第六章细胞破碎与料液分离设备
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第六章 动、植物细胞培养装置和酶反应器
因此，微载体培养系统较少单独使用通气搅拌。 返回
6.2
植物细胞培养反应器
6.2.1 机械搅拌悬浮培养生物反应器
罗氏搅拌器的结构如图6-11所示，它在较低的搅拌速度 下有较好的混合效果。罗式搅拌器有六叶搅拌器和四叶搅拌 器，一般常用六叶搅拌器。搅拌器的个数取决于反应器的高 径比，最低端的搅拌器离罐底的距离通常为反应器直径的三 分之一，第二个搅拌器与第一个搅拌器的距离约为搅拌器直 径的1.2倍，余此类推。后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋 式搅拌器进行植物细胞的培养，也取得了较好的效果。使用 这两种搅拌器的植物细胞培养反应器如图6-12所示。一般认 为螺旋式搅拌器效果最优。
6.1
动物细胞培养反应器
这种反应器的优点是：首先，液体在罐体内形成从下 到上的循环，罐内液体在比较柔和的搅拌情况下达到比较 理想的搅拌效果，罐内各处营养物质比较均衡，有利于营 养物质和细胞产物在细胞营养液之间的传递，剪切力对细 胞的破坏降低到比较小的程度。其次，由于搅拌器内单独 分出一个区域供气液接触，气体进入时鼓泡产生的剪切力 无法伤害到细胞。最后，这种反应器的气道也可以用于通 入液体营养，与出液口滤网配合进行细胞的营养液置换培 养增加了反应器的功能。
6.1
动物细胞培养反应器
选择微载体需要考虑以下因素： 1、微载体表面性质。微载体表面性质必须使细胞能够 附着并快速生长。 2、比重。能够使用的微载体要求有一定的比重，需略 大于培养液的比重，但比重也不能太大。 3、微载体的大小分布应该比较集中，以便可以均匀地 悬浮在培养液中。 4、微载体不应该对细胞的生长有任何毒性作用，对细 胞产品也不能有任何不良作用。 5、微载体需要有一定的强度。 6、理想的微载体应该能够重复使用。
6.1
动物细胞培养反应器
6.2
植物细胞培养反应器
6.2.1 机械搅拌悬浮培养生物反应器
罗氏搅拌器的结构如图6-11所示，它在较低的搅拌速度 下有较好的混合效果。罗式搅拌器有六叶搅拌器和四叶搅拌 器，一般常用六叶搅拌器。搅拌器的个数取决于反应器的高 径比，最低端的搅拌器离罐底的距离通常为反应器直径的三 分之一，第二个搅拌器与第一个搅拌器的距离约为搅拌器直 径的1.2倍，余此类推。后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋 式搅拌器进行植物细胞的培养，也取得了较好的效果。使用 这两种搅拌器的植物细胞培养反应器如图6-12所示。一般认 为螺旋式搅拌器效果最优。
6.1
动物细胞培养反应器
这种反应器的优点是：首先，液体在罐体内形成从下 到上的循环，罐内液体在比较柔和的搅拌情况下达到比较 理想的搅拌效果，罐内各处营养物质比较均衡，有利于营 养物质和细胞产物在细胞营养液之间的传递，剪切力对细 胞的破坏降低到比较小的程度。其次，由于搅拌器内单独 分出一个区域供气液接触，气体进入时鼓泡产生的剪切力 无法伤害到细胞。最后，这种反应器的气道也可以用于通 入液体营养，与出液口滤网配合进行细胞的营养液置换培 养增加了反应器的功能。
6.1
动物细胞培养反应器
选择微载体需要考虑以下因素： 1、微载体表面性质。微载体表面性质必须使细胞能够 附着并快速生长。 2、比重。能够使用的微载体要求有一定的比重，需略 大于培养液的比重，但比重也不能太大。 3、微载体的大小分布应该比较集中，以便可以均匀地 悬浮在培养液中。 4、微载体不应该对细胞的生长有任何毒性作用，对细 胞产品也不能有任何不良作用。 5、微载体需要有一定的强度。 6、理想的微载体应该能够重复使用。
6.1
动物细胞培养反应器
第六章 生物制药分离纯化技术绪论解读
第四节 分离纯化的基本工艺流程
（三）可溶性杂质的去除 经细胞破碎与碎片处理的提取液中仍存在各种可溶 概 述 性杂质，这些杂质主要是多肽与蛋白质类、脂 类、多糖类、多酚类、核酸类、脂多糖、盐类 及去垢剂等，需采用适宜的方法去除，否则将 影响生物药物的分离纯化。
4
第四节 分离纯化的基本工艺流程
（四）萃取技术 1．溶剂萃取 溶剂萃取是用一种溶剂将目的药物从另一种溶 剂中提取出来的方法。当生物活性物质以不同 的化学状态存在时，在水及与水不相容的溶液 概 述 中有不同的溶解度。 例如青霉素在酸性条件下为游离酸，在醋酸丁 酯中的溶解度较大，可从水相转移到醋酸丁酯 相中；而青霉素在中性条件下成盐，在水中溶 解度较大，能从醋酸丁酯转移到水相，这样反 复萃取可达到浓缩和纯化的目的。 溶剂萃取法对热敏物质破环少，采用多级萃取 4 时，溶质浓缩倍数和纯化度高，生产周期短， 便于连续生产，但溶剂消耗较大，设备和安全 要求较高。
第一节
概述
生物药物是指综合运用微生物学、化学、生物化学、生物技术、 药学等科学的原理和方法，从生物体、生物组织、细胞、体液等制
造的用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物原料以天然的生物材
料为主，包括微生物、人体、动物、植物、海洋生物等。生物药物 的特点是药理活性高、毒副作用小，主要有蛋白质、核酸、糖类、 脂类等。
4
三、分离纯化方法选择
初步分离纯化方
法的选择
多种分离纯化方 法交替使用
四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价
初步分离纯化方
法的选择
多种分离纯化方 法交替使用
四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价
分辨能力和重现性
回收率 所得药物的重量与活性平 衡 纯化工艺的总成本
第四节 分离纯化的基本工艺流程
第6章发酵产物提取和分离
工业用离子交换膜应具备离子透过性高， 导电性好，电解质扩散量小，水迁移量小， 有一定机械强度，化学稳定性好，膜结构 均匀一致，表面光洁，膨胀性小，价格便 宜等特点。
（1）等电点沉淀法：利用两性电解质在电中 性时溶解度最低的原理进行分离纯化。在低 离子强度下，调节至等电点，可使各种两性 电解质所带净电荷为零，能大大降低其溶解 度。
不同的两性电解质具有不同的等电点，从而 将其分离开。
等电点沉淀法优点是许多蛋白质的等电点都 在偏酸性的范围内，而许多无机酸价格低廉， 并能为食品标准允许，因此常可无须除掉残 余的酸，而直接进行下一步纯化操作。
膜的种类很多，根据结构可分为非均相、半 均相和均相离子交换膜；按作用可分为阳离 子交换膜、阴离子交换膜和具有特种性能的 离子交换膜；根据应用可分为电渗透浓缩用 膜、电渗透脱盐用膜、电解隔膜、对特定离 子具有选择透过性的离子交换膜、扩散渗透 用离子交换膜、反渗透用离子交换膜。
利用离子交换膜的选择透过性，进行抗生素、 柠檬酸和氨基酸等产物的提纯。
高度纯化即精制，采用对产品有高度选样性 的分离技术，除去与产物理化性质相近的杂 质。典型的方法有层析、离子交换等。
成品加工是为了获得质量合格的产品，常用 浓缩、结晶、干燥等技术方法。
6.2 发酵液的预处理及菌体分离
发酵液预处理及菌体分离是下游加工的第 一步操作。
目的是改善发酵液的性质，去除部分可溶 性杂质，分离菌体和其他悬浮颗粒，以利 于提取和精制工序的操作。
但大多数包括以下四个步骤：发酵液预处 理和菌体分离、提取、精制、成品加工。
发酵产品后处理过程流程图
发酵液预处理和菌体分离是采用凝聚和絮凝 等技术，加速固液分离，提高过滤速度。如 果是胞内产物，首先要进行细胞破碎，再分 离细胞碎片。
生物制药学——第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离PPT课件
2、加入絮凝剂
絮凝作用：胶体悬浮液中加入絮凝剂，胶粒 吸附在絮凝剂表面上的功能团上，产生架桥
联接形成巨大的絮凝团沉淀出来的过程。
天然的或人工合成的有机高分子化合物。 （如壳聚糖、海藻酸钠、明胶及酰胺类衍生物、
聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类等）
2、助滤剂：硅藻土、纸浆、石棉、纤维素、 未活化的碳等
要求：惰性、无毒、细度及硬度，成本低。 使用方法：预铺法、混合法、生成法。
二、离心分离
1、过滤式离心机
2、沉降式离心机 管式离心机 碟片式离心机 螺旋卸料离心机
第三节 液-固分离
一、过滤
（一）过滤方式
1、常规过滤 2、错流过滤
错流过滤装置
错流过滤原理示意图
错流过滤的优点 1）收率高 2）滤液质量好 3）连续工艺，自动化；不需助滤剂 4）完全封闭的系统，消除了污染的危险
第三章 生物材料的预处理、细胞破碎 和液固分离
主要内容
❖生物材料的预处理 ❖细胞破碎 ❖固-液分离
第一节 生物材料的预处理
生物原料的特点
1、含量低 2、杂质多 3、易变性失活
（现代生物技术： 微生物工程、细 胞工程、基因工 程、酶工程）
管式离心机
碟片式离心机
螺旋卸料离心机
三、影响液-固分离的因素
（一）悬浮物种类 （二）悬浮液黏度 （三）其他因素
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
目的：去除两大类杂质 1、可溶性黏胶状物质 2、某些无机盐
（一）去除细胞碎片与杂蛋白
1、加入凝聚剂
凝聚作用(coagulation)是指在某些电解质作用下， 使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶 体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。 (P117页)
第二章细胞分离和破碎
细胞的收集或除去为目的的固液离心分离，是分级离心 操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大小/μm
大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞
2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30
第二章细胞分离和破碎
离心力 实验室 工业规模
1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g
2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他 组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需 分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
差 速 离 心
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
2.2.3.2 离心分离法 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体
酵母菌
霉菌
100～300
多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂类 (8.5%～13.5%)
100～250
多层 多聚糖 (80%～90%) 脂类 蛋白质
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎法
• 机械破碎 • 化学和生物化学渗透 • 物理渗透法
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎和产物释放原理
2000～7000 8000～80000 100000～600000
适用
适用
适用
适用
适用
适用
—
适用
适用
—
—
适用
第二章细胞分离和破碎
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心 力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量 离心程度的参数，用Z表示
主要菌体和细胞的离心分离
菌体、细胞 大小/μm
大肠杆菌 酵母 血小板 红血球 淋巴球 肝细胞
2～4 2～7 2～4 6～9 7～12 20～30
第二章细胞分离和破碎
离心力 实验室 工业规模
1 500g 1 500g 5 000g 1 200g 500g 800g
2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他 组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需 分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
差 速 离 心
第二章细胞分离和破碎
第二章细胞分离和破碎
2.2.3.2 离心分离法 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体
酵母菌
霉菌
100～300
多层 葡聚糖 (30%～40%) 甘露聚糖 (30％) 蛋白质 (6%～8%) 脂类 (8.5%～13.5%)
100～250
多层 多聚糖 (80%～90%) 脂类 蛋白质
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎法
• 机械破碎 • 化学和生物化学渗透 • 物理渗透法
第二章细胞分离和破碎
细胞破碎和产物释放原理
2000～7000 8000～80000 100000～600000
适用
适用
适用
适用
适用
适用
—
适用
适用
—
—
适用
第二章细胞分离和破碎
离心沉降速度
离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心 力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量 离心程度的参数，用Z表示
发酵液预处理办法细胞破碎和固液分离
❖ 化学试剂处理
表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，Triton X100,十四烷基胺盐(CTAB);
螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合， 如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法;
有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。 这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和 回收化学物质的问题。
过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
➢滤饼的可压缩性问题 ➢小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转
鼓真空过滤预覆盖层内部，堵塞部分孔。
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂两种加入方法
助滤剂用量等于悬浮 液中固体含量
预先铺一层助滤剂 (1~2mm)
（2） 过滤设备
➢板框过滤机 ➢真空转鼓过滤机 ➢加压叶滤机 ➢带式过滤机 ➢袋式过滤机
非机械方法 ：辅助方法
– 2.2.3.2 化学和生物化学渗透 （1）酸碱处理；（2）化学试剂处理； （3）酶溶 – 2.2.3.3 物理渗透法 （1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法
2.2.3.1 机械破碎
细胞匀浆液
（1）
阀座
高
压
匀 细胞悬浮液
浆
法
碰撞环 阀
图2.11 高压匀浆器结构简图
• 破碎原理：
• 离心转速r=5000 r/min，半径R=30 cm， • 离心力？g
Zg=8385g Z=1.118×10-5×(r)2×R
超离心法
分为：差速离心，区带离心。
差速离心(differential centrifugation)
主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离
不同大小的细胞器。
区带离心（Zonal centrifugation）
表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，Triton X100,十四烷基胺盐(CTAB);
螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合， 如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法;
有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。 这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和 回收化学物质的问题。
过滤助剂
过滤助剂可解决两个问题
➢滤饼的可压缩性问题 ➢小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转
鼓真空过滤预覆盖层内部，堵塞部分孔。
常用的过滤助剂 硅藻土、珍珠岩、活性白土
助滤剂两种加入方法
助滤剂用量等于悬浮 液中固体含量
预先铺一层助滤剂 (1~2mm)
（2） 过滤设备
➢板框过滤机 ➢真空转鼓过滤机 ➢加压叶滤机 ➢带式过滤机 ➢袋式过滤机
非机械方法 ：辅助方法
– 2.2.3.2 化学和生物化学渗透 （1）酸碱处理；（2）化学试剂处理； （3）酶溶 – 2.2.3.3 物理渗透法 （1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法
2.2.3.1 机械破碎
细胞匀浆液
（1）
阀座
高
压
匀 细胞悬浮液
浆
法
碰撞环 阀
图2.11 高压匀浆器结构简图
• 破碎原理：
• 离心转速r=5000 r/min，半径R=30 cm， • 离心力？g
Zg=8385g Z=1.118×10-5×(r)2×R
超离心法
分为：差速离心，区带离心。
差速离心(differential centrifugation)
主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离
不同大小的细胞器。
区带离心（Zonal centrifugation）
第六章膜分离过程
10
截留分子量： 微滤 0.02～10μm 透析 3000 Dalton～ 几万Dalton 超滤 50 nm～100 nm或5000～50万 Dalton 纳滤 200～1000 Dalton或1 nm 反渗透 200 Dalton
11
概述
膜分离法与物质大小（直径）的关系
RO NF UF MF
膜分离技术兼具分离、浓缩和纯化的功能，又有
使用简单、易于控制及高效、节能的特点
选择适当的膜分离技术，可替代过滤、沉淀、萃
取、吸附等多种传统的分离与过滤方法。
膜分离技术得到各国重视：国际学术界一致认为
“谁掌握了膜技术，谁就掌握了化工的未来”。
膜分离技术在短短的时间迅速发展起来，近30年
也可用作微滤膜和超滤膜。 它的最高使用温度和pH范围有限，一般使用温度
低于45～50℃，pH3～8。
17
醋酸纤维特点：
①透过速度大 ②截留盐的能力强 ③易于制备 ④来源丰富 ⑤不耐温（30℃） ⑥pH 范围窄，清洗困难 ⑦与氯作用，寿命降低 ⑧微生物侵袭 ⑨适合作反渗透膜
45
蛋白质、无机盐 缓冲液
无机盐
膜对溶质的截留能力以截留率R（rejection） 来表示，其定义为
R＝1－ Cp／Cb
式中Cp和Cb分别表示在某一瞬间，透过液 （Permeate）和截留液的浓度。
如R＝1，则Cp＝0，表示溶质全部被截留；
如R＝0，则Cp＝ Cb，表示溶质能自由透过膜。
29
截 断 曲 线
得到的截留率与分子量之间的关系称为截断曲线。 质量好的膜应有陡直的截断曲线,可使不同分子量的溶质 分离完全；反之，斜坦的截断曲线会导致分离不完全。
截留分子量： 微滤 0.02～10μm 透析 3000 Dalton～ 几万Dalton 超滤 50 nm～100 nm或5000～50万 Dalton 纳滤 200～1000 Dalton或1 nm 反渗透 200 Dalton
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概述
膜分离法与物质大小（直径）的关系
RO NF UF MF
膜分离技术兼具分离、浓缩和纯化的功能，又有
使用简单、易于控制及高效、节能的特点
选择适当的膜分离技术，可替代过滤、沉淀、萃
取、吸附等多种传统的分离与过滤方法。
膜分离技术得到各国重视：国际学术界一致认为
“谁掌握了膜技术，谁就掌握了化工的未来”。
膜分离技术在短短的时间迅速发展起来，近30年
也可用作微滤膜和超滤膜。 它的最高使用温度和pH范围有限，一般使用温度
低于45～50℃，pH3～8。
17
醋酸纤维特点：
①透过速度大 ②截留盐的能力强 ③易于制备 ④来源丰富 ⑤不耐温（30℃） ⑥pH 范围窄，清洗困难 ⑦与氯作用，寿命降低 ⑧微生物侵袭 ⑨适合作反渗透膜
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蛋白质、无机盐 缓冲液
无机盐
膜对溶质的截留能力以截留率R（rejection） 来表示，其定义为
R＝1－ Cp／Cb
式中Cp和Cb分别表示在某一瞬间，透过液 （Permeate）和截留液的浓度。
如R＝1，则Cp＝0，表示溶质全部被截留；
如R＝0，则Cp＝ Cb，表示溶质能自由透过膜。
29
截 断 曲 线
得到的截留率与分子量之间的关系称为截断曲线。 质量好的膜应有陡直的截断曲线,可使不同分子量的溶质 分离完全；反之，斜坦的截断曲线会导致分离不完全。
第二章 细胞分离与破碎
助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较 差。
58
➢离心过滤机（centrifugal filter）
➢结构：
转鼓(上有小孔，亦称悬框)； ➢滤网； ➢滤布；
机架。
➢原理：
转鼓 滤饼 滤布 滤网
离心过滤机工作原理图
由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤 布及滤网而流出。
61
第四章 细胞破碎
31
（1）斜角式离心机
❖是一类结构最简单的实验室常用离心机。
32
（2）平抛式离心机
❖一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般 在 3000-6000rpm。
平抛式离心机转子
33
（3）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）
34
35
**管式离心机特点：
• 结构简单。 • 管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋
白质分离。 • 固体挂壁多时，可采用多台交替操作。 • 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬
浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度 小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液 两相密度差较小的分离。
36
（4）碟片式离心机（disk-bowl centrifuge） 工作原理
37
（5）螺旋式离心机（scroll-type centrifuge）
成本高 实验室，部分工业
94
四、**选择性释放目标产物的一般原则
(1)仅对目标产物的位置周围破碎 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件
更加温和，在相同的目标产物释放率条 件下，降低细胞的破碎程度。
96
讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究
一. 化学法
20%(W/V)大肠杆菌悬浮液 + B.A
58
➢离心过滤机（centrifugal filter）
➢结构：
转鼓(上有小孔，亦称悬框)； ➢滤网； ➢滤布；
机架。
➢原理：
转鼓 滤饼 滤布 滤网
离心过滤机工作原理图
由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤 布及滤网而流出。
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第四章 细胞破碎
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（1）斜角式离心机
❖是一类结构最简单的实验室常用离心机。
32
（2）平抛式离心机
❖一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般 在 3000-6000rpm。
平抛式离心机转子
33
（3）管式离心机（tubular-bowl centrifuge）
34
35
**管式离心机特点：
• 结构简单。 • 管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋
白质分离。 • 固体挂壁多时，可采用多台交替操作。 • 适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬
浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度 小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液 两相密度差较小的分离。
36
（4）碟片式离心机（disk-bowl centrifuge） 工作原理
37
（5）螺旋式离心机（scroll-type centrifuge）
成本高 实验室，部分工业
94
四、**选择性释放目标产物的一般原则
(1)仅对目标产物的位置周围破碎 (2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件
更加温和，在相同的目标产物释放率条 件下，降低细胞的破碎程度。
96
讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究
一. 化学法
20%(W/V)大肠杆菌悬浮液 + B.A