吸光光度法同时测定食品中的苯甲酸和山梨酸
苯甲酸山梨酸的测定方法
实验十七、酱油中山梨酸、苯甲酸的测定1、目的与要求掌握酱油、水果汁、果酱中山梨酸、苯甲酸的测定原理及方法。
2、原理样品中的苯甲酸在酸性条件下蒸馏，馏出液剧烈氧化除去杂质，再次蒸馏后，所得苯甲酸在220nm处有最大吸收，它的吸光度与浓度的关系符合比尔定律，因此可以据此定量测定。
同时山梨酸在酸性条件下也能随水蒸汽一起蒸馏出来，可在酸性溶液中，用蒸汽蒸馏的方法将样品中的山梨酸蒸馏出来，并除去非挥发性的干扰物质。
山梨酸在弱氧化条件下氧化成丙二醛，再与硫代巴比妥酸反应，生成红色的化合物。
其颜色的深浅与山梨酸含量成正比，可以比色测定之。
3、仪器与试剂3.1 仪器3.1.1 蒸馏设备。
3.1.2 紫外可见分光光度计。
3.2 试剂3.2.1 无水硫酸钠。
3.2.2 85%正磷酸。
3.2.3 0.034mol/L重铬酸钾溶液：溶解4.9g重铬酸钾于水中，稀释到500mL。
3.2.4 2mol/L硫酸溶液：稀释66.5mL浓硫酸至500mL。
3.2.5 氢氧化钠溶液：1mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L。
3.2.6 0.5%重铬酸钾溶液。
3.2.7 0.5%硫代巴比妥酸溶液：称取硫代巴比妥酸0.5g，加入20mL水，再加1mol/L 氢氧化钠溶液10mL，用玻璃棒搅拌使之溶解，然后加入1mol/L盐酸11mL，用水稀释至100mL，摇匀。
3.2.8 0.15mol/L硫酸：取浓硫酸1mL加入到100mL水中，并用用水稀释至120mL。
3.2.9 山梨酸标准溶液：精密称取在105℃干燥至恒量的山梨酸0.0500g用0.1mol/L 氢氧化钠溶液溶解后，移入500mL容量瓶中，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液至刻度，摇匀，每毫升含山梨酸100μg。
临用时取1mL置于50mL容量瓶中，加入0.01mol/L氢氧化钠溶液到刻度，摇匀，每毫升含山梨酸2μg。
3.2.10 苯甲酸标准溶液：准确称量经过干燥的苯钾酸0.1000g，溶于0.1mol/L氢氧化钠溶液中，以水定容至1000mL，每毫升溶液相当于苯甲酸0.1mg。
橘子汁中苯甲酸和山梨酸的测定(精)
问题的再一次提出——如何解决两种
酸在测定过程中的相互影响？ 有人认为，用一空白实验就、能获得较好的结 果，这个空白实验是用无防腐剂的样品得到的。 这样的空白通常是不可能得到的。因为用商业性 样品很难知道它的所有成分，而这些成分的存在 和浓度是由生产技术和贮藏条件决定的。还有一 些人使用中性样品蒸馏得到的一个空白（样品中 研究的防腐剂不是挥发性的）。然而，这样的空 白有缺陷，因为它并不反映出从酸性样品中蒸馏 出的这些干扰成分。
实验
仪器
蒸馏装置，见图2。 分光光度计：可见光和紫外光范围。
试剂(略) 方法
1.预备实验的操作 2.主要蒸馏的制备 3.空白蒸馏液的制备（空白1） 4.苯甲酸的测定 5.山梨酸的测定
标准曲线的制备 准确吸取标准苯甲酸工作液1，2，3，4，5毫升分别移入10 毫升容量瓶中，每一瓶中含有1毫升0.1N氢氧化钠溶液。每 一瓶溶液用蒸馏水稀释至刻度。并且摇匀。每一瓶溶液以 0.01N氢氧化钠溶液为空白在225毫微米处测出光吸收值。以 苯甲酸浓度（以ppm表示）对吸收值（在225毫微米）绘制曲 线。 蒸馏液的测定： 吸取每一种蒸馏液（主要和空白的）25毫升分别移入250毫 升蒸馏瓶中，各加入25毫升0.2N重铬酸钾溶液和6.5毫升4N 硫酸。在沸水浴中准确加热10分钟，然后冷却，按照“主要 蒸馏液制备”所述的“加入磷酸1毫升……”开始进行。以 0.01N氢氧化钠溶液为空白，在225毫微米处测定两种溶液的 吸收值。从主要溶液的吸收值减去空白的吸收值，然后从标 准曲线中相对的吸收值查出苯甲酸的浓度。按下列方式计算 出橘子汁中苯甲酸的含量。 苯甲酸钠(ppm)=100M/W 式中M代表部分蒸馏液中苯甲酸 的浓度(ppm)，即从标准曲线中查出相对值；W代表吸收蒸馏 液中含样品的克数（克）当使用单独蒸馏时，空白1（经中和的橘子汁的蒸 馏液）在紫外区并不出现橘子汁中某些挥发性物质光的吸收值。 这些挥发性物质存在于经酸化的橘子汁蒸馏液中。空白2（同样来 源的经酸化但不含防腐剂的橘子汁蒸馏液）总是记录较高的吸收 值。事实上，苯甲酸和山梨酸的测定应该使用后面的空白，但是， 这是不可能的，因为在商业样品中，同样来源，不含防腐剂和经 同样加工，同样贮藏的橘子汁在测定防腐剂时是找不到的根据 Monselise方法的分析操作是采用空白1。所以得到的结果太高 （由于空白的吸收值 ，见上述）。 本文的方法通过在两个阶段中得到的结论，克服了这些困难（见 图1）。（i）酸化的橘子汁的一部分蒸馏液中采用强氧化作用可以 除干扰物质，这可以连接用重蒸馏苯甲酸。在氧化作用中，山梨 酸也被破坏这是有利的。因为测定重蒸馏液中，苯甲酸可不受其 他防腐剂的干扰。（ii）其他部分酸化橘汁蒸馏液中，山梨酸首先 转化为甲酰化合物，然后变为有色的衍生物，后者的吸收值可、 是可在可见光范围内读出的，这一波长中，橘子汁中的挥发性物 质或苯甲酸都不能干扰。
HPLC／MS测定食品中的苯甲酸、山梨酸、甜蜜素、糖精钠
山梨 酸 、 甲酸 、 精钠 和甜 蜜素是各 类食 品中 苯 糖 使用 最多 的食 品添加 剂 ， 是 食 品质 量 监督 工 作 中 也
必检 的项 目。 目前 的测 定方 法用衍 生化气 相色谱 法
稳 定 ， 致测 定效率 低 ， 导 结果 受到影 响 。针对这 些情 况 ， 文 研 究 了 ＨＰ Ｃ ＭＳ同时 测 定 食 品 中 山 梨 本 Ｌ ／ 酸 、 甲酸 、 苯 糖精钠 和甜蜜 素的方法 ， 方法定 性 、 该 定 量 准确 ， 灵敏 度高 ， 可用 于各类食 品 中 ４种添 加剂 的
９ ． ％ （ ｏ ｉｍ ｙ ｌｍａ ｅ ． ６ ９ ｓ ｄ ｕ ｃ ｃａ ｔ ）
Ｋｅ ｏ ｄ ：ＨＰ ｙｗ ｒ ｓ ＬＣ／ Ｓ； ｏ ｄ；ｓ ｒ ｉ ａ ｉ ；ｂ ｎ ｏｃａ ｉ ｏ ｉｍ ｙ ｌｍａ ｅ ｓ ｃ ｈ ｒｎｓ ｄｕ Ｍ ｆｏ ｏ ｂ ｃ ｃｄ ｅ ｚ ｉ ｃｄ；ｓ ｄ ｕ ｃ ｃａ ｔ ； ａ ｃ ａ ｉ ｏ ｉｍ
ｓ ｃ ｈ ｒｎ ｓｄｕ ｉ ｏ ｄ ｂ Ｌ ／ Ｓ ａ ｃ ａ ｉ ｏ ｉｍ ｆｏ ｙＨＰ Ｃ Ｍ ｎ
Ｈｕ Ｍ ｅ ，Ｗ ａ ｇ Ｊ ｎ，Ｚ ｕＪａ ｈ ａ ｉ ｎ ｕ ｈ ｉｎ ｕ
Ｓ ａ ｄ ｎ ｕ ｅ ｖ ｓｏ ｎ ｎ ｐ ｃ ｉ ｎ Ｉ ｓ ｉ ｔ ｏ ｏ ｕ ｔ Ｑｕ ｌ ｙ （ ｉ ａ ５ １ ０ ） ｈ ｎ ｏ ｇ Ｓ ｐ ｒ ｉｉｎ ａ ｄ Ｉ ｓ ｅ ｔ ｎ ｔ ｕ ｅ ｆ ｒＰｒ ｄ ｃ ａｉ ｏ ｔ ｔ Ｊｎ ｎ ２ ０ ０
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ａ ｔ ｏ ｆｄｅ ｅ ｍｉ ａ ｉ ｏｒｂ ｎ ｏ ｃａ ｉ ｍｅ ｈ ｄ ｏ ｔ ｒ ｎ ｔｏｎ ｆ ｅ ｚ ｉ ｃ ｄ、ｓ ｂ ｃ ａ ｉ ｏｒ ｉ ｃ ｄ、ｓ ｉ ｍ ｙ ｌ ｍａ ｅ ａ ｄ ｓ ｃ ｏｄ ｕ ｃ ｃａ ｔ ｎ ａ —
HPLC_MS测定食品中的苯甲酸_山梨酸_甜蜜素_糖精钠
62
S /N 均大于 10, 考虑到此含量可满足所有食品中 4 种添加剂的检测要求, 因此本文将此含量作为 4 种 添加剂的检出限。
表 3 4种添加剂标准曲线方程和相关系数
添加剂名称
除由配料合理带入食品的情况外, 4种添加剂 在食品中使用量通常在 0 01 ~ 1 00 g / kg 范围内, 本方法线性范围最高可达 0 25 g /kg, 对于含量更高 的样品, 必须对样品溶液进行稀释。这是由本方法 采用的电喷雾接口的特性决定的: 当样品溶液中浓 度过高时, 在离子源内会产生离子抑制, 高浓度时不 成线性。 2. 2 测定时间对甜蜜素的影响
测定时间 1h 4h 1d 2d 3d 4d 5d
响应值 346 005 348 278 346 524 344 997 343 782 335 007 330 241
2. 3 线性范围和检出限 配制 4种添加剂浓度在 10~ 5 000 ng /mL范围
内的系列标准溶液, 按本文所述方法测定。将各组 分的峰面积对相应的浓度绘制工作曲线, 曲线方程 和相关系数见表 3。
H u M e,i W ang Jun, Zhu Jianhua
Shandong Superv ision and Inspection Institu te for P roduct Qua lity ( Jinan 250100 )
Abstract: A m ethod o f determ ination for benzoic acid、sorb ic acid、sod ium cyc lam ate and saccharin sod ium in foods by H PLC /M S is estab lished. T he food additivesw ere ex tracted from the sam ple by w ater, after separated w ith a H PLC colum n, detected under ESI negative ion m odes. The ca libration curves of th is four food additives are linear in the range of 10~ 5 000 ng /mL, and the detection lim its are all be tter than 0 1 mg /kg, the average recoveris are 92 1% ~ 96 7% ( benzo ic ac id) , 92 3% ~ 94 4% ( sorbic acid) , 94 0% ~ 97 3% ( saccharin sodium ) and 95 1% ~ 96 9% ( sod ium cyc lam a te).
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法 -回复
食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法-回复[食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定液相色谱法]引言：食品中的添加剂是保证食品质量及延长其保质期的重要组成部分。
然而，由于食品添加剂的广泛应用，安全性和卫生问题引起了广泛的关注。
苯甲酸、山梨酸和糖精钠是常见的食品添加剂，在超标使用或不当使用的情况下，可能对人体健康产生不良影响。
因此，为了确保食品质量和消费者的健康，有必要开发一种有效的方法来准确测定食品中的苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量。
本文将介绍一种基于液相色谱法的测定方法，并详细阐述其步骤和原理。
一、实验所需设备和试剂1. 液相色谱仪2. 色谱柱：C18色谱柱3. 色谱条件：流动相为乙腈-水混合溶液，比例为90：10，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm4. 标准品：苯甲酸、山梨酸和糖精钠的纯品5. 待测食品样品二、实验步骤1. 准备标准曲线a. 分别称取适量的苯甲酸、山梨酸和糖精钠标准品，溶解于适量的甲醇中，得到不同浓度的标准溶液。
b. 以液相色谱仪的条件进行测定，绘制出标准曲线。
2. 准备待测食品样品a. 将待测食品样品加入适量的甲醇中，进行超声处理，使样品中的目标物溶解于甲醇中。
b. 过滤处理，去除杂质。
3. 液相色谱测定a. 取适量的样品溶液，注入液相色谱柱中进行分析。
b. 根据标准曲线，计算出样品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量。
三、实验原理液相色谱法是一种基于溶液中目标物的分配与移动速度的差异来分离和测定化合物的方法。
在该实验中，通过使用C18色谱柱，利用溶液中苯甲酸、山梨酸和糖精钠分子之间的相互作用力差异进行分离，以此来测定样品中这些成分的含量。
在液相色谱的过程中，流动相起到了重要的作用。
在本实验中，流动相为乙腈-水的混合溶液，并通过调整乙腈和水的比例来使混合溶液的极性适宜于目标物的分离。
流速的选择需要在快速分离和充分分离之间进行权衡。
波长的选择主要考虑目标物在特定波长下的吸收峰。
食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸同时测定的HPLC方法
苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸是目前国家允许使用的食品添加剂[1]，它们的分子结构如图1—4所示。
但此类物质摄入过多会造成潜在的健康风险[2]，所以同时准确高效地检测变得愈发重要。
现有的国家标准中，同时测定多种添加剂的方法较少，这给实际检验工作（需要满足高效准确的要求）带来了一定难度。
所以，需要开发改进同时检验上述4种添加剂的方法[3-6]。
图1 苯甲酸分子结构（CAS：65-85-0）图2 山梨酸分子结构（CAS：110-44-1）图3 糖精钠分子结构（CAS：128-44-9）图4 脱氢乙酸分子结构（CAS：520-45-6）目前，同时测定上述4种添加剂的国家标准尚未发布，部分地标采用磷酸盐缓冲液-甲醇体系的方法，虽然通过增加离子强度实现了分析目的，但对色谱柱寿命存在一定影响且对色谱柱要求较高[7]。
为此本文通过对苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸的化学特征和性质的分析，通过选择合适的色谱条件及样品前处理方法，提出改进方法，尽可能地达到稳定准确分析的目的。
1 实验部分1.1 仪器与试剂高效液相色谱仪：安捷伦1260型，配有二极管阵列检测器。
万分之一天平： EL204-IC，瑞士梅特勒。
千分之一天平：ML503/02，瑞士梅特勒。
离心机：10 000 r/min，TGL-16a高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司。
酸度计：梅特勒320型，瑞士梅特勒。
甲醇：色谱纯，德国默克进口。
苯甲酸标准品、山梨酸标准品、糖精钠标准品、脱氢乙酸标准品：美国sigma公司。
其他试剂均为优级纯。
实验用水为满足GB/T 6682-2008的一级水。
1.2 标准溶液的配置苯甲酸储备液（1.0 mg/mL）：精密称取苯甲酸标准品100 mg至100mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。
4 ℃保存，3个月有效。
山梨酸储备液（1.0 mg/mL）：精密称取山梨酸标准品100 mg至100mL容量瓶，用50%甲醇溶解并定容。
4 ℃保存，3个月有效。
食品中苯甲酸和山梨酸的分析
食品中苯甲酸和山梨酸的分析苯甲酸和山梨酸是食品中常见的有机酸,它们可以提供食品的酸味和调味。
但这两种酸也有一定的毒性,因此在食品中的含量是有限制的。
为了对食品中苯甲酸和山梨酸进行分析,通常使用一些常见的分析方法,例如色谱分析、光度分析和红外光谱分析等。
具体来说,色谱分析是一种常用的分离和测定有机物的方法,可以将混合物中的各组分分离出来,并对各组分进行测定。
苯甲酸和山梨酸可以通过色谱分析进行测定,例如可以使用液相色谱法（HPLC）或气相色谱法（GC）等。
光度分析是另一种常用的分析方法,可以通过检测物质吸收光谱来测定有机物的浓度。
苯甲酸和山梨酸都可以通过光度分析进行测定,可以使用吸光度测定法或比色法等。
红外光谱分析是另一种常用的分析方法,可以通过检测物质吸收红外光谱来测定有机物的结构和浓度。
苯甲酸和山梨酸也可以通过红外光谱分析进行测定。
这些分析方法都具有一定的优点和局限性,在实际应用中,需要根据实际情况选择合适的分析方法进行分析。
通常,在对食品中苯甲酸和山梨酸进行分析时,需要结合多种分析方法的优势,以便提高分析的准确性和灵敏度。
此外,在进行食品中苯甲酸和山梨酸的分析时,还需要注意样品的前处理和样品的储存方式,以便保证分析的准确性。
苯甲酸和山梨酸在食品中的含量是有限制的,因为这两种酸都有一定的毒性。
例如,苯甲酸可能会对人体的呼吸系统和神经系统造成危害,而山梨酸可能会对人体的消化系统造成危害。
因此,在食品中苯甲酸和山梨酸的含量一般都有严格的限制。
通过进行食品中苯甲酸和山梨酸的分析,可以了解食品中这两种酸的含量,从而保证食品的质量和安全。
因此,食品中苯甲酸和山梨酸的分析是食品质量控制和食品安全管理中的重要环节。
食品中苯甲酸山梨酸和糖精钠的测定-标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定1 范围本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量的测定方法。
本标准第一法适用于食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定；第二法适用于酱油、水果汁、果酱中苯甲酸、山梨酸的测定。
第一法液相色谱法2原理样品经处理后，用液相色谱分离，紫外检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂3.1.1氨水（NH3•H2O）。
3.1.2氢氧化钠（NaOH）。
3.1.3硫酸（H2SO4）。
3.1.4亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6•3H2O）。
3.1.5乙酸锌（Zn(CH3COO)2•2H2O）。
3.1.6氯化钠（NaCl）。
3.1.7酒石酸（C4H6O6）。
3.1.8硅酮树脂。
3.1.9磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）。
3.1.10磷酸二氢钾（KH2PO4）。
3.1.11中性氧化铝。
3.1.12甲醇（CH3OH）：色谱纯。
3.1.13乙酸铵（CH3COONH4）。
3.2 试剂配制3.2.1 氨水（1+1）：氨水与水等体积混合，经微孔滤膜过滤后备用。
3.2.2 氢氧化钠溶液（4 g/L）：称取4 g氢氧化钠，溶于水并稀释至1000 mL。
3.2.3硫酸溶液（0.5 mol/L）：移取30 mL浓硫酸（约70%）边搅拌边慢慢加入至500 mL水中，冷却至室温后，转移至1000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。
3.2.4亚铁氰化钾溶液（92 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾加水至1000 mL。
3.2.5 乙酸锌溶液（183 g/L）：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1000 mL。
3.2.6 酒石酸溶液（15%）：称取15 g酒石酸，用水定容100 mL。
3.2.7的磷酸盐缓冲液（pH 7.2）：分别称取16.72 g磷酸二氢钠和2.72 g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1000 mL，经微孔滤膜过滤后备用。
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吸光光度法同时测定食品中的苯甲酸和山梨酸作者：白海鑫刘小花陈华梅来源：《江苏农业科学》2019年第19期摘要：基于吸光度的加和性原理，在选定波长254、224 nm下，通过对苯甲酸/山梨酸的吸光度与浓度间的标准曲线进行线性回归分析所得的斜率，建立了苯甲酸和山梨酸吸光度D 与浓度C的关系方程组，最终获得起1种无需分离即可同时测定食品中的苯甲酸和山梨酸含量的方法。
结果表明：苯甲酸的回收率为91.83%～102.10%，RSD（相对标准偏差）为0.885%，最小检出限为0.13 mg/L，山梨酸的回收率为91.81%～92.67%，RSD为3.01%，最小检出限为0.096 mg/L，除了具有成本低、操作简单、快速、高效、重现性好等优点外，该方法最大的优点是可不经分离而直接测定混合样品中的苯甲酸与山梨酸的浓度。
关键词：吸光光度法;同时测定;苯甲酸;山梨酸中图分类号： TS255.7 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2019）19-0224-03收稿日期：2018-07-21基金项目：国家自然科学基金（编号：31501213）;河南省高等学校青年骨干教师资助计划（编号：2014GGJS-083）。
作者简介：白海鑫（1973—），男，河南中牟人，博士，副教授，主要从事吸收光谱及荧光光谱的分析方法研究。
E-mail：haixin_bai@。
通信作者：刘小花，博士，副教授，主要从事光谱分析与材料化学方面的研究。
E-mail：xiaohualiu78@。
科学技术的迅速发展使食品工业快速崛起，食品添加剂得以广泛应用。
部分商家为追求食品的色、香、味俱全，延长保质期，往往会在食品中添加大量食品添加剂。
《食品添加剂使用卫生标准》对食品添加剂用量和使用范围都有严格的规定和要求[1]。
但仍有厂家为了降低生产成本和延长保质期等，在食品中加入过量食品添加剂，而食品添加剂摄入过量会危及人体健康。
苯甲酸和山梨酸是较常用的食品添加剂，它们在食品中含量的测定方法的研究显得尤其重要。
测定苯甲酸和山梨酸含量的方法有气相色谱法[2-3]、高效液相色譜法[4-6]、薄层色谱法[7]、滴定法[8]、吸光光度法[9-10]。
虽然气相色谱法和高效液相色谱法被较多地用于食品中苯甲酸与山梨酸的测定，但其仪器昂贵，分析成本高和操作繁杂等，不利于其应用与普及。
鉴于吸光光度法操作简单、快速、成本低等优点[11-13]，本研究通过对不同选定波长下的吸光度与浓度间的标准曲线进行线性回归分析，并基于吸光光度法中吸光度具有加和性原理建立了对样品中的苯甲酸和山梨酸不经分离而直接同时测定的方法。
1 材料与方法1.1 试剂与仪器分析纯级的苯甲酸和山梨酸购自上海阿拉丁试剂有限公司;其余试剂均为分析纯。
试验用水为去离子水，试验用山楂片购自当地超市。
吸收光谱及光度分析试验所用分光光度仪系配有1 cm光程的石英比色皿的TU-1901型双光束紫外可见光谱仪（北京普析通用仪器有限责任公司）。
1.2 苯甲酸及山梨酸溶液的配制准确称取一定质量的苯甲酸，用5% Na2HPO4或0.01 mol/L NaOH溶液溶解，定容为1 mg/mL苯甲酸溶液储备液，用时稀释到所需浓度;山梨酸溶液的配制方法与此相同。
1.3 食品样品的预处理准确称取一定质量研碎的山楂片于适量蒸馏水中，超声提取20 min，离心，过滤，将滤液转入容量瓶并用蒸馏水定容。
取部分滤液于分液漏斗中，加入一定量HCl及饱和NaCl溶液，用乙醚萃取4次，弃无机相，合并有机相于另一分液漏斗中，再用5% Na2HPO4溶液进行反萃取多次，弃有机相，合并无机相于小烧杯中[14]。
在70 ℃磁力搅拌下去除乙醚，将去除乙醚的溶液转入容量瓶中，用5% Na2HPO4溶液定容。
以试剂空白为参比溶液，在200～300 nm 范围内进行光谱扫描，测定样品的吸光度。
2 结果与分析2.1 溶剂的选择苯甲酸和山梨酸微溶于水，易溶于有机溶剂。
常用 0.01 mol/L; NaOH溶液溶解苯甲酸和山梨酸[10，15]。
本试验发现，在室温下用0.01 mol/L NaOH溶液溶解苯甲酸和山梨酸至少要搅拌15 min，放置时间长，且有白色浑浊沉淀生成;当用5% Na2HPO4溶解苯甲酸和山梨酸时，溶解时间较短，不需搅拌，立即溶解。
从苯甲酸和山梨酸在0.01 mol/L NaOH和5% Na2HPO4溶液中的吸收光谱可看出，苯甲酸和山梨酸在5% Na2HPO4和0.01 mol/L NaOH溶液中的吸收光谱基本相同，苯甲酸和山梨酸的最大吸收峰无明显变化（图1、图2），该试验结果表明，苯甲酸和山梨酸的吸收光谱不受这些溶剂的影响。
在提取食品样品中的苯甲酸和山梨酸时，一般是先酸化样品，再用乙醚萃取有机物质，最后用5% Na2HPO4溶液反萃取并定容[14]。
综合考虑苯甲酸的溶解性及后续试验等因素，本试验选用5% Na2HPO4溶液作为溶解苯甲酸和山梨酸的溶剂。
2.2 测定波长的选择准确移取一定量的储备液，以5% Na2HPO4溶液为溶剂分别测定10 mg/L苯甲酸和4mg/L山梨酸溶液在200～300 nm 范围内的吸收光谱。
由图3可知，苯甲酸、山梨酸的最大吸收波长分别为224、254 nm。
苯甲酸和山梨酸在200～300 nm波长范围具有较强的吸收，光谱重叠。
由于两者的吸收光谱双向重叠，互相干扰，因此不能直接利用吸光度D与浓度C的关系对苯甲酸和山梨酸进行单组分测量，在该范围内测得的吸光度均为苯甲酸与山梨酸吸光度之和。
如苯甲酸、山梨酸在224、254 nm处的吸光度可表示为下式：D224，x+y=k224，xCx+k224，yCy;D254，x+y=k254，xCx+k254，yCy。
式中：x、y分别指苯甲酸与山梨酸。
上式中浓度项的4个系数k可通过苯甲酸与山梨酸单独存在时相应波长下的吸光度D与浓度C的标准曲线的斜率求得，将4个k值代入上方程组即可求出苯甲酸与山梨酸的浓度。
苯甲酸与山梨酸在224、254 nm处均有一定的灵敏度，故本试验选择在224、254 nm 处进行苯甲酸与山梨酸单独存在时吸光度D与浓度C的标准曲线测定及二者共存时的吸光度的测定。
2.3 标准曲线试验准确移取苯甲酸或山梨酸储备液，加入5% Na2HPO4溶液，分别配成一系列准确浓度的标准溶液，测定其吸收光谱，取224、254 nm处的D224 nm、D254 nm对浓度C作图得标准曲线（图4至图7），并对标准曲线进行线性拟合以求得其线性回归方程及斜率。
由图4及图5可知，苯甲酸在254 nm处吸光度D254 nm对浓度C的线性回归方程为D254 nm=0.006 35C苯甲酸-0.002 29，相关系数r=0.989 3，线性范围为0.00～30.00 mg/L。
山梨酸在254 nm处的线性回归方程为D254 nm=0.250 87C山梨酸-0.007 69，相关系数r=0.998 6，线性范围为0.00～8.00 mg/L。
由于吸光度具有加和性，所以二者共存的样品溶液在254 nm 处的吸光度如下：D254 nm=0.250 87C山梨酸+0.006 35C苯甲酸-0.009 98。
（1）同理，由图6及图7可知，苯甲酸在224 nm处的线性回归方程为D224 nm=0.070 38C苯甲酸-0.009 64，相关系数r=0.998 6，线性范围为0.00～30.00 mg/L。
山梨酸在224 nm处的线性回归方程为D224 nm=0.080 38C山梨酸+0.014 36，相关系数r=0.991 0，线性范围为0.00～8.00 mg/L。
因此，苯甲酸与山梨酸混合样品溶液在224 nm处的吸光度如下：D224 nm=0.080 38C山梨酸+0.070 38C苯甲酸+0.004 72。
（2）由上述标准曲线相关系数可知，在其线性范围内，苯甲酸和山梨酸在224、254 nm处的吸光度D与浓度C之间有着良好的线性关系。
对于苯甲酸与山梨酸混合样品，可通过测定混合样品在224和254 nm处的吸光度D，联立得方程组：D254 nm=0.250 87C山梨酸+0.006 35C苯甲酸-0.009 98;（3）D224 nm=0.080 38C山梨酸+0.070 38C苯甲酸+0.004 72。
（4）求解该方程组，即可不经分离求得苯甲酸和山梨酸的混合样品中各自浓度。
鉴于试验测定时一般选择200～300 nm波长下的吸光度D=0.434为试驗测值，此时光度法误差最小。
然而，该方程组中常数项（0.009 98及0.004 72）数值相对于0.434的相对误差小于光度法的最小误差（约为2.7%）。
因此方程组中的常数项在准确度要求不太高的计算中可忽略，故以上方程组可简化为下式：D254 nm=0.250 87C山梨酸+0.006 35C苯甲酸;（5）D224 nm=0.080 38C山梨酸+0.070 38C苯甲酸。
（6）3 讨论3.1 样品测定准确移取5.00 mL山楂样品溶液，按预处理方法处理样品溶液，在相同条件下，平行测定6次样品溶液，计算苯甲酸和山梨酸含量以及它们的相对标准偏差RSD（%）。
由表1可知，苯甲酸的RSD为0.885%，在线性范围有较好的精密度，山梨酸的RSD为3.01%，在线性范围内，精密度低于苯甲酸。
3.2 加标回收率试验分别用苯甲酸和山梨酸的标准溶液配制不同浓度的混合液，每种浓度进行6次平行测定试验，将测得的吸光度代入回归方程，测定值与理论值之比即为回收率。
苯甲酸的回收率为91.83%～102.10%，山梨酸的回收率为91.81%～92.67%，回收率符合试验要求，分析方法具有良好的准确度。
4 结论本研究基于吸光光度法中吸光度具有加和性，通过对不同选定波长下的吸光度与浓度间的标准曲线进行线性回归分析所得的斜率，建立了苯甲酸和山梨酸在波长254、224 nm下的吸光度D与浓度C的关系方程组：D254 nm=0.250 87C山梨酸+0.006 35C苯甲酸;D224 nm=0.080 38C山梨酸+0.070 38C苯甲酸。
通过测定苯甲酸与山梨酸混合样品在上述2个波长处的吸光度D，并代入该方程组即可直接求出样品中苯甲酸与山梨酸的浓度。
结果表明，苯甲酸的线性范围为0.00～30.00 mg/L，最小检出限为0.13 mg/L，山梨酸的线性范围为0.00～8.00 mg/L，最小检出限为0.096 mg/L，该方法得到苯甲酸的回收率为91.83%～102.1%，RSD为0.885%，山梨酸的回收率为91.81%～92.67%，RSD为3.01%。
该方法除操作简单、快速、高效外，最大的优点就是无需分离苯甲酸与山梨酸就可测定二者共存样品中各自的浓度。