免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析
实验常见问题
实验常见问题流式、wb、rt－pcr等实验所需细胞数问题编辑词条发表评论(0)1.流式细胞术所需的细胞数问：我目前准备做流式，要做10个标本，但是细胞总数不多了，我能不能把原来在100ml培养瓶培养的细胞转移到25ml里培养，这样把细胞重悬后，1个100ml的可以分到4个25ml里。
请问这样可以嘛？细胞数够嘛？据说做流式至少要105次方个细胞以上才行。
一位名叫丁香的网友认为：细胞的数量足够了。
你用流式细胞仪测量什么指标？你会用其他药物来治疗吗？如果你讲得很详细，你就能知道你的方法是否合适问：我要用流式测细胞周期，要加抑制细胞增殖的药物，然后自加药的不同时间取样测细胞周期。
这样可行不？丁香网友游荡想：抑制率是多少？建议使用至少50毫升的培养瓶问：请教大家一个问题：因为我做流式需要做很多次，就想到用六孔板做，六孔板的一个孔内的细胞数够不够做一次流式用？有没有人用过这个方法？请大家给个建议。
丁香网友文超认为：够了，流媒体标准的索引需要1X105。
我做到了。
没问题问：因为我做流式需要做很多次，就想到用六孔板做，六孔板的一个孔内的细胞数够不够做一次流式用？有没有人用过这个方法？请大家给个建议。
丁香网友赵一恒认为：够了！流式细胞术所需的细胞数为105，而六孔板的全长可达到106。
问：96孔板的转染能否通过流式细胞术进行分析？流式细胞术分析应使用多少微升悬浮液？非常感谢。
丁香网友赵一恒认为：一般来说，我们用500μl的悬浮液进行电脑检测！！！问：请问流式检测的最小的细胞数量是多少，如果小于一个细胞的话是否就不能采用流式检测了。
流式要求的细胞的最小体积是多少，我最近收集了少量细胞团，30-50微米，因为将细胞团中的各个细胞分离开较难，是否可以用于流式的检测？丁香网网友xtyang认为，如果细胞不能分散成单个细胞悬浮液，就不能用流式细胞仪进行分析。
丁香网友swarm认为，测试中应该至少有2000个细胞，但在最初制备样本时，如果只做了外部标准，样本可以比最小细胞数大一个数量级；但是，如果需要内标，固定液和穿膜液的粘度大，细胞损失也大。
免疫学检验的方法和特点
免疫学检验的方法和特点免疫学检验是一种通过检测和分析机体免疫系统相关指标来评估机体免疫功能的方法。
它可以用于疾病的诊断、预防和治疗过程中，对于研究免疫系统的功能和疾病的免疫机制也具有重要意义。
免疫学检验的方法主要包括体外诊断试验、免疫组化技术和流式细胞术等。
下面将逐一介绍这些方法的特点和应用。
1. 体外诊断试验：体外诊断试验是最常用的免疫学检验方法之一，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫印迹（Western Blot）等。
这些试验通过检测血清中的抗体或抗原来评估机体的免疫状态。
其特点是操作简单、结果准确可靠、样本来源广泛，可以用于检测多种疾病，如感染病、自身免疫病等。
体外诊断试验的优势在于可以进行大规模筛查，对于人群健康状况的监测和疾病的早期诊断具有重要意义。
2. 免疫组化技术：免疫组化技术是利用抗体与组织或细胞中特定分子的结合反应来检测和定位这些分子的方法。
常用的免疫组化技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色（IF）等。
这些技术可以用于检测和定位肿瘤标志物、炎症细胞因子、免疫细胞表面标志物等，对于疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。
免疫组化技术的优势在于可以直接观察到分子的表达和分布情况，具有较高的灵敏度和特异性。
3. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测和分析细胞表面标志物来鉴定和分类细胞的方法。
通过标记细胞表面的抗原或抗体，结合流式细胞仪的高速流式分析技术，可以对单个细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞术可以用于检测和鉴定免疫细胞亚群、肿瘤细胞、干细胞等，对于疾病的诊断和治疗选择有重要的指导作用。
流式细胞术的优势在于可以同时检测多个指标，对于复杂的样本分析有较高的效率和准确性。
免疫学检验的特点包括以下几个方面：1. 高度特异性：免疫学检验方法可以通过特异的抗体-抗原反应来检测和定量分析特定的分子或细胞，具有较高的特异性。
这使得免疫学检验方法在疾病的诊断和治疗中具有重要的优势，可以准确地鉴定和区分不同的疾病类型。
排雷攻略：一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片
排雷攻略：⼀⽂教会你免疫组化、免疫荧光如何制⽚看⽚最近带着新进门的研⼀师妹做实验，师妹问了三个问题：1、免疫组化和免疫荧光的区别？2、这两种实验该在什么情况下选择？3、组织是不是只能做免疫组化，细胞是不是只能做免疫荧光？4、免疫荧光为什么要做DAPI染⾊？我听完之后笑了，这种思考的态度是好的，但其实，师妹问的这⼏个问题就是⼀个问题。
归根结底，涉及到“免疫”⼆字总是离不开抗原抗体反应的，⼆者都属于免疫检测技术⼿段，⽽免疫组化和免疫荧光两项技术都可以应⽤在组织和细胞⽅⾯，前者采⽤的是化学发光的⽅法，后者是荧光。
因为我们在⽂献中看到的，很多⼈都会选择做组织的免疫组化、细胞的免疫荧光，所以这就给初⼊实验室的新⼿们带来了误区。
其实⽹上已经有很多详细的操作步骤，所以⼩六⼉今天想为各位新⼿朋友们总结⼀下我认为的免疫组化和免疫荧光制⽚看⽚的⼩技巧，帮助⼤家排雷区，同时也提出⾃⼰的⼀些疑问，希望能得到解答（因为本⼈只做过组织的免疫组化和细胞的免疫荧光，以下内容以这两⽅⾯为主，内容若有⽋缺，欢迎⼤家补充）。
免疫组化1、取材时要尽量去除⾎液的⼲扰：⼩⿏⿇醉后，从左⼼⽿插⼊针头，⼼尖处剪开⼀个⼩⼝，然后将PBS缓慢打⼊⼼脏中，缓慢跳动的⼼脏会将PBS运送⾄全⾝。
50ml的PBS⽤量对于Balb/c或昆明⼩⿏的体积⽽⾔就已⾜够，这⼀步骤对于像肺、肝和脾脏这样⾎管丰富的脏器取材极为重要。
2、取材时要尽量做到表⾯积⼤、厚度⼩：理想的取材厚度是2mm，这样的尺⼨可以让后续的固定、脱⽔等操作达到理想的效果。
器材选择上，⼿术⼑和超市购买的⼑⽚都可以，只要⼑⽚锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。
因为脏器的表⾯都是弧形，并且质地很软，如果你直接取材，第⼀是不好切，第⼆是弧形的⼀⾯肯定是厚度超标，所以这⾥建议各位将组织置于碎冰上后，沿着长轴在横切⾯处再切⼀⼑取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。
3、取材后的组织需⽴即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗原。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学领域常用的实验技术，它们在细胞和组织的研究中扮演着重要的角色。
虽然它们都是用于检测特定蛋白在生物样本中的表达情况，但在操作方法、原理和应用范围上却有着明显的区别。
在本文中，我将深入探讨这两种技术的区别，并就其在生物医学研究中的应用进行全面评估，以期帮助读者更深入地理解并灵活运用这两种技术。
1. 免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白表达的技术。
它的操作流程大致包括取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、蛋白质检测、染色和显微镜观察等步骤。
在实验过程中，首先需要将样本切片，并通过特定的固定、脱水和包埋步骤将其固定在载玻片上。
随后，利用抗原修复方法还原蛋白的空间结构，以便后续的免疫染色。
接下来，通过加入特定的抗体和标记物，可以对目标蛋白进行特异性染色，并最终通过显微镜观察蛋白在组织或细胞中的表达情况。
2. 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是利用特定抗体与荧光染料结合，通过检测荧光信号的方式来标记和检测生物样本中的特定蛋白表达。
它的操作流程也包括取材、固定、脱水、包埋、切片等步骤，与免疫组化法的操作步骤较为类似。
不同的是，在免疫荧光染色法中，需要利用特定的荧光标记的二抗或荧光素-抗素进行染色，通过激光共聚焦显微镜等设备观察样本中荧光的分布情况，从而检测目标蛋白的表达位置和水平。
在应用范围方面，免疫组化法主要用于研究组织切片或细胞样本中特定蛋白的表达情况，可以定量地评估蛋白的表达水平和分布情况，适用于体内和体外实验样本。
而免疫荧光染色法由于其高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞共聚焦显微镜观察，可以用于检测细胞中蛋白的定位、表达和相互作用等，是细胞生物学和免疫学研究中常用的技术手段。
在本文中，我主要介绍了免疫组化法和免疫荧光染色法的操作原理、步骤和应用范围，并就其在生物医学研究中的应用进行了全面评估。
通过对这两种技术的深入了解，我们可以更好地选择合适的技术手段，并在实验设计和结果分析中更加灵活地运用这些技术来开展生物医学研究。
免疫因子检测方法
免疫因子检测方法免疫因子检测方法是一种用于检测免疫因子（如抗体、细胞因子、细胞表面标记物等）存在和活性的方法。
这些免疫因子在机体中起着重要的免疫监测和调节作用，因此其检测对于研究和诊断免疫相关疾病具有重要意义。
以下将介绍几种常见的免疫因子检测方法。
一、酶联免疫吸附测定法（ELISA）酶联免疫吸附测定法是一种常用的免疫因子检测方法，可用于检测抗体、细胞因子等免疫因子的含量和活性。
它基于免疫反应原理，利用固相底物上的抗原或抗体与待测物特异性结合，并通过化学反应使结合物表现出可测量的信号。
ELISA方法操作简便，灵敏度高，可以同时检测多个样本，并可定量测定免疫因子的浓度。
二、流式细胞术流式细胞术是一种用于检测细胞表面标记物和细胞因子的免疫因子检测方法。
它基于细胞免疫荧光染色原理，通过给细胞标记上特定的荧光抗体，再通过流式细胞仪进行检测和定量分析。
流式细胞术具有高通量、高灵敏度和高分辨率等优点，可以同时检测多个标记物，并通过细胞表面标记物的多参数分析来分辨不同细胞亚群。
三、免疫组化法（IHC）免疫组化法是一种常用的组织免疫因子检测方法，可用于检测组织内抗体、细胞因子等的存在和表达情况。
免疫组化法通过将待测物与特异性抗体结合，再通过染色反应可使抗体反应物表现出可见的颜色或荧光信号。
免疫组化法可以定位和定量分析免疫因子在组织中的分布、表达和定位，对于研究免疫相关疾病的病理机制具有重要意义。
四、免疫电泳法免疫电泳法是一种常用的免疫因子检测方法，可用于检测抗体、抗原等的存在和相互作用。
它利用电泳原理，将待测物分离并定位在凝胶上；再通过将特异性抗体与待测物结合，并通过化学反应可呈现出可测量的信号。
免疫电泳法可以用于检测免疫复合物的形成以及免疫因子间相互作用的强弱关系。
总结起来，免疫因子检测方法包括酶联免疫吸附测定法、流式细胞术、免疫组化法和免疫电泳法等。
这些方法根据免疫原理和检测目标的不同，具有不同的优点和适用范围。
简述猪细小病毒检测方法的研究情况
简述猪细小病毒检测方法的研究情况猪细小病毒是一种来自疱疹病毒家族的病毒，它可以引起猪的呼吸道疾病和生殖系统疾病。
这种病毒对猪的生长和生产性能产生了负面影响，给猪养殖业造成了巨大的经济损失。
猪细小病毒的检测方法对于疾病的控制和预防至关重要。
在过去的几十年里，猪细小病毒的检测方法得到了长足的发展。
早期的检测方法主要是依靠临床症状和病理学检查，这种方法的准确性和灵敏度都比较有限。
随着生物技术的进步，现代的猪细小病毒检测方法变得更加快速、准确和可靠。
本文将对目前常用的猪细小病毒检测方法进行简要介绍，并对各种方法的优缺点进行分析。
一、传统的病原学检测方法1.1 病理学检查病理学检查是一种直接观察病变组织的方法，通过镜下观察来确定病变类型和程度。
对于猪细小病毒感染的猪只，病理学检查可以发现呼吸道和生殖系统等部位的病变，但这种方法缺乏特异性和灵敏度，往往不能准确地确定感染的病原体。
1.2 病毒分离和培养病毒分离和培养是一种通过将样本接种到合适的细胞系或实验动物中，然后观察细胞病变或动物病症来确认病毒感染的方法。
这种方法可以获得活病毒，便于进行进一步的鉴定和研究，但需要较长的时间和较高的操作技能，且不适用于大规模的检测。
1.3 血清学检测血清学检测是通过检测病毒抗体或抗原来确定感染情况的方法。
目前常用的血清学检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合试验（CFT）和中和试验等。
这些方法能够快速、简便地检测到猪细小病毒的感染情况，但无法区分活病毒感染和病毒携带状态。
以上传统的病原学检测方法在猪细小病毒检测中均存在一定的局限性，无法满足疾病监测和控制的需求。
近年来，研究人员不断地探索和开发新的检测方法，以提高猪细小病毒检测的准确性和灵敏度。
二、分子生物学检测方法近年来，随着PCR技术和核酸序列分析技术的发展，分子生物学检测方法在猪细小病毒检测中得到了广泛的应用。
PCR技术可以快速扩增病毒的核酸序列，然后通过电泳或荧光探针等方法来检测扩增产物，具有高度特异性和灵敏度，成为目前猪细小病毒检测的金标准。
细胞生物学中的细胞免疫检测和分析技术
细胞生物学中的细胞免疫检测和分析技术细胞免疫检测技术是细胞生物学领域中的重要研究方法之一，它可以用于检测和分析细胞的免疫状态和功能。
这些技术可以帮助我们更全面地了解细胞免疫过程，促进对疾病机制的理解和疾病诊断的提高。
本文将就细胞免疫检测和分析技术的原理、方法和应用进行探讨。
一、细胞免疫检测技术概述细胞免疫检测技术是指利用特定的抗体标记、细胞共轭物、细胞分选仪等工具，对细胞表面的免疫分子进行检测、分析和表征的方法。
这些技术可以定量地测量细胞免疫分子的表达水平，研究细胞亚群的多样性和功能差异。
常用的细胞免疫检测技术包括流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光显微镜等。
二、流式细胞术流式细胞术是细胞免疫检测和分析最常用的方法之一。
它基于对细胞表面或胞内某些特定抗原的免疫反应，将标记有荧光染料的抗体与细胞免疫分子结合，并通过流式细胞仪进行颜色和强度的定量检测。
流式细胞术可以同时分析多个参数，对细胞的表型特征进行高通量分析，帮助研究者了解免疫细胞的数量、分布和功能等。
三、免疫组织化学免疫组织化学是用特异性抗体标记来检测组织切片中的特定抗原分布。
它基于免疫染色的原理，通过对组织切片进行抗原修复、抗体反应和染色处理等步骤，将抗原定位于组织切片中的特定部位，并利用显微镜观察和分析免疫染色产物的分布和强度。
免疫组织化学在疾病诊断和组织形态学研究中起到重要的作用，可以帮助研究者确定细胞免疫分子的存在和表达水平。
四、免疫荧光显微镜免疫荧光显微镜是通过使用特异性荧光标记的抗体来检测和分析细胞免疫分子的表达和分布。
它可以帮助研究者观察和记录细胞表面或胞内的免疫分子分布和定位，通过荧光信号的强度和分布情况了解细胞免疫的状态和功能。
免疫荧光显微镜可以提供高分辨率和空间定位的免疫信息，对于细胞免疫功能的研究具有很高的研究价值。
五、细胞免疫检测技术的应用细胞免疫检测技术广泛应用于细胞免疫学、医学研究和临床诊断等领域。
例如，在肿瘤免疫学研究中，流式细胞术可以用来分析和鉴定免疫监视细胞亚群的变化以及肿瘤细胞的免疫逃逸机制。
免疫组化与免疫荧光的区别
免疫组化与免疫荧光一、两者都是蛋白定位的检测（也就是确定蛋白是表达在细胞核/浆/膜）。
二、区别是：1、概念和基本原理免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的现像和放大作用，在细胞，亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。
免疫组织化学技术现已有：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、亲和组织化学技术、免疫金银及铁标记免疫组织化学技术等。
免疫荧光组织（细胞）化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，由于受高压汞灯光源的紫外光照射，荧光素发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量。
以达到对抗原物质定位、定性、定量测定的目的。
2、标本制作：免疫荧光一般用冰冻切片，减少杂质干扰；而酶免疫组化一般用石蜡切片或冰冻切片均可以。
3、实验步骤：免疫荧光染色步骤简单，而酶免疫组化方法较为复杂，多了DAB显色过程。
4、染色后的标本保存：免疫荧光染色后的标本一般短时间拍照，时间长了荧光衰退；而酶免疫组化染色标本可以长期保存。
5、免疫组化结果除了知道蛋白是在细胞浆还是细胞膜表达高些，还可以用软件做相对定量分析。
6、免疫荧光得到的图片是彩色的，漂亮些，可以发高档次文章。
免疫学三大工具：免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。
免疫组化：是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。
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3.荧光猝灭快
荧光素本身特性决定，光稳定性差，建议 选用光稳定性好的荧光素二抗。
4.细胞有自发荧光
使用了戊二醛固定，建议在固定后荧光染 色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4， 甘氨酸等，染色前检查自发荧光。 材料本身（如石蜡）有自发荧光，建议设 立阴性对照，通过降低荧光显微镜的参数来 消除背景染色。 细胞成分中能够产生自发荧光的分子（例 如核黄素、细胞色素等）的含量高；培养细 胞中死细胞／活细胞比例高；
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 免疫组化染色（IHC）； 原位杂交（ISH）； 荧光原位杂交（FISH）； 原位末端标记分析（TUNEL）； 原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
2. AEC显色法
产品描述：3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9ethylcarbazole，AEC) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，AEC显色工作液会于反应部位产生 溶于酒精的红色沉淀，必须在水溶性介质中 复染和封片。本试剂盒适用于辣根过氧化物 酶（HRP）系统的免疫组化显色，包括AEC 显色原和与之配套的稀释液。 试剂盒组成： AEC显色原（试剂A） AEC底物缓冲液（试剂B）
一 抗
抗 原
细 胞
3，3-二氨联苯胺（DAB） 显色剂
组织切片/芯片制作
组织芯片/切片应用
1. 组织芯片
组织芯片（或组织微阵列）是将数十个甚 至上千个不同个体的组织标本集成在一张固 相载体上，组织芯片中含有蛋白，RNA及DAN 分子，是一种高通量的研究分析工具。研究 者一次可有效利用成百上千份正常或疾病状 态下的组织标本来研究特定基因及其所表达 的蛋白质与疾病之间的关系。
免疫荧光常见问题分析
1.背景过高
一抗质量不高，建议使用特异性高、效价 高的一抗。 一抗/二抗浓度太高，建议降低一抗/二抗 浓度。 封闭不完全，建议增加蛋白封闭时间。 洗涤不充分，建议增加冲洗次数与时间。 可通过调节荧光显微镜的参数来减低背景。
2.信号弱或无信号
无目的蛋白或表达量极少，建议选用表达 量高的细胞或组织。 细胞通透性差，建议增加通透剂的作用时 间或浓度。 一抗/二抗浓度太低，建议增大其浓度。 二抗选择错误（种属不匹配），建议选用 与一抗种属相匹配的二抗。
全套鼠类器官组织切片； 全套猴类器官组织切片； 人类常见癌症组织切片； 组织芯片客户定制服务。
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
3. BCIP/NBT显色法
产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、
western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色
4. BCIP/INT显色法
免疫荧光原理示意图
免疫荧光实验过程
细胞爬片（多聚赖氨酸处理，生长密度70-80%）
细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）
细胞膜穿透（ Triton X-100 等）
封闭（3%BSA-PBS等）
一抗孵育
荧光二抗孵育
胞浆/核衬染（鬼笔环肽/DAPI/PI）
封片荧光显微镜拍照
免疫荧光结果分析
免疫荧光双染色抗体的选择
荧光补偿示意图
Annexin V-FITC/PI凋亡检测原理
在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS） 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中 。 Annexin V是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白 ，能与磷脂酰丝氨酸PS高亲和力特异性结合。 将Annexin V进行荧光素（FITC、PE）或Biotin标记，以标记了 的Annexin V-FITC作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微 镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透 过完整的细胞膜，但在细胞凋亡中晚期的细胞和死细胞，碘化 丙啶PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin V 与 PI 匹配使用，就可以将细胞凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分 开来。
直接法： 一抗种属来源无要求 标记两种不同荧光素 的一抗。
间接法： 一抗种属来源来源不 同 二抗分别标记不同荧 光素。
各种荧光染料原理及选择
细胞核衬染染料： DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料它可以透过完整的细胞膜，因 此以用于活细胞和固定细胞的染色。最大吸收波长为358nm，最大发射波长 为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。 Hoechst 33342 是一种DNA结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子中,在紫 外激发光作用下发出兰色荧光.能够透过完整的细胞膜，可用于活细胞染色。 碘化丙啶(PI)是一种溴化乙啶的类似物，它在嵌入双链DNA后释放红色荧 光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。PIDNA复合物的激发和发射波长分别为535nm和 615nm。 细胞浆衬染染料： 鬼笔环肽（phalloidin ）由鬼笔鹅膏真菌（Amanita phalloides）产生的一种 环肽。可与F肌动蛋白结合，使F肌动蛋白保持稳定。其荧光标记物是鉴定F 肌动蛋白的重要试剂。 荧光抗体的选择： 绿色荧光素：FITC，Alex488，Dylight488等。 红色荧光素：PE，Alex546等。
试剂超过保质期，建议实验前确认试剂的 保质期。
操作过程冲洗过度，建议适度冲洗。
免疫荧光 （Immunofluorescence, IF）
免疫荧光原理及特点 免疫荧光就是利用抗原与抗体的特异性结合原理及特殊的 荧光素标记技术，通过激光激发使荧光素发出荧光，在荧光 显微镜下观察荧光的变化从而对细胞内的抗原进行分析的技 术。用免疫荧光显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质 等方法称为免疫荧光细胞（或组织）技术。 免疫荧光具有特异性强、敏感性高、速度快等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
产品描述：BCIP/INT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/p-碘硝基四唑）是一种冷藏稳定的、单一 组分溶液，用于免疫组化、原位杂交、
western blot、northern blot和southern blot，
物质。 试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四 唑
特异性地与碱性磷酸酶反应生成橙色/棕褐 色物质。 试剂盒组成： 有机溶剂中的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和p-碘硝 基四唑
免疫组织化学原理及特点
利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记 技术，通过化学反应使标记抗体显色，对组织细 胞内的特异性抗原进行定位、定性、定量检测的 一门技术。 免疫组化具有操作简单，特异性强，敏感性高， 定位准确，形态与功能相结合等特点。
辣根过氧化物酶（HRP）
二 抗
棕褐色络合物
IHC
反 应 原 理 示光猝 灭剂封片。
流式细胞术
（Flow Cytometry, FC）
流式细胞术定义及原理 流式细胞仪（FLOW CYTOMETOR）： 进行流式细胞分析的仪器，是集光电子物理，光电测量， 计算机，细胞荧光化学，抗体技术为一体的高科技细胞 分析仪。 流式细胞术（FLOW CYTOMETRY）:
LR 22.3
常用细胞表型及意义：
（Cluster of Differentiation, CD）
CD3 CD4 CD8 CD19
总T细胞 T辅助/诱导细胞亚群 T抑制/细胞毒细胞亚群 B细胞抗原
LL: CD3-CD4- B细胞群+细胞 毒T细胞亚群 LR：CD3+CD4- 细胞毒T细胞亚 群 UR：CD3+CD4+ T辅助细胞亚 群
利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行 多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和 分选（纯度可达99%以上）的技术。
荧光物质（FITC,PE等）
二 抗
不同颜色的 激发光
反 应 原 理 示 意 图
FC
一 抗
抗 原
细 胞
激光源
转化为计算机 识别数据
流式细胞仪工作原理图
流式细胞术实验过程
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
3.显色强度弱
一抗浓度过低或孵育时间过短，建议增加 一抗浓度或延长孵育时间。
4.无染色
组织中无目的抗原的表达。 一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前 确认一抗的种属来源。 显色物质与HRP系统不匹配，建议实验前 确认显色体系。
细胞悬浮液制备（浓度为1～5×106个/ml）
细胞固定（合适的固定液，如4%甲醛溶液等）
细胞膜穿透（ 冰冷的甲醇等）