原生质体无菌分离培养与融合

原生质体的酶解与分离（无菌条件） 原生质体的酶解与分离（无菌条件）
用清水洗涤叶片， 叶片表面消毒 用清水洗涤叶片，吸去叶 表面水分，然后将叶片移入无菌室， 表面水分，然后将叶片移入无菌室，在 70%乙醇液内浸数秒钟，取出后立即放人 乙醇液内浸数秒钟， 乙醇液内浸数秒钟 3%次氯酸钠溶液 分钟，最后用无菌 次氯酸钠溶液10分钟 次氯酸钠溶液 分钟， 水冲洗3-4次 水冲洗 次。 酶解： 将表面灭菌的叶片撕去下表皮，放 酶解： 将表面灭菌的叶片撕去下表皮， 入盛有5毫升酶液的培养皿中 毫升酶液的培养皿中， 入盛有 毫升酶液的培养皿中，让去除下表 皮的一面接触酶液，铺满一层，在室温下 皮的一面接触酶液，铺满一层， 酶解3-4小时 小时。 酶解 小时。
用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2 个细胞靠近 用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2-3个细胞靠近或 靠近或 融合的过程 的过程。（ 观察时注意不同程度的融合现象。 融合的过程。（ 观察时注意不同程度的融合现象。通常 分为五个阶段。 两细胞膜接触，粘连； 分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿 两细胞的细胞质连通； 通道扩大， 孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一 体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形 细胞完全合并， 细胞。） 细胞。）
实验试剂
70％的酒精 70％ 3％的次氯酸钠(体积比） 的次氯酸钠(体积比） 酶液：1.0％的纤维素酶和0.8％的果胶酶，用13％ 酶液：1.0％的纤维素酶和0.8％的果胶酶， 13％ CPW配制 的CPW配制 20％蔗糖溶液 20％ CPW洗液以及含 ％甘露醇的CPW CPW洗液以及含13％甘露醇的CPW 洗液以及含13 MS母液的配置（见细胞生物学实验98页），有机 MS母液的配置 见细胞生物学实验98页），有机 母液的配置（ 质母液装棕色试剂瓶，其余装普通试剂瓶， 质母液装棕色试剂瓶，其余装普通试剂瓶，储存 冰箱备用。 冰箱备用。 生长素：2.4－D(1mg/ml)，称取20mg,先用 ％ 先用95 生长素：2.4－D(1mg/ml)，称取20mg,先用95％的 酒精溶解，然后定容至20ml 酒精溶解，然后定容至20ml 细胞分裂素： BA（0.5mg/ml），称取10mg,先 ），称取 细胞分裂素：6－BA（0.5mg/ml），称取10mg,先 1M盐酸溶解 然后定容至20ml 盐酸溶解， 用1M盐酸溶解，然后定容至20ml 培养基的配制：MS＋ 2.4－D(1mg/L)+ 6－BA 培养基的配制：MS＋ 2.4－ 6－ 0.5mg/L）+20%（体积重量比）的蔗糖， （0.5mg/L）+20%（体积重量比）的蔗糖，按照 所需体积，依照母液浓缩倍数，定容培养基。 所需体积，依照母液浓缩倍数，定容培养基。
植物原生质体的分离， 植物原生质体的分离，培养与融合
了解植物原生质体分离、 了解植物原生质体分离、融合和培养的基 本原理及其过程。 本原理及其过程。 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所 包围的“裸露细胞” 包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的 理想材料。 理想材料。其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术， 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要 由纤维素、半纤维素和果胶质组成， 由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而 使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降 使用纤维素酶、 解细胞壁成分，除去细胞壁。 解细胞壁成分，除去细胞壁。
需要灭菌的东西
1. 抽滤灭菌：酶液 抽滤灭菌： 2.高压灭菌：培养基(带盖培养瓶装)，无菌 2.高压灭菌 培养基(带盖培养瓶装) 高压灭菌： 用酒精瓶装，盖上刺小孔）， ％ ），20 水（用酒精瓶装，盖上刺小孔），20％的蔗 13％ 糖，13％的CPW 3 器具灭菌： 器具灭菌： 材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（ 材料灭菌：解剖刀，长短镊子，烧杯（4 ），玻棒 滤纸若干张，培养皿（ 玻棒， 个），玻棒，滤纸若干张，培养皿（1个） 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（ ），滤 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤 0.25um滤膜 滤膜（ 头，0.25um滤膜（*4） 原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 原生质体纯化：200目滤网和过滤用漏斗 （*1）；带盖离心管（×3）；培养皿 ）；带盖离心管（ ）；培养皿 带盖离心管 ）；1ML枪头 枪头1 胶头滴管（ （*3）；1ML枪头1盒；胶头滴管（4个） 胶头部分70％的酒精浸泡） （胶头部分70％的酒精浸泡）
用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。 350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣 目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。 1000rpm条件下离心 分钟，弃上清液，加入3 条件下离心5 在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液，加入3～4ml13%CPW 洗液， 弃上清液。 1ml13%CPW洗液悬浮 洗液悬浮。 洗液，相同条件下离心 ，弃上清液。加1ml13%CPW洗液悬浮。 ** 蔗糖漂浮方法： 蔗糖漂浮方法： 用细口吸管吸20%蔗糖溶液 蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部 加入另外一支离心管底部， （1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液4ml加入另外一支离心管底部， 然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同， 然后将原生质体的悬液小心加在蔗糖界面上。由于比重不同， 蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面( 蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界 面). (2) 1000转/分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚 1000转 分离心5分钟，此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内， 集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫， 集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界 面处， 面处， (3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离 (3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体， 用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体 心管中，加入3 4ml13%CPW洗液离心收集沉淀 洗液离心收集沉淀， 心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心收集沉淀，用13%CPW 的CPW重新悬浮。 CPW重新悬浮。 重新悬浮
许多化学、 许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主 质体融合， 质体融合，现在被广泛采 用并证明行之有 效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法，高Ca高 效的融合方法是聚乙二醇 法 高 pH法和电融合法。 法和电融合法。 法和电融合法 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而 诱导融合的机理： 诱导融合的机理 由于含有醚键而 具负极性，与水、 具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一 些正极化基团能形成氢键， 些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够 分子足够 长时， 长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥 而使之粘连。 而使之粘连。
实验器具
材料灭菌：超净工作台，酒精灯，解剖刀， 材料灭菌：超净工作台，酒精灯，解剖刀，长 短镊子，烧杯（ ），玻棒 滤纸若干张， 玻棒， 短镊子，烧杯（4个），玻棒，滤纸若干张， 培养皿（1个） 培养皿（ 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（ ），滤头 滤头， 酶液抽滤灭菌：过滤用注射器（1个），滤头， 0.25um滤膜 0.25um滤膜（*4套） 滤膜（ 培养基和高压灭菌：高压灭菌锅， 培养基和高压灭菌：高压灭菌锅，带盖培养瓶 （*4） 培养：离心机； 200目滤网和过滤用漏斗 培养：离心机； 200目滤网和过滤用漏斗 ）；带盖离心管 带盖离心管（ ）；封口膜 封口膜； （*1）；带盖离心管（×3）；封口膜；移液 培养皿（ ）；1ML枪头 枪头1 枪； 培养皿（*3）；1ML枪头1盒；胶头滴管 ）（胶头部分 ％的酒精浸泡； 胶头部分70 （4个）（胶头部分70％的酒精浸泡；倒置显 微镜； 微镜；培养箱
原生质体培养
将无菌收集的原生质体加入培养皿中，添加 5ML培养基，封口膜封口，25度黑暗培养， 5ML培养基，封口膜封口，25度黑暗培养， 1天后观察是否污染和2－3天后观察是否分 天后观察是否污染和2 裂。
细胞融合ห้องสมุดไป่ตู้有菌条件）
加原生质体0.3ML与带盖离心管中， 加原生质体0.3ML与带盖离心管中，另加入 与带盖离心管中 0.15ML40% PEG液，30℃水浴中温浴15min； PEG液 30℃水浴中温浴15min； 融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度， 融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能 太干) 轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。 太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。