组织学制片技术9PPT幻灯片

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组织制片技术2011

第二章
石蜡切片HE染色技术
石蜡切片法包括：取材和固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。
一、取材

取材关键材料新鲜保持原有形态：勿使组织块受挤压组织块力求小而薄选好组织块的切面取材部位准确规范保持材料的清洁取材时要有详细记录
简便的酒精稀释法：
无论任何浓度的酒精稀释时，需稀释到多大浓度就取多少毫升酒精，然后用蒸馏水加至该酒精原有浓度即可。例：将95%酒精稀释为70%浓度时，则将 95%酒精70毫升倒入量筒中，然后加入蒸馏水至总量95毫升即可。
5、透明
目的：大多数脱水剂不能和石蜡相混合，透明剂既可以与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁的作用。当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。在制片过程中，有两次透明。第一次是脱水后、透蜡前组织块的透明，目的是便于透蜡包埋。第二次透明是染色后切片的透明，目的是利于光线的透过便于显微镜的观察。
方法：将组织块经过二甲苯透明后，投入到已溶化的石蜡中。在透蜡时必须经过数次纯石蜡（石蜡1、 2、3），使石蜡中存有的剩余透明剂完全去尽，以免影响切片质量。时间：透蜡时间应根据不同组织类型及其大小而定，基本上与组织固定时间成正比。最好先入1/2石蜡（含1/2二甲苯），然后入石蜡I、II，总时间不超过1小时。
4、脱水
目的和原则组织经固定和洗涤后含有多量水分，因为水分不能和石蜡或火棉胶等支持剂混合，组织内有极少量的水分存在，就会妨碍支持剂的渗入，所以必须把组织中的水分彻底去除。就是用某些溶剂逐步将组织块吸收的水分臵换出来，以利于透明剂和石蜡等的渗入，这一过程就叫做脱水，使用的药品为脱水剂。脱水的作用：有利于组织的透明和透蜡。有利于组织的永久保存，水的存在能使组织分解。这是制片中相当重要的一个步骤，如果这一步骤没有掌握好，脱水不彻底，就会影响到组织的透明和透蜡。如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存。

组织学制片技术

合固定中液都用它 6重铬酸钾水溶液呈弱酸性;它为强氧化剂; 不能与酒精等还原剂混合;但与甲醛混合也不能保存过久一般在12—24小时失去作用; 重铬酸钾固定组织穿透速度快但必须流水冲洗
混合固定液上述某一种单纯固定液不能将组织内的各种成份保存下来;各种药物均有选择性;渗透能力也不同;收缩或膨胀也不相同;因此多配成混合固定液
十组织贴片贴片方法有三种 1直接贴片法 2伸展器贴片法 3温水漂浮贴片法十一烤片十二组织染色染色的步骤 1组织脱蜡二甲苯11015分钟 2组织脱蜡二甲苯235分钟 3组织进入100%酒精 23分钟
4组织进入95%酒精 23分钟
5组织进入70%酒精 23分钟
如固含有汞的固定液固定的组织必须进入
组织浸蜡的过程和时间组织浸蜡的全过程必须在60℃的恒温箱中进行;在恒温箱内放入24个蜡杯;分别放入软蜡和硬蜡使之熔化;将已透明的组织放入软蜡浸20分钟;然后移硬蜡浸40分钟;组织体积的大小与浸蜡的时间有关;请参看组织学与组织化学一书的34页表格七组织包埋组织浸蜡完毕后;要进行石蜡包埋; 石蜡包埋操作过程
1组织进入硬蜡后;开始作包埋准备 2将金属包埋框装好在保温台上 3将熔点为6062℃石蜡置电炉上熔化;温度控制在65℃左右; 4点燃酒精灯;准备好无齿镊;需作标记的写好标签; 5包埋开始;将熔化的包埋石蜡温度在65℃ 左右倒入金属包埋框内;倒满为即可; 6用无齿镊从60℃恒温内把浸好硬蜡的
组织取出迅速放入包埋框内;待冷却凝固石蜡包埋注意事项 1组织从硬蜡中取出放入包埋框内要快;不能在空间停留过久;否则组织表面上的蜡会被凝固 2组织包埋时;要确定组织切面和方向八组织修块将已凝固的蜡条从包埋框取出;修成蜡块;在修块时刀子不能挨着组织切下去;蜡块四周要留0 2cm的蜡边蜡块修好后放入冰箱中保存备用

组织学基本技术ppt(共69张PPT)

显微镜技术
根据光源不同，显微镜分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以
可见光为光源，后者则以电子束为光源。
—、光学显微镜
（一）普通光学显微镜（三）激光共聚焦扫描显微境
（五）相差显微镜
（七）微分干涉差显微镜
（二）荧光显微镜（四）暗视野显微镜
（六）偏光显微镜
（八）倒置显微镜
尼康E-600光学显微镜
消化分离：将组织分离成小块，然后利用相应的化学组涂织片制：片将技所术采➢是的随血着液生或命骨科髓学样的品发涂展抹而于不载断玻进片步上的经。瑞氏或姬姆萨染色后的标本。
抗体已失活、浓度过低；
磨片: 用于很药坚硬品的组水织，如溶骨和液牙。将其细胞间质消化溶去，再用机械分离的方
（二）固定
目的：使组织内的蛋白质迅速凝固或
沉淀，防止细胞自溶或组织腐败，尽量保持组织的原有结构和化学组成。
固定液的种类
单纯固定液 ➢ 4%中性甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制，配制后密封、 4℃保存，保存时间不超过一个月。适用 HE染色和免疫组化。 ➢ 4%多聚甲醛：用PH7.2-7.4的PBS配制。 ➢ 乙醇混合固定液
尼康E-600光学显微镜
普通光学显微镜由二部分构成： ①光学部分：包括聚光镜、物镜和目镜； ②机械部分：包括镜臂、载物台等。
尼康E800荧光显微镜
荧光显微镜由光源、滤片系统和显微镜三部分构成。光源为高压汞灯，用以产生波长短、能量高的紫外光。原理：紫外光激发标本中的荧光物质，使之产生各种不同颜色的荧光，通过观察荧光的分布与强弱来测定被检物质。研究内容：观察组织、细胞中有自发荧光或经荧光染料染色或标记的结构。

《组织切片制作》PPT课件

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（三）切片制作 1．将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待用。 2．将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块的组织切面暴露出来修平，固定在切片机上的标本台上并拧紧螺旋。 3．蜡块先固定在标本台上切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀的螺丝同时调整刀与蜡块的切片距离使刀与蜡块贴紧后再固定刀台螺丝，刀的角度为25度角。 4．调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为 5μm～7μm）。 5．修材。右手握旋转轮摇把按顺时针方向均匀地摇动直到组织块切面完整暴露为止。
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2．单纯固定液乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、冰醋酸
（1）乙醇（酒精）（alcohol）优点： ①价格低，易购买，易溶于水，使用方便，95％浓度，无水乙醇100％； ②市售有两种：100%；95%； ③能硬化组织起固定作用； ④也是一种最常用的脱水剂。
固定液配制：甲醛1份与9份自来水混合即为10％（4%）浓度的甲醛固定液。
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优点：①渗透力较强；②组织收缩小；③细胞核染色较好。缺点： ①质量较差的formalin在低温下久存容易产生一种白色的沉淀物称“三聚甲醛”（付醛），经氧化成为甲酸而使溶液呈酸性，影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳酸钙或碳酸镁，简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或者白色粉笔作为中和剂。 ②酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒状物，称为福尔马林色素，在切片上形成黑色小颗粒，不溶于水和酒精，影响染色效果和切片的观察。
2．染色需要的试剂及染色液的配制：
① 0.5％～1％盐酸—酒精：用于细胞核染色分色。
配制：100ml的70％～80％酒精中加人0.5ml或者1ml的浓盐酸。

组织切片技术..

（10％福尔马林）。甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH 为7.6，能长期保持中性。甲醛固定后，通常需在流水中冲洗24-48小时,否则影响染色效果。
(2) 4％多聚甲醛固定液
最好是动物经灌注固定取材后，继续固定2-24h。该固定剂较为温和，适用于组织标本的长期保存。
变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情
而定
注意事项：
1.使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。 2.更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。 3.在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材
料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后
除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否
适当和完全。
固定的目的和作用在于：
① 防止组织自溶和腐败；
② 使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而
保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构； ③ 因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色； ④ 固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。
动物的选择
动物的选择是组织切片取材的第一步,在组织学
中以人的组织为理想，但人的组织不易得到，根据研
究的需要，大都以动物的组织来代替。有些动物的组织器官比人的组织更为典型，如：猪的肝脏；豚鼠胰腺、内耳；猫的肋间肌显示运动终板；兔的皮下组织和肠系膜作活体染色较为理想等。
动物的处死

组织学与胚胎学切片图课件PPT

畸形胚胎切片图
先天性缺陷
介绍常见的先天性缺陷疾病，如唐氏综合征、先天性心脏病等，
并展示相关切片图。
遗传性疾病
展示遗传性疾病的病理切片图，如囊性纤维化、镰状细胞贫血等。
胚胎致死性畸形
介绍一些严重的畸形导致胚胎无法存活的情况，如无脑儿、严重
心脏畸形等。
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切片图在医学研究中的应用
病理学研究
病理学是研究疾病发生、发展和转归规律的学科，切片图是病理学研究中常用的工具之一。通过观察切片图，可以了解病变组织的形态学特征，为疾病的诊断和治疗提供依据。
肝脏组织结构切片图
展示肝脏的肝小叶、肝窦等结构，用于学习肝脏的形态和功能形态和功能。
肺组织结构切片图
展示肺泡、支气管等结构，用于学习肺的形态和功能。
细胞组织结构切片图
01
02
03
细胞膜结构切片图
展示细胞膜的磷脂双分子层、膜蛋白等结构，用于学习细胞膜的结构和功能。
切片图的重要性
切片图对于研究生物组织和器官的结构、功能以及发育过程具有重要意义。通过切片图，可以观察到细胞、组织、器官的细微结构，为理解生命活动的本质提供基础资料。
切片图的制作过程
取材
选取需要观察的生物组织或器官，进行固定。
切片制备
将固定后的组织或器官进行石蜡包埋、切片和
贴片。
染色
对切片进行染色，以便更好地观察其结构。
观察与成像
通过显微镜观察染色后的切片，并使用成像设
备记录图像。
切片图的观察与解读
观察要点
注意观察细胞、组织、器官的结构特点，包括细胞核、细胞质、细胞器的形态和分布。
解读技巧
结合理论知识，对切片图进行深入分析，理解其结构与功能的关系，以及发育过程中的变化。

病理制片和染色技术PPT课件

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2、AAF液配制 : 纯酒精85ml+醋酸 5ml+甲醛10ml
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5）尽可能避免使组织膨胀或收缩。 6）能使细胞内的成分（蛋白质）凝固或沉淀下来。 7）增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。增加媒染作用和染色能力。 8）使组织变硬，适于制片，但又不使材料太坚硬而松脆。 9）使组织充分固定，便于保存。
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第二节
介绍几种常见固定液
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第一章病理技术的应用范围
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➢帮助临床查明死因（原因不明的死亡） ➢手术后病变标本，以明确诊断（临床活检） ➢提供教学、科研的资料
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第一节组织制片的概述
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组织制片技术的应用，从1665 年由HOOk发现细胞开始，已有300 多年的历史。最早应用冰冻切片；随后又进一步利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石腊切片；后来又利用明胶、火棉胶、碳蜡和塑料等物质的韧性，以其包埋组织而制作切片。
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6、丙酮
丙酮又名醋酮或本酮，极易挥发、易燃的无色液体，能与水、醇、氯仿、醚及多种溶液混合。
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特性：
1）它可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，2毫米以下的组织固定半小时至1小时即可。 2）可引起组织较强的收缩使之变硬，对核固定不佳。 3）对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。 4）丙酮一般多与氯化汞、甲醛混合液使用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。

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(4)后固定：柔软组织在新鲜时不易切成小块，往往采用重新固定法处理。
（5）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。
3．固定剂
用以固定组织的药剂，称为固定液。
常用的固定液有：（1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%—40%甲醛水溶液）配成固定液其浓度为3.6%—4%，也就是习惯上称为10%的福尔马林液。（2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml， 0. 1mol/L pH7.4 PBS 90ml。
1
2
组3
织4
块5
处6
理7
时间表
8 9 10
11
12137Fra bibliotek%乙醇80%乙醇 90%乙醇 95%乙醇Ⅰ 95%乙醇Ⅱ 100%乙醇Ⅰ 100%乙醇Ⅱ 二甲苯Ⅰ 二甲苯Ⅱ 石蜡Ⅰ 石蜡Ⅱ 石蜡Ⅲ 石蜡Ⅳ
常温常温常温常温常温常温常温常温常温 48~50℃ 48~50℃ 58~60℃ 58~60℃
1．固定的目的
使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，防止组织自溶；使组织成份转变为不溶性物质从而有利于保存。这就是固定的基本意义。
2．固定的注意事项
(1)组织块不宜太大，一般以厚度为2毫米，长度不超过0.5厘米*0.5厘米。 (2)固定液的量一般以组织块大小的30倍为宜，最好在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布以使固定液能从上下左右前后各方都能渗入组织块。 (3)固定的时间，一般以24小时为宜。
8．活体标本：在组织细胞生活状态下进行观察的标本，或生活状态下进行活体染色后制成的标本。
9．血管注射标本：一种是将树脂类铸形剂经血管灌注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行及其与所支配组织或器官的相互关系。
石蜡包埋法：
商品石蜡的处理：反复溶化以增加石蜡的硬度
和密度。
浸蜡：温度不能超过该石蜡的溶点
的2℃以上；1~2h 。
包埋：通常使用包埋盒。
包埋通常使用组织包埋机、包埋盒及配套使用的不锈钢模具。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加满蜡，待包埋盒表面的熔蜡凝固后，将其移入加冰块的冷水中加速凝固，包埋即告完成。
12～24h 12～24h 2～3h 1～2h 1～2h 1h 1h 20~30min 20~30min 0.5h 0.5h 0.5h 0.5h
（六）组织切片技术
1、切片机简介：
石蜡切片机可分三个部分，一是安装切片刀的部分，有调节刀片斜度和固着刀片的螺旋。一是安装材料的部分，也有螺旋可以调节材料的位置。另一是操纵在旋转中向前推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。
5．固定后处理
材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏，必须用水或酒精洗去。
三种方式进行处理：
（1）流水冲洗（铬酸或铬酸盐固定的组织）；
（2）酒精充分洗涤（Bouin’s液含苦味酸）；
（3）直接入脱水剂。
（四）脱水与透明
1、目的：脱水与透明的目的在于为石蜡渗透至组织块内部以便进一步包埋做必要的准备。脱水必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水剂。另外脱水必须进行得很彻底。
5．分离标本：将极小组织块用化学药物的水溶液浸泡后，溶去其细胞间质，采用机械分离方法（如振荡、针拨等方式）使之分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上进行镜检。
6．压片标本：组织经化学药物软化及染色后，用盖片压封于载玻片上进行镜检的标本。如运动终板的制作。
7．整装标本：一种是将很小的动物或早期胚胎经固定、染色后，封固于载玻片上。另一种是将小动物、胚胎或病变器官经固定后，保存于固定液中瓶装供肉眼观察用。可了解胚体的表面立体形态特征及病变部位与周围组织的毗邻关系。
目的要求
1、了解组织学制片的基本程序； 2、熟悉HE染色的步骤； 3、掌握HE染色结果的观察。
一、组织学常用的几种标本类型
1．切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常用的标本。
2．铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载玻片上，经固定、染色、封固而制成的标本。
（3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH7.4）
（4）Bouin’s液：苦味酸饱和水溶液75份，甲醛25份，冰醋酸5份配制而成。
4．固定方法
（1）灌注法（Irrigation method）自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，注入固定液，30min后取材，置同一固定剂后固定。
（2）浸入法（Immersion method）。
1、动物致死法：（1）颈椎脱臼法（2）断头法（4）空气栓塞法：
2、组织取材时应注意： (1)所取材料越新鲜越好； (2) 切取组织的刀剪刃口必须锋利； (3)取材时必须考虑切面的方向； (4)组织块应力求小而薄； (5)收缩较大的新鲜组织； (6)注意清洁；
（3）麻醉法
（三）标本的固定
2、常用脱水剂：
（1）酒精：（2）丙酮：
3、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和
变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以
延长至24小时也无妨。
（五）包埋
1．目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份，必须加石蜡等作支持物质渗入组织块内部，并将组织块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。 2．种类：包埋物质目前广泛采用的除石蜡外，还有火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包埋剂）等。
二、组织切片的常规制作
（一）概述
组织切片的制作方法有：石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、超薄切片（电镜标本）、树脂切片、碳蜡切片等。石蜡切片法是最常用的方法，本节将较详细讲授其制作步骤。
组织切片制作方法的基本程序为：取材→固定→脱水→透明→包埋→切片 →染色→封固。
（二）动物的致死与取材