人工诱导斜带石斑鱼雌核发育的研究
条纹锯鮨(Centropristis striata)卵巢发育及性逆转调控技术研究
条纹锯鮨（Centropristis striata）卵巢发育及性逆转调控技术研究石斑鱼是一种典型的雌雄同体雌性先熟鱼类，其性别调控和性别转换机理相当复杂。
条纹锯鮨是石斑鱼中的一种，且在繁殖季节雌雄差异显著，雄鱼具有明亮而鲜艳的婚姻色。
通过对石斑鱼繁殖生物学、性别决定机制和性逆转诱导技术及方法的简要概括，对石斑鱼在繁殖生物学、人工诱导性逆转、性逆转相关技术及其基因决定等方面取得的进展进行了描述。
为石斑鱼的生产研究工作，提供一些符合实际需求的、能够调控雌雄石斑鱼适合比例、匹配雌雄种鱼，解决雌雄成熟发育不同步等方面的技术方法。
并针对条纹锯鮨性腺发生、卵巢发育及条纹锯鮨性逆转调控技术开展实验总结如下：1、原始生殖细胞的迁移采用组织学及形态学方法，对条纹锯鮨性腺发育早期原始生殖细胞的迁移进行观察，研究发现：条纹锯鮨原始生殖细胞（PGCs）的起源处与性腺的位置相隔一定的距离，经脏壁中胚层通过背肠系膜迁移到达生殖脊。
2、条纹锯鮨卵巢周年变化通过对条纹锯鮨卵巢的形态学、组织学在年周期中的变化规律进行研究，了解条纹锯鮨雌鱼在性成熟后的年周期中的变化规律。
研究发现：条纹锯鮨卵巢发育随水温变化明显，最适产卵温度为19-22℃：在3-4月份时，卵巢开始发育，体积增大，卵黄积累，卵巢由Ⅲ期发育到Ⅳ期；5-6月份时，条纹锯鮨进入繁殖期，卵巢极度膨大，轻压腹部可见卵子流出，卵巢由Ⅳ期进入Ⅴ期；7月份，条纹锯鮨产卵结束后，卵巢排卵后退化，此时卵巢为Ⅵ期；8-10月份，卵巢逐渐退化，进入Ⅲ期，直到翌年3月。
条纹锯鮨雌鱼的性腺成熟系数（GSI）、肝体指数（HSI）及丰满度（CF）具有一定的相关性，在产卵季节，可以通过测量条纹锯鮨的丰满度来推测条纹锯鮨的卵巢分期，以预测产卵时间。
条纹锯鮨的卵巢成熟指数值在每年的5月份出现1次峰值，产卵类型为一年一次产卵、短期分批非同步产卵类型。
3、17α-甲基睾酮及芳香化酶抑制剂对条纹锯鮨性逆转的影响在繁殖季节前，采用背部肌肉埋置药条（含17α-甲基睾酮或芳香化酶抑制剂）的方式，人工诱导条纹锯鮨雌鱼性别转换，每4周埋置1次，共埋置3次。
南海斜带石斑鱼野生群体与人工繁殖群体的微卫星分析
斜 带石 斑 鱼 （ ｐｎｐ ｅ ｓｃｉ ｄｓ 隶 属 鲈 形 目（ ｅｃ ｏｍ ｓ 、 科 （ ｅｒｎｄ ｅ 、 斑 鱼 属 （ ｐｎｐ ｅ Ｅ ｉ ｈｌ ｏ ｉｅ ） ｅ ｕ ｏ Ｐ ｒｉ ｒ ｅ ） 熊 ｆ Ｓｒ ｉａ ） 石 ａ Ｅ ｉ ｈ— ｅ
南海斜带石斑鱼野生群体与人工繁殖群体 的微卫星分析
骆 剑 ， 宗文 ， 黄 陈国华 ， 王 琚 ， 杨 薇 ， 郭仁 湘
（ 海南大学 海洋学 院 ； 热带生 物资源教育部重点实验 室 ； 海洋生 物国家级实验教学示范 中心 ， 海南 海 口 ５０ ２ ） ７ ２ ８ 摘 要 ：为 了评估我 国斜 带石斑鱼野生群体与人工 繁殖群体 的种质现状 ， 采用 ｌ 微卫星标 记对斜带 石斑 ９个
ｚ ） 为世界 性 的经 济 鱼类 ， ， 主要 分 布 于西太 平 洋 硫球 群 岛 、 大利 亚 与 贝 劳 和 菲济 群 岛 的 东部 … 。斜 带 澳
石斑鱼在我 国主要分布于南海海域和台湾海峡＿ 。斜带石斑鱼因 肉质鲜美而具有较高的商业 价值 。全 ２ Ｊ 球每年约有 ２ ５万 ｔ 野生斜带石斑鱼成鱼及数 目巨大的幼鱼被捕捞 ， 且斜带石斑鱼栖息地珊瑚礁和红树林 遭到大规模破坏 ， 导致斜带石斑鱼资源量锐减 。２ ０ Ｊ ０ ６年的《 世界 自然保护联盟濒危 物种红色名录》 Ｊ 已将其评估为近危物种 （ Ｔ Ｎ ａ Ｔ ｒ ｔ ｅ ） Ｎ ， ｅｒ ｈ ａ ｎｄ 。我 国是石斑鱼 的养殖大国 ， ｅｅ 福建 、 广东 、 海南等地 已形成 大规模的石斑鱼养殖产业 ， 但近年来幼苗死亡率高 、 疾病多发等 因素 困扰着养殖业 的发展 引， 究其原 因， 可能是因高密度养殖造成环境恶劣 以及因亲本种质不佳导致幼苗体弱的结果。种苗的质量直接影响 成 鱼 阶段 的养殖 ， 因此 ， 调查 我 国南 繁 育 种地 海 南 省 人 工 繁殖 的石 斑 鱼 群体 的 遗传 多样 性 并 对 其 种 质 状 况进行评估 ， 对人工繁殖石斑鱼种苗的遗传改 良及种质监测具有重要的理论及应用价值。在斜带石斑鱼 种质 资 源及 遗传 多 样性 研究 方 面 ，ｎｏｏ等 ¨ Ａ ｔｒ 对泰 国及 印尼 的石斑 鱼野 生群 体 开展 了种群 遗 传 差异 的研 究； 王家 祺 等 ¨ 对 台湾及 广东 地 区 的石斑 鱼人 工 繁殖 群体 开展 了微 卫 星研 究 ； 秋芬 等 也 对南 海 海 域 董 多 种石 斑鱼 野 生群 体 的系统 发 生进 行 了调查 。我 国海南 岛东 部 是南 海 斜 带石 斑 鱼 最 主要 的栖 息 地 之一 ， 也是亲鱼资源补充地 ； 同时海南岛也是斜带石斑鱼的主要人工繁殖及育苗产地。为合理评估和利用我国 南海斜带石斑鱼资源， 笔者采用微卫星分子标记技术对南海斜带石斑鱼野生群体与海南人工繁殖群体进 行遗传多样性的调查。此次调查 ， 一方面可以评估南海斜带石斑 鱼 自然资源 的状况 ， 为建立南海斜带石 斑 鱼遗 传 多样性 数 据库 提供 基 础资 料 ； 一 方 面通 过评 价 斜 带 石 斑 鱼人 工 繁 殖 群 体 的种 质 状 况 ， 南 海 另 为 斜带石斑鱼亲本 的选择育种工作提供理论依据。
石斑鱼的性别分化和性腺发育机制研究
石斑鱼的性别分化和性腺发育机制研究石斑鱼是一种重要的经济性鱼类，在亚洲地区有广泛的养殖和消费市场。
然而，对于石斑鱼的性别分化和性腺发育机制仍存在较多的研究空白。
下面我将就这一主题展开探讨。
一、石斑鱼的性别分化在石斑鱼的性别分化中，存在着许多复杂的调控因素，如遗传因素、环境因素等。
其中，环境因素在形成石斑鱼性别决定中起着至关重要的作用。
比如说，养殖环境的水温、光照、饲料、密度等都会对石斑鱼的性别产生影响。
1.1 温度对石斑鱼性别的影响温度是影响石斑鱼性别决定的主要环境因素之一。
对于大多数石斑鱼而言，较高的水温通常会诱导雄性的发生，而较低的水温会使成鱼分化为雌性。
例如，常见的黑斑石斑鱼，温度在28-36℃之间是典型的雄性环境，而在22-28℃之间则是雌性环境。
这是由于在高温下，睾丸细胞可以继续分裂，而在低温下，卵巢细胞比较容易分裂。
因此，可以通过控制水温来实现养殖石斑鱼时的性别选择。
1.2 光照对石斑鱼性别的影响石斑鱼对于光照的敏感性也是其性别分化和性腺发育机制的重要因素之一。
日照时间和夜晚的亮度这两种因素都会对石斑鱼的性别分化产生影响。
在黑斑石斑鱼中，夜间亮度的增加会促进卵巢的成熟和卵子产生，而在白斑石斑鱼中则是促进睾丸的发育和精子的生产。
1.3 其他环境因素对石斑鱼性别的影响除温度和光照之外，水质、饲料等因素也会对石斑鱼的性别分化产生影响。
在石斑鱼的养殖中，通过控制这些因素，可以调整石斑鱼的性别分布，实现优质种苗的生产。
二、石斑鱼的性腺发育机制在石斑鱼的性腺发育机制研究中，主要研究的是石斑鱼的性腺组织结构、激素调节机制和生殖周期等。
2.1 石斑鱼的性腺组织结构石斑鱼的卵巢和睾丸都是由成排的生殖小叶组成的。
其中，卵巢小叶含有大量的卵母细胞，而睾丸小叶则含有大量成熟的精子。
在石斑鱼的性腺组织结构中，还存在着基质细胞和间质细胞等非特定性细胞。
2.2 石斑鱼的激素调节机制通过控制激素水平，可以调节石斑鱼性腺的生长和发育。
人工诱导雌核发育技术在水产养殖中应用的研究进展
没有 。 这样当不发生第二次成熟分裂或第二极体不排 出时 ，雌 核发 育 的后代 就会 表现 出一 定 的杂合 性…。 Ｊ 通过计算杂合体后代在群体中的比例， 就可以推算交
换频 率 。 据交换 频率确 定基 因在染 色体上 和位置及 根 基 因间 的距 离 ，因而 能绘制 出染 色体 图。
技 术与 应 用
生命 科 学仪 器 ２０ ０ ９第 ７卷 门０月刊
人工诱导雌核发育技术在水产 养殖 中应用的研究进展
钟 源 杨 辉
（ 国海 洋 大 学 ，水 产 学 院 ， 山东 青 岛 ２ ６ ０ 中 ６ ０ ３）
摘要 本文综述 了人 工诱 导的雌核发育技术 在水 产养殖 中应用 的进 展 ，并分析 了其存在 的问题 ，对雌核发育技术与 现代生物技术相结合 的应用前景做出了展 望。 关键 词 雌核发育 ；水产养殖 ；进 展
性成熟 ，易导致 繁殖过 剩 。利用 单性群 体养殖 可 以避
压诱导雌核发育的二倍体虹鳟， 平均孵化率为４． ３ ％， ９ 比热休 克ｆ１５ 高得 多 。 ２ ．％） 纵观国内鱼类人工雌核发育的研究现状 ， 使卵子 染色体二倍化的方法最常用的仍是温度休克法。 甚至 可认为： 温度对抑制第二极体外排或是抑制第一次卵 裂 ， 比静水 压和秋 水仙 素两种 方法操 作简便 、 果 有 效
紫 外 灯 比用 １ 支灯 管 的照射 时 间缩 短 近一 半 。
尾椎弯曲等特点 。 若在诱导单倍体之后 ， 进行特殊的 处 理 ，使之 二倍 化 ，成 为雌核 生殖二 倍体 。这 种个 体 不仅在鱼类 中可 以存活 ， 还能正常生殖 。 遗传工作者
对此展 开研 究 ， 工诱 导雌核 生 殖 的二 倍体 ，没有 精 人 子 的遗传 物质 ， 二倍 体 完全 以雌 核 为基础 ， 基 因点 各
刺激隐核虫幼虫诱导的斜带石斑鱼体液免疫应答
摘要刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。
本文就刺激隐核虫的幼虫阶段所引起的体液免疫应答过程进行研究，以期能找到具有最高免疫原性和免疫保护性的免疫原，为以后疫苗的研制与开发奠定基础。
刺激隐核虫的生活周期的四个阶段（见图示），我们采用的是Colorni和Burgess(1997)的术语：滋养体(trophont)、胞囊前体(protomont)、胞囊(tomont)和幼虫(theront)。
腹腔注射刺激隐核虫幼虫能使斜带石斑鱼的血清和皮肤培养液产生阻动隐核虫幼虫的特异性抗体，并能使免疫鱼获得很好的免疫保护，刺激隐核虫生活史的三个发育阶段中，只有幼虫期具有较好的免疫原性，而其它两个阶段免疫原性较差。
可以将幼虫期作为首选来研制灭活疫苗，为防御和治疗刺激隐核虫病奠定了基础。
所以，从我们的研究结果来看，刺激隐核虫病的预防和防治应该从幼虫期为出发，进行灭活疫苗疫苗或者基因工程疫苗的研究。
在本实验中，相同的免疫方法所引发的血清抗体和皮肤抗体的变化规律存在很大的差别，两类抗体的最初生成时间、达到峰值的时间以及阻动效价等都不一致，这说明鱼类的系统免疫应答和皮肤粘膜免疫应答是相互独立的。
关键词：刺激隐核虫幼虫免疫活疫苗鱼类目录1 前言 (1)1.1 关于刺激隐核虫的研究 (1)1.2 关于斜带石斑鱼的研究 (2)1.3 刺激隐核虫各生活阶段的研究 (2)1.4 本实验的目的与意义 (3)2 材料和方法 (3)2.1 实验鱼的来源、检测及驯养 (3)2.2 刺激隐核虫幼虫的来源 (4)2.3 实验分组 (5)2.4 免疫方法 (5)2.5 抗血清的制备方法 (5)2.6 皮肤培养液的制备方法 (5)2.7 血清抗体和皮肤培养液阻动效价的测定 (6)2.8 幼虫对实验鱼致死剂量的测定 (6)2.9 攻毒 (6)2.10 数据统计方法 (6)3 结果 (6)3.1 抗体对幼虫的阻动过程 (6)3.2 抗血清阻动效价的变化规律 (9)3.2 皮肤培养液阻动效价的变化规律 (10)3.3 抗血清和皮肤培养液阻动效价的变化差异 (11)3.4 致死剂量幼虫攻毒后各实验组鱼的死亡率 (12)4 讨论 (12)1 前言1.1 关于刺激隐核虫的研究刺激隐核虫是一种纤毛类寄生虫，对水产养殖和观赏鱼类造成了极大危害，在短时间内就会引发严重感染和高死亡率，对经济生产造成了很大的损失。
斜带石斑鱼GtHRs在卵巢发育过程中的表达模式
斜带石斑鱼GtHRs在卵巢发育过程中的表达模式胡雪松;刘晓春;张勇;李水生;陈华谱;林浩然【摘要】对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)卵巢进行组织学分析,根据卵母细胞的发育阶段将卵巢发育划分为7个时期(I-VII),检测斜带石斑鱼不同发育时期卵巢中两种促性腺激素受体(gonadotropin receptors, GtHRs),即卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)和促黄体素受体(luteinizing hormone receptor, LHR)的mRNA水平,同步分析下游卵巢型芳香化酶基因(Cyp19a)的表达模式。
实时荧光定量PCR (Real-time PCR)结果显示, FSHR的mRNA水平在I、 II时期的卵巢中较低,在III时期开始上调,在IV、V时期显著升高,在VI时期显著下降。
相比之下, LHR的转录水平在卵巢发育早期(I-IV)表达较低,在V时期开始有所升高,在VI时期达到峰值。
卵巢内Cyp19a的mRNA在I−III时期保持较低水平,在IV、V时期的表达显著增强,在VI时期表达明显减弱。
在卵巢发育过程中, Cyp19a的整体表达模式与FSHR较为相似。
上述结果表明,斜带石斑鱼FSHR和LHR均参与了卵巢发育的调控,但在不同发育时期功能不同。
在卵巢发育过程中, FSHR 可能是介导 Cyp19a 正调控的主要因子。
本研究旨为阐明斜带石斑鱼GtH/GtHR信号系统在生殖调控过程中的作用提供基础依据。
%10.3724/SP.J.1118.2012.00915【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】8页(P915-922)【关键词】斜带石斑鱼;促性腺激素受体;卵巢型芳香化酶基因;卵巢发育【作者】胡雪松;刘晓春;张勇;李水生;陈华谱;林浩然【作者单位】中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州 510275; 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州 510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州 510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州 510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室，广东广州 510275【正文语种】中文【中图分类】Q959脊椎动物垂体前叶分泌的促性腺激素(gonadotropins, GtHs)包含卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和促黄体素(luteinizing hormone receptor, LH)。
斜带石斑鱼人工育苗技术
提 高 。 为 优 质 蛋 白 来 源 的 海 产 鱼 苗种 生长 至 关 重 要 。 受精 卵孵 化 至 投 饵 之 前 ．根 据 大 小 把 鱼 苗 分 为 作 类 ， 日常 食 物 中 的 比 例逐 渐 增 加 ， 仔 鱼 前 期 ， 于 仔 鱼 细 小 ， 易 碰 ４ ８档 。 不 同 大 小 规 格 的 苗 种 分 在 由 容 — 将 消 费 需 求 量 越 来 越 大 ， 此 推 动 高 伤 ， 水 质 变 化极 为 敏 感 ． 建 议 换 放 在 不 同 的 鱼 池 里面 ， 时 应 考 虑 由 对 不 同 档 水 产 品养 殖业 的快 速 发 展 。斜 带 水 ， 以 静水 微 气 培 育 。 应 可以 适 当 添 鱼 苗 密 度 ． 量 多 的 档 次 可 分 放 在 数
上 的 斜 带 石 斑 鱼 主 要 来 自 人 工 养 加 ５ ｌ 一 ０厘 米 的海 水 ．至 １ ￣ ５日 ２ １ 池 里 。这 样 既 可 以节 约 育 苗 成 本 ， 殖． 因此 苗 种 需 求 量 大 ， 目前 大多 龄 时 ，鱼 苗 平 均 全 长 ３ ４毫 米 ， 而 ＂ 个 又 便 于 管理 。
一
．
龄 以上 ， 苗 平均 全 长 达 １ 米 以 其 他 档 次 的 苗 。 成 相 互 残 食 。 三 鱼 ７毫 造
上 ， 部 分 进 入幼 鱼 期 ， 水 量 应 达 是 同 一 苗 池 中 鱼 苗 个 体 差 异 不 是 大 换 不 以 卵 质 的 好坏 是取 得 良好 育 苗 成 到 １０ ０ ％。平 时 应 保 持 一定 的流 水 。 很 明 显 时 ， 应 立 即 分 苗 ， 避 免
鱼类人工诱导三倍体和雌核发育二倍体研究进展
19 8 7
9 9 ) 安 徽滁 州卿 ( 张 克俭 1 5 ) 等 都是 自然 三 倍 体 种群
因 此 吴 清 江 ( 19 7 9 ) 提 出通 过 人 工
诱 导 杂 种 三 倍 体鲤 鱼 并希望 这 种 三 倍 体 杂 种 鲤 鱼 能 以 雌 核 发 育 的 方 式 繁 衍 不 出 现 分离 的 后 代 而 使 杂种优 势得 以 代代 保持 的设 想 中均 有 发 现
第
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卷第 期 8 年 月
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人工诱导石斑鱼雌核发育的初步研究摘要：采用灭火的鞍带石斑鱼精子精子遗传物质进行完全灭活，灭活后的精子与斜带石斑鱼卵子相结合，获得单倍体受精卵，经冷休克加倍处理，得到雌核发育二倍体，实验结果显示：鞍带石斑鱼精子在紫外照射强度为160-240lux下，照射4min后能使精子完全灭活，处理水温4-6℃条件下，受精卵最佳处理时刻为受精后第6min，最佳冷休克持续时间为30min。
关键词：石斑鱼，雌核发育，人工诱导，紫外照射，冷休克鱼类雌核发育工作开始于20世纪50年代，淡水鱼类开展的较多[1]，海水鱼类这方面的研究相对比较落后，目前仅在大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[2]、牙鲆(Paralichthys oliva-ceus)[3]、真鲷(Pagrosomusmajor)[4]、漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)[5]欧鲈(Dicentrarchus labrax)[6]大黄鱼(Pseudosciaena crocea )[7]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[8]等有关的报道。
雌核发育研究作用主要体现在三个方面，一是在一些生长差异大的养殖鱼类中构建全雌鱼或者与性转化技术相结合构建功能性雌雄鱼，然后和正常鱼交配进而得到全雌或全雄鱼，二是人工诱导雌核发育可以快速建立纯系，对提高鱼的种质质量具有重要意义，三是雌核发育后代具有高度的纯合性，能够快速淘汰劣质基因，稳定杂种优势，提高选择效率，对鱼类育种和种质资源保护具有重要意义。
石斑鱼是驰名世界的名贵海产鱼类,是中国南方沿海广东、海南、福建、广西等海水养殖的主要对象，经济价值巨大，中国石斑鱼类养殖和其他海水养殖鱼类是继海藻、贝类和虾类之后第四个海水养殖发展浪潮而兴起的[9]。
斜带石斑鱼石斑鱼在分类学上隶属鲈形目（Perciformes）、鲈亚目（Percoidei）、鳍科（Serranidae）、石斑鱼亚科（Epinephelinae）、石斑鱼属（Epinephalus），有关斜带石斑鱼或者石斑鱼雌核发育的报道国内外均未见报到，本研究采用紫外灭活精子，低温冷休克的方法系统深入的研究了斜带石斑鱼雌核发育的条件，以期为石斑鱼的研究提供基础资料，同时对石斑鱼养殖产业的发展以及种质资源保护提供科学依据。
1.材料方法1.1.实验材料实验场地：海南青利水产繁殖有限公司三亚铁路港及新村渔排。
实验仪器及器材：紫外灯箱，流式细胞仪（CyFlow® PA），Nikon显微镜，烧杯，培养皿，胶头吸管，1.5ml EP管。
实验鲜活材料：鞍带石斑鱼鲜活精子，斜带石斑鱼刚收集卵子。
实验药品：Ts-19精子稀释液，酒精，丁香酚麻醉剂，染液（PARTEC Stain DNA 1 step staining solution），PBS（PH=7.2）1.2实验方法1.2.1.精子遗传物质灭活分别设置精子照射时间为0,2,4,6,8,10min，紫外照射强度为160-240lux，精子稀释液采用被实验室精子冷冻中筛选的同等条件下精子活力较好的Ts-19，精子和稀释液比例为1:9,取1ml稀释过的精子放在预冷的培养皿中，精子厚度约为0.16-2mm，紫外照射过程中保持不停的摇动以确保精子照射均匀，紫外灯箱开启约5min等待电压稳定后开始精子精子灭活，以上实验条件下分别统计受精率，受精后20h的成活率和单倍体率，以确定精子的最佳照射时间,照射过的精子放在冰面上遮光保存备用。
1.2.2.染色体倍性恢复在繁殖期间从斜带石斑鱼亲鱼养殖网箱中挑选性成熟较好的雌鱼，人工挤卵，快速将收集到的卵和紫外灭活的精子以及正常精子相结合，冷休克处理时刻分别设置为：C1,C2,3,4,5,6,10,15,20,25,30,35min，其中C1为正常精子和卵子杂交，C2为灭活的精子和卵子杂交但不休克，其余组为休克组，分别统计受精率，孵化率和诱导率，冷休克水温保持在4-6℃,冷休克处理持续时间分别设置为C1,C2，10,15,25,30,35min，C1和C2条件同上，以上各组每组分别设计3个重复，并统计受精率、孵化率，每次冷休克完成后加入海水复温至28℃。
1.2.3.单倍体的检测收集受精后约12h的受精卵，开始倍性检测，方法如下：取发育约12h的受精卵，在载玻片上轻压致使卵膜破裂，用PH=7.2的PBS冲洗玻片，经离心沉淀后取上层组织液100ml与1L染液混合均匀后进行检测，每次随机检测样品50个，并统计单倍体率。
1.2.4.人工受精将鞍带石斑鱼亲鱼用丁香酚麻醉后，人工收集新鲜精液，遮光保存送到实验地点灭活，28℃水温、盐度34‰的海水里面进行人工受精，具体方法为：将收集的卵子和灭活的精子在1000ml的烧杯混合后，用羽毛搅拌均匀，先加入少量海水（约200ml）初步混合，再加入大量海水（约700ml）混合均匀，混合后1min 收集受精卵换水，低温休克人工受精后采用静水和充气两种孵化办法，每组设2个平行。
2.数据处理受精率=（被激活卵子数/卵子总数）×100%孵化率=（出苗数/受精卵数）×100%受精20h的成活率=（受精后20h的胚胎数/受精卵的总数）×100%单倍体率=（单倍体受精卵数/总受精卵数）×100%诱导率=(二倍体数/检测总数)×100%数据差异性及One-Way ANOVA分析采用spss 18.0进行分析，图像处理采用Excel 2011和Adobe Photoshop 7.0处理3.结果与分析3.1精子紫外灭活受精后的3h开始统计受精率，每次统计卵的总数200-500个，每个实验组设1个平行，统计2次，结果取平均值，结果如表一，4min组和2min组相比，受精率,受精后20h的成活率均较高，单倍体率也在4min达到了100%，显微镜检检结果显示4min组运动精子比例和2min组略微偏低，但快速运动精子数量差别不大，因此确定4min为最佳精子照射时间，后继实验均采用此方法处理精子。
图1，不同紫外照射时间对精子的影响 C1为正常精子和卵子人工授精Fig1 Effects of different time with UV irradiation on sperm. C1 hybrid control.3.2 最佳冷休克处理时刻的确定分别在受精后的3、4、5、6、10、15、20、25、30、35min时刻处理受精卵，处理水温为4-6℃，冷休克持续时间35min孵化后的3h开始统计各实验组的受精率，受精后的16h测定诱导率时，发现15min以后的实验组受精卵数量很少，6min组孵化率（29.7%）和诱导率（100%）均较高，因此确定受精后的6min为最佳处理时间。
图2.冷休克不同处理时刻的比较，C1杂交组，C2为单倍体组Fig2.Effects of different activating time of cold shock.C1 hybrid control C2 haploid control3.3.冷休克持续时间的确定在3.1、3.2的基础上，分别设定冷休克处理时间：C1,C2，10,15,25,30,35min，精子和其它处理条件同3.2.冷休克完成后立即复温至28℃，结果如表3图3.雌核发育不同冷休克处理时间的比较，受精卵受精后6min放在4-6℃开始冷休克,C1杂交组，C2为单倍体组Fig3.Effect of different duration times of cold shock on gynogenesis in Epinephelus coioides.All eggs were exposed to 4-6℃water 6min post-fertilization.C1 hybrid control C2 haploid control.3.4.倍性鉴定正常发育二倍体、雌核发育二倍体、单倍体授精14h后的相对含量为30，正常二倍体DNA含量设定为30，倍性检测结果见图4图4，斜带石斑鱼雌核发育单倍体（a），正常发育二倍体对照（b），雌核发育二倍体（c），受精卵中DNA相对含量流式细胞仪检测图Fig4.DNA values of Epinephelu scoioideshaploid(a),normal diploid control(b) and gynogenetic diploid(c), cell of oosperm measured by flow-cytometry.3.5，单倍体，正常二倍体，雌核发育二倍体的比较a b c图 5.a,雌核发育二倍体，b，正常发育二倍体，c.同时期的单倍体Fig5. a. gynogenetic diploid,b. normal diploid control. c. gynogenetic diploid4.讨论雌核发育中，首要要对精子进行完全遗传灭活，目前人工诱导雌核发育技术中，精子灭活最常用的方法是对雄性原核进行辐射处理，也有少数用化学方法处理，这些方法虽然各有优缺但以辐射处理中的紫外照射处理较为常见，大部分精子经紫外照射后，其受精率、孵化率都会呈现明显的Hertwig，此种现象在牙鲆[3]，大菱鲆[2]，欧鲈[6]，大黄鱼[7]等鱼类中均有报道。
本研究中紫外照射过的精子和正常卵子结合后也出现了明显的Hertwig，即孵化率先上升到一个最大值再降低，造成这一现象的主要原因是低剂量的紫外线照射能使精子遗传物质灭活不彻底,受精后具有显性致死突变基因的二倍体胚胎和非整倍体胚胎数量随照射时间延长而增加，出现孵化率随照射剂量增加而下降的趋势；较高剂量时，精子遗传物质被完全灭活，受精后全部为单倍体胚胎，而单倍体比照射诱发出来的具显性致死突变基因的二倍体胚胎和非整倍体胚胎存活时间长，其孵化率因而开始上升；随着照射剂量的再增加，精子启动卵子发育的能力开始下降，从而其孵化率再次下降[10]。
有关真鲷［4］、欧鲈［6］等海水鱼类中的报道显示，雌核发育诱导中染色体倍性恢复效果受处理起始时刻、处理持续时间和处理强度的影响，其中处理时刻对诱导结果影响最大，本研究中处理时刻为受精后的6min，这和鸥鲈[6]受精后5-6min,大菱鲆受精后的6.5min的报到很近接，但和漠斑牙鲆[5]受精后的3-4min，大黄鱼[7]受精后的1-3min略有差异，不同鱼类适合处理时刻差别可能与实验中亲鱼培育水温、受精卵培育水温、所用卵子的成熟度以及实验时的室温不同有关［11］。
本实验中石斑鱼冷休克处理的条件为：T,4-6℃,TA，6min， D,30min，这与牙鲆（T,0-1℃,TA，3-5min， D,45-60min）[3],大菱鲆（T,-1-0℃,TA，6.5min，D,25min）[2],漠斑牙鲆（T,0-2℃,TA，3-4min， D,45-50min）[5]，大黄鱼（T,3-4℃,TA，2min，D,10min）[7]，真鲷（T,2-3℃,TA，3-5min，D,5min）[4],半滑舌鳎（T,2-5℃,TA，2-5min， D,20min）[8]等海水鱼类相比，在处理时刻和处理时间上与大菱鲆，较为接近，而处理水温相对偏高，主要因为斜带石斑鱼属暖温性鱼类，大菱鲆属于冷温性鱼类，休克水温相对较低，本实验结果与半滑舌鳎在处理时刻，处理时间，处理水温上都比较接近，这可能因为两者均为暖温性鱼类，卵子对温度的适应性相差不大。