流式细胞仪检测细胞周期操作步骤之欧阳家百创编
流式细胞仪的使用程序
流式细胞仪的使用程序------血液病实验诊断中心一.开机程序1.检查稳压器电源,打开电源,稳定5分钟。
2.打开储液箱,倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。
打开压力阀,取出鞘液桶,将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水,做分选必须用PBS 或FACSFlow),合上压力阀。
确实盖紧桶盖,检查所有管路是否妥善安置。
3.将FACSCalibur开关打开,此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY,预热5-10分钟。
排出过滤器内的气泡。
4.如果需要打印,打开打印机电源。
5.打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。
6.执行仪器PRIME功能一次,以排除Flow cell中的气泡。
7.分析样品时,先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。
做过分选后,每次开机后需冲洗管道:向分选装置上装上两个50ml离心管,不接通浓缩系统,摁下右下角白色按钮开始冲洗。
待自动停止后接通浓缩装置,同上法冲洗一次。
二.预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1.从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗,可利用此视窗编辑一个获取模式文件。
2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot,绘出一个或多个Dot Plots(点图)。
从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源,并确定适当的x 轴和y轴参数。
3.选取屏幕左列绘图工具中的Histogram,同上法可绘出Histogram(直方图)。
4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中,下次进行相同实验时可直接调用。
. 本计算机中已设定两个模式文件:ACQ和EXP,储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中,ACQ用于细胞DNA检测, EXP用于细胞表面标志分析。
手把手教你流式细胞周期检测（一）
手把手教你流式细胞周期检测（一）细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
G2期和M期：当DNA复制成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
从DNA含量我们同样无法区分G2期和M期。
流式细胞仪工作原理：将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是经典的周期检测方法。
PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
图片来自网络1材料准备6孔板；15ml离心管；胰酶；RNase-A；PI；无水乙醇（四度冷藏）；PBS2仪器设备流式细胞仪；离心机；水浴；锡箔纸3实验步骤及注意事项：（以细胞加药为例）细胞样品的准备细胞消化和固定后不可过度吹打,防止细胞碎片1. 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)2. 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;3. 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。
流式分析细胞周期
流式分析细胞周期
最近在做加药物的细胞周期，做了好几次，出现如下图的流式拟合图，师姐们都说你这样的拟合是强行的拟合，s期不明显，需要重新做，可是做了好多次还是这样的结果。
望专家教教我是哪里出错。
做细胞周期的步骤是：
1. 先铺板，2E5/孔。
过夜培养后加药（24h）
2. 再经过24h后可以进行测量。
3. 收集上清，并用PBS洗涤，再用胰酶消化，接着用PBS再洗一遍（在15ml管子中进行）
4. 1500转离心，小心去除上清，加入1ml的预冷PBS（记得要冲洗一下管壁），混匀后吸到1.5ml管中，再次在大厅中的离心机1500转4-5min（经过这样的一遍洗涤即可）
固定
5. 用枪吸走上清，剩余50ul左右，切勿吸走细胞，随后➕300ul 预冷PBS（用左手拿着EP管小拇指抵住涡旋震荡仪，右手拿住吸有700ul的乙醇的枪）缓慢打入其中，（这个过程尽量要慢）
6. 置于-20°冰箱中20min（有的说1h），若是过夜要要置于4°（有的说4h以上）
7. 1500转离心3-5min，小心吸上清
8. 加入1ml预冷PBS，重悬
9. 1500转离心3-5min，吸取上清，轻弹
染色
10. 0.5ml/管的碘化丙锭染色液（PI）缓慢加入，并充分的混匀
11. 37°避光30min
先配好染色的溶液
12. 4°避光存放2h
13. 上流式仪。
BD-FACSCalibur 流式细胞仪-细胞周期-操作步骤
BD/FACSCalibur流式细胞仪检测细胞周期操作步骤1、先给鞘液桶接超纯水。
2、把鞘液桶装上，拧紧。
3、开左边开关，从右向左依次打开，即总电源插头-交流稳定电压-插板-稳定输出电源。
（关机时从左向右关）。
4、按流式细胞仪开关。
换上新的已装超纯水的流式管。
5、将减压阀调至“run”（水缸旁边的黑色按钮）。
6、排气：将白色的手动排气阀从小头向大头移动，排气，2-3次，至无气泡。
最后停至小头。
自动排气：开始时是“低速”“standby”，调至“低速”“prime”，待排气完成会自动跳到“standby”，如此循环，到流式管内无气泡为止。
7、插电脑白色插头，打开电脑。
8、到无气泡时候调到“hign”“run”。
9、输入开机密码，打开电脑桌面上的“CELLQuest”（第四个图标）启动软件。
File→open Document→date→先找到打开自己之前的文件（cell dw 2018LSD）→Acquire→Connect to Cytometer→Acquisition面板中点击“change”修改文件名和日期，count改成1，即从第一个开始。
10、Acquire→counters→点击下面Acquisition control面板中的Acquire，看是否正常。
11、上样。
使仪器处于low run状态，样品管支架左移，上样品管后支架回位。
确认Acquisition control 窗口中Setup前需打勾（即不收集数据，用于仪器设置），点击Acquire。
仪器设置完成后，取消Setup前的“√”，点击Acquire 正式开始收集数据。
调界面操作：Cytometer → Detectors/Amps出现 Detectors/Amps 界面后，调FSC和SSC和FL2和FL2-W。
FSC调节的是门内(R1)细胞位置的左右，FSC的“Voltage”调到“E-1”，“E-1”是指个体很大细胞；“Amo Gain”的值调节门内(R1)细胞位置的宽度。
流式细胞仪操作流程(单标)
流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。
（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。
3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。
以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。
4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。
三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。
2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。
3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。
4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法
流式细胞仪检测细胞周期原理和方法I流式细胞仪（FCM ）检测细胞周期的原理和方法高考和模拟试题中经常会出现流式细胞仪检测细胞周期图像，那么, 什么是流式细胞仪？如何检测细胞周期?流式细胞仪是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检査相比，具有速度快、精度高.准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
流式细胞仪，乂称荧光激活的细胞分选器，作为进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体力学、图像技术、细胞生物学、免疫学理论于一体，是一种非常先进的检测仪器,被誉为生物医学实验室的“CT"。
流式细胞术已经成为一种用途最广泛和最先进的细胞分析技术，在细胞生物学、血液学、肿瘤学、免疫学等基础和临床医学领域发挥着重要作用。
流式细胞讣的基本结构流犬细胞计主要山流动室与液流系统、激光源与光学系统、光电管与检测系统、计•算机与分析系统四部分组成（如典例分析 槽品»・正电荷偏 •分光的向第散射尤检测話 植満充Mi 信号•夕 ••負电（2015年北京高考试题）流式细胞仪可根据细胞中DNA 含量的不同对细胞分别计数。
硏究者用某抗癌药物处理体外培养的癌细胞，24小时后用流武细胞仪检测，结果如图。
对检测结果的分析错误的是【答案】C【解析】从题目图中我们不难看出有两个峰值细胞的数U 最多，分别 对应的DNA 含量为40和80。
可知40的应该是处于分裂间期的G1期细胞，G1期时间比较长。
而80的细胞应该是属于G2期和分裂期的细胞，DNA 含量已经加倍。
因此A 选项中b 峰中细胞的DNA 含量是a 峰中的2倍是正确的。
B 选项中a 峰和b 峰之间应该是细胞周 期中的S 期，正在进行DNA 分子复制。
C 选项中，处于分裂期的细胞DNA 含量处于加倍状态，应该i|•数在b 峰中。
D 选项通过看右侧图可知b 峰明显下降，可知应该是抑制了 DNA 分子的复制，DNA加倍的细胞明显减少，所以D 选项正确。
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞仪操作流程
查看文章流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ2008-11-01 10:20一PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器l PBS溶液（配制方法见附录）；l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
l 70%乙醇l 400目筛网l 流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
欧阳家百（2021.03.07）
取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内
↓
24h后，进行所需的处理（比如加药,照射）
↓
特定时间后终止培养，进行下一步的实验
↓
收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入
15ml离心管中
↓
1000rpm离心5min（短时低速离心）
↓
弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细
胞悬液内的细胞碎片
↓
加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。
↓
1000r/min,离心5min
↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀
↓
1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去
↓
吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶
（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min)
↓
加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min
↓
将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管
↓
提前一天网上预约
↓
开机（先开仪器后开软件）
↓
流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；
②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。
↓
检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
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流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱
↓
液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm
激发光源）
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荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞
DNA 分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）
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在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出
结果分析——Modfit 软件分析
——Flowjo 软件分析
FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S 、G2M 。
G0/1和G2M 细胞峰的 DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布
↓
检测结果刻录光盘保存
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关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）
正常细胞DNA 含量：2n-4n
图片拷贝：直接Ctrl+C
凋亡细胞：核内DNA断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内DNA含量减少。
PI染色后，荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n的分布区（亚G1峰）。
1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
2、横坐标DNA Content：即DNA含量；
3、G1、G2、S三期在图中已经标示；
4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；
Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡
基本原理：
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合；PI是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链DNA后释放红色荧光，荧光强度与PI结合量呈良好的线性关系。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ-
凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+
凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+
坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
实验步骤：
取对数生长期的细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于培养皿内
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24h后，进行所需的处理（比如加入药物）
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特定时间后终止培养，进行下一步的实验
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细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）
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加入PBS制成细胞悬液（移液枪吹打6-8次）
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倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）
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将细胞悬液移入15ml离心管中
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2000rpm离心5min,PBS吸除
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用PBS 清洗细胞2次（2000rpm，离心5min收集细胞）
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用400ul 1×Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为1×106 cells/ml)
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在细胞悬液中加入5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于2-8℃避光
条件下孵育15 min
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加入10ul PI 后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5 min
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在1 h内用流式细胞仪检测
流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm检测EGFP荧光(FL1 channel)和>575 nm的发射波长检测PI。
细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现Annexin V
+/PI-。