到我们需要检测的细胞。
5、因此我们需要三个图就可以检测到我们的细胞周期变化情况，第一个散点图，通过前向和侧向的变化，区分出我们要检测的细胞群。
第二个散点图我们出去粘连体。
第三个直方图得到我们的细胞周期变化。
pi细胞周期流式分析门控策略
pi细胞周期流式分析门控策略
pi细胞是指在生长和复制阶段中DNA含量翻倍的细胞，在细胞周期的G1期至S期转换时异常积累。
流式细胞分析是一种可以测量细胞表型、形态、DNA含量以及细胞周期等参数的技术，因此可以用于pi细胞的检测。
门控策略是利用多因子分析法对细胞进行区分和分析。
对于pi细胞，通常采用PI（propidium iodide）染色法，将细胞DNA染色红色并流式分析。
流式细胞分析仪采用多重荧光检测系统，如蓝色激光与PI荧光可以实现细胞DNA含量的检测。
利用细胞DNA含量与细胞周期之间的关系，通过设置特定的门控来筛选pi细胞。
例如，双参数图设置红色荧光右移阈值和细胞数计数阈值，就可以检测pi细胞的比例和细胞环境下pi细胞的数量。
这种门控策略可以鉴别pi细胞并研究其生理特征和生物学过程，是对肿瘤细胞增殖和恶化机制的研究非常有帮助的技术。
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操纵步调之杨若古兰创作取对数生持久的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比方加药,照耀）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中↓1000rpm离心5min（短时低速离心）↓弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞悬液内的细胞碎片↓加入1.5ml预冷PBS,在涡旋形态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃持久保管.↓1000r/min,离心5min↓将乙醇吸除，加PBS清洗混匀↓1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去↓吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)↓↓将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP 管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标识表记标帜EP管↓提前一天网上预定↓开机（先开仪器后开软件）↓流式细胞仪的结构普通分为5部分：①流动室及液流驱动零碎；②激光光源及光束成形零碎；③光学零碎；④旌旗灯号检测、存贮、显示、分析零碎；⑤细胞分选零碎.↓检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后拔出流式细胞仪上↓流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中间喷出，构成细胞液柱↓液柱与激光束订交，细胞上的荧光染料被激发发生荧光（488nm激发光源）↓荧光旌旗灯号酿成电旌旗灯号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）↓在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析——Modfit软件分析图片拷贝：直接Ctrl+C ——Flowjo软件分析FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M.G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布↓检测结果刻录光盘保管↓关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞DNA含量：2n-4n凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性添加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少.PI染色后，荧光强度减小而构成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）.1、纵坐标Cell Number：即计数的无效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中曾经标示；4、右边数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA 含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡基来源根基理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不克不及透过正常细胞膜，只能进入曾经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系.正常细胞：膜完好，PS不过翻——PI-/AnnexinⅤ-凋亡初期：膜完好，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+凋亡初期：PS外翻，膜通透性添加——PI+/AnnexinⅤ+坏死细胞：膜严重破损，PS不过翻——PI+/AnnexinⅤ+几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-实验步调：取对数生持久的细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内↓24h后，进行所需的处理（比方加入药物）↓特定时间后终止培养，进行下一步的实验↓细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不容易过长，以防惹起假阳性）↓加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）↓倒置显微镜下观察细胞形态（单个分离悬浮）↓将细胞悬液移入15ml离心管中↓2000rpm离心5min,PBS吸除↓用PBS 清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）↓用400ul 1×Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1×106cells/ml)↓在细胞悬液中加入5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15 min↓加入10ul PI 后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5 min↓在1 h内用流式细胞仪检测流式细胞仪激发光波长采取Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射波长检测PI.细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包含极初期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色.在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，浮现Annexin V +/PI-.。
细胞实验技术之细胞周期检测
细胞实验技术之细胞周期检测导读细胞周期是指细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的时间，它代表着生命从一代向下一代传递的连续过程，与前几期我们介绍过的细胞学实验（细胞增殖、克隆形成等）一样，细胞周期也是评价细胞增殖功能的重要实验。
流式细胞仪是检测细胞周期最常用的方法，然而我们会碰到细胞量不够、细胞碎片太多等原因，导致实验一次次重复，本文就一起看看如何把细胞周期的数据变的更加漂亮，准确！一、细胞周期简介主要分为以下2大过程：1.分裂间期：间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）；2.分裂期M期：细胞分裂期，指细胞分裂开始到结束。
细胞周期图（来自网络）•注：G0期是指某些细胞在分裂结束后会暂时离开细胞周期，停止细胞分裂；但在一定适宜刺激下，又可进入周期；•因为分裂间期持续的时间远远比分裂期持续时间长，在一个正常细胞周期中，分裂间期时间会占整个细胞周期的90%～95%；•不同类型细胞的G1期时间长短不同，所以其细胞周期时间存在差异。
如：人类胃上皮细胞为24小时，骨髓细胞为18小时，HeLa细胞为21小时。
二、常用的实验方法细胞周期常用检测方法有流式检测法、BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)掺入法及同位素标记法等，其中流式检测法因适用于大量样品检测，可快速分析单个细胞的多种特性，是目前最为常用的测定细胞周期的一种方法，下面就详细介绍如何利用流式细胞仪进行周期分析。
1. 流式检测的实验原理由于细胞周期各时相的DNA含量不同，因此，可通过特异性与DNA结合染料来检测细胞内的DNA含量来测定细胞周期。
流式中常用碘化丙啶(Propidium，简称PI)与DNA结合，其荧光强度与DNA 含量成正比。
因此，通过流式细胞仪对细胞内DNA含量进行检测，同时获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。
2. 流式细胞仪的实验步骤A. 收集细胞取适量的对数生长期细胞接种于6cm中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，倒去培养基，用胰酶适度消化细胞，离心收集细胞，弃去上清；Tips:•细胞数量：一般情况下，由于在细胞周期中分析的细胞数应达到1.0*104~3.0*104才具有统计学意义。
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细胞周期的流式检测方法
细胞周期（cell cycle ）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，
分为G0/G1 期、S 期、G2/M 期。
在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分布进行
检测的需求。
细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是PI（碘化丙啶）渗入DNA 进行染色，然后通过流式细胞仪检测PI 从而测定细胞群体的周期分布。
因此，下面笔者主要通过BD（Becton＆Dickinson ）公司生产的BD FACSCalibur 流式
细胞仪测定PI 标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。
一、PI 染色步骤概略
1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min ，弃上清。
2、PBS 1ml 离心，弃上清。
3、70%酒精2ml，4℃，30min，离心，弃上清液。
4、PBS 1ml 离心，弃上清。
5、RNase A 的PBS 溶液(20ug/ml) ，500ul，37℃，30min，离心弃上清。
6、PBS 1ml 离心，弃上清。
7、PI 的PBS 溶液(50ug/ml) ，500ul，室温避光孵育30min。
8、吹打混匀，300 目筛网过滤至流式管中，4℃保存，待测。
二、Calibur 仪器设置及数据收集
1、依次打开Calibur 机器电源、电脑开关和CellQuest Pro 软件，按快捷键Command+B 连机，
按快捷键Command+1 、2、3、4 调出Detectors/Amps 面板、Threshold 面板、Compensation
面板和Status面板，软件的操作界面如图 1 所示。
图1. Cell Quest Pro 软件操作界面
2、建立实验模板，包括FSC/SSC 散点图、FL2-W/FL2-A 散点图和FL2-A 直方图。
因为PI
在Calibur 上是由488nm 的激光器激发，530/30 滤光片收集信号，所以选择FL2 通道进行检
测。
细胞周期是2N 和4N 的循环，所以FL2 通道的Mode 参数应设置为Lin 模式，同时阈
值（Threshold）的Primary Param 参数设置为FL2-H ，Four Color DDM Param 参数设置为FL2，
如图2、图 3 所示。
图2. Detectors/Amps 面板图3. Threshold 面板
3、设置细胞的收集数目，数据保存的路径和名称，如图
4、图5 所示。
图4. Acquisition ＆Storage面板
图5. Acquisition 面板
4、在图6 所示的操作面板中，勾选Setup 选项，点击Acquire 按钮进行数据收集并调节FL2
通道的电压值使得周期图位于FL2 直方图中合适的位置。
调好电压后，将Setup 选项勾掉，点击Acquire 按钮收集数据。
数据以.FCS 格式保存在之前预设好的文件夹中。
图6. Acquisition Control 面板
三、细胞周期数据的分析
流式数据分析软件有很多种，比如Cell Quest、BD FCAS Diva 、FlowJo 等等。
但对于细胞周
期数据的分析，统一的分析步骤如下：
1、建立FSC/SSC 散点图，圈定细胞群，如图7 所示。
图7. FSC/SSC 散点图
2、建立FL2-W/FL2-A 散点图，去除粘连细胞，如图8 所示。
图8. FL2-W/FL2-A 散点图
3、建立FL2-A 直方图分析细胞周期，如图9 所示。
图9. FL2-A 直方图。