荧光抗体稀释液(Evans Blue法)
免疫荧光染色法
免疫荧光染色法
原理
用荧光素标记已知抗体或抗原，检查细胞或组织标本相应的抗原或抗体。
在荧光显微镜下，抗原抗体特异性结合部位的荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光。
根据荧光物存在的位置和数量，可确定抗原抗体在组织细胞中的位置和分布。
用于标记的荧光素有异硫氰酸（FITC )和四乙基罗丹明(RB200），前者发射的荧光波长为490~619nm（黄绿色荧光），后者发射的荧光波长为540~660nm（橙红色荧光）。
染液配制
0.5%伊文思蓝液：0.5g伊文思蓝溶于89mL pH7.2~7.4的PBS液中，再加11mL 1%NaN，过滤，4°保存。
荧光素标记抗体用0.02%伊文思蓝溶液稀释，伊文思蓝液将细胞背景染成蓝色荧光，与细胞特异性荧光（如异硫氰酸荧光素）形成鲜明的对比，并减少了飞特异性荧光。
染色步骤
用间接荧光法染色
（1）用95%酒精固定单层细胞培养物10~30min，或用冷丙酮固定5~10min
（2）PBS洗三次，每次5min，边洗边振荡
（3）滴加未标记的Ⅰ抗液，置37°湿盒中30min
（4）PBS洗三次，每次5min，边洗边振荡。
以除去飞特异性吸附的抗体，减少背景染色（5）滴加荧光标记Ⅱ抗，置37°湿盒中30min
（6）PBS洗三次，每次5min，边洗边振荡
（7）揩干玻片周围水分并甩掉材料上的水分
（8）荧光显微镜下观察。
伊文思蓝染色液(0.5%)
伊文思蓝染色液(0.5%)简介：伊文思蓝(Evans Blue)又称偶氮蓝，分子式C 34H 24N 6Na 4O 14S 4，分子量为960.80，CAS 号为314-13-6伊文思蓝与台盼蓝都是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性和细胞是否存活。
活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。
活细胞因有外排功能而无法被伊文思蓝染色，因此可以通过此方法在显微镜下区分死细胞与活细胞，但无法区分死亡与坏死。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)血脑屏障通透性1、 取处理后的实验动物(以小鼠为例)，静脉注射Evans Blue Stain (0.5%)，小鼠眼睛、皮肤出现蓝色。
0.5～1h 后处死小鼠，取目的脑组织。
2、 脑组织置于1.5ml 离心管中，加入1ml PBS ， 迅速用组织匀浆器将脑组织制成匀浆, 离心。
3、 取上清，加入等量三氯乙酸，4℃孵育。
该步骤亦可采用如下操作: 取上清，按上清:丙酮=3:7比例加入丙酮，室温孵育24h 。
4、 离心15min 。
5、 取上述溶液，用分光光度计测620 nm 处吸光值(OD 值)。
同时测定已知不同梯度的标准依文思蓝的OD 值，绘制标准曲线。
根据标准曲线计算出待测待测样品的依文思蓝含量。
(二)活细胞染色1、取100μl 重悬细胞到常规离心管内，入100μl Evans Blue Stain 轻轻混匀染色(染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。
2、吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。
通常如果要比较精确地进行定量，每个细胞样品至少数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。
细胞存活率计算公式如下:细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%注意事项： 编号 名称 DK0001 Storage Evans Blue Stain(0.5%) 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份1、Evans Blue Stain对人体有轻微毒性，请小心防护。
免疫荧光染色二抗稀释液使用说明书
温馨提示 为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，戴手套等。
储存温度 2~8℃保存。
包装清单 货号
HCY066
品名 免疫荧光染色二抗稀释液
说明书
包装 100mL 1份
1
按照每个二抗稀释10ml计算一个包装的免疫荧光染色二抗稀释液可以稀释10个或10使用说明参考所用的荧光标记二抗的使用说明以及一抗的质量和样品中目的蛋白的含量按照适当比例例如1
杭州昊鑫生物科技股份有限公司
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免疫荧光染色二抗稀释液
免疫荧光染色二抗稀释液 免疫荧光染色二抗稀释液可用于免疫荧光染色时荧光标记二抗的稀释。经稀释的荧光标记
二抗可以在 4℃保存和使用，可以反复多次用于免疫荧光染色，节约您宝贵的抗体。 按照每个二抗稀释 10mL 计算，一个包装的免疫荧光染色二抗稀释液可以稀释 10 个或 10
次二抗。
使用说明 参考所用的荧光标记二抗的使用说明，以及一抗的质量和样品中目的蛋白的含量，按照适当比 例例如 1:1000、1:500 等比例稀释二抗。荧光标记二抗稀释后即可直接用于免疫荧光染色。免 疫荧光染色结束后，可以回收稀释的二抗，4℃保存，以用于下次的免疫荧光染色。
CNAS-GL41临床微生物检验程序验证指南
包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在内的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。
由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。
虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。
部分内容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。
实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。
检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。
所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。
4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对（当多名人员从事该项目时）。
如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。
若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室内部比对。
4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。
实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。
4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。
4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。
4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。
4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。
目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。
临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。
伊文氏蓝资料检索
Evans Blue资料检索一、Evans Blue使用原理伊文思蓝（evans blue，EB）是一种生物染料，经静脉注射后很快与血浆清蛋白结合，用EB外渗作为血浆蛋白外渗指标，可观察皮肤蓝色外渗的部位和范围。
以往的研究表明内脏病变在相应脊髓节段的皮肤引起神经源性炎性反应，而穴位处体表的神经源性炎性反应伴随着局部血管通透性的改变可导致EB渗出点的出现，因而在进行了穴位与内在相关联系的神经机制一系列实验后，认为神经源性炎性反应（以EB渗出反映）可作为经脉显示的标志。
[3]二、Evans Blue的使用方法1、使用5%的Evans Blue( SIGMA) 溶液(0．9%氯化钠溶液配制)，按50 mg /kg剂量在大鼠尾静脉注射[6]成功标准为注射后大鼠眼睛即刻变蓝。
[1]2、腹部脱毛后，在鼠板上标记大鼠头、耳根、尾根的位置，将大鼠以仰卧位固定于鼠板上的同一位置，分别拍摄造模后5、10、15、20、25h的大鼠腹部图像。
拍摄照片要求:采用脑立体定位仪的三维支架，标定拍摄高度为25cm，造模后4h拍照。
[3]三、Evans Blue的观测指标及方法1、经纬网格计数法：①构建经纬网格:大鼠腹部照片构建以５ｍｍ×５ｍｍ为计数单位距离的经纬网格，该坐标系构建以胸骨上缘中点为原点，以腹部正中线及其垂直线为坐标轴（纵轴上至胸骨上缘，下至耻骨联合水平）②渗出点计数：（1）目标渗出点应隐于皮下，而在表皮且呈片状渗出或色泽鲜艳者乃表皮损伤所致，为假阳性点，需排除。
（2）无ＥＢ渗出点记为０；１个ＥＢ渗出点完整地出现在１个网格内，将其记为１；若１个渗出点横跨２个及以上网格时，则以“记上不记下，记右不记左”为计数原则将其记录。
（3）肋弓下缘为网格Ｌ，对Ｌ１—Ｖ１６网格内ＥＢ渗出点个数逐一进行记录，并将数据输入ＳＰＳＳ２２．０软件中（见图２）。
③统计学方法（1）聚类分析选取聚类树状图结果中分层级别最高且又独立的若干个坐标点，即“特征网格”（2）轮廓分析判定“特征网格”的渗出点数与不同芥子油浓度、时间的关系。
荧光一抗稀释液使用说明
荧光一抗稀释液使用说明
货号：A1841
规格：10ml/100ml
保存：-20℃保存，有效期为2年。
短期可2-8℃保存。
产品说明：
免疫荧光一抗稀释液(Immunofluorescence Staining Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫荧光实验时荧光一抗的稀释和配制。
产品添加了抗体保护剂、稳定剂等成分，有效增加了稀释后荧光一抗的稳定性。
用此稀释液稀释后的一抗可在2-8℃环境下稳定保存半年。
使用方法：
按照荧光一抗推荐效价（或个人优化条件），将适量抗体加入抗体稀释液即可。
例如，效价为1：1000时，可将1ul抗体加入到1ml抗体稀释液中，充分混匀后即可使用。
抗体最好现用现稀释，稀释后的抗体可2-8℃保存。
注意事项：
如需抗体回收再利用，建议在2-8℃进行一抗的结合反应，以减缓抗体效价的衰减速度。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
荧光抗体稀释液
北京索莱宝科技有限公司
荧光抗体稀释液
货号：A1840
规格：10ml/100ml
保存：-20℃保存，有效期为2年。
短期可2-8℃保存。
产品说明：
本免疫荧光抗体稀释液(Immunofluorescence Staining Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫荧光实验时荧光标记抗体的稀释和配制。
产品添加了抗体保护剂、稳定剂等成分，有效增加了稀释后荧光抗体的稳定性。
用此稀释液稀释后的抗体可在2-8℃环境下稳定保存半年。
使用方法：
按照荧光抗体推荐效价（或个人优化条件），将适量抗体加入抗体稀释液即可。
例如，效价为1：1000时，可将1ul抗体加入到1ml抗体稀释液中，充分混匀后即可使用。
抗体最好现用现稀释，稀释后的抗体可2-8℃保存。
注意事项：
如需抗体回收再利用，建议在2-8℃进行抗体的结合反应，以减缓抗体效价的衰减速度。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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荧光抗体稀释液(Evans Blue法)
北京雷根生物技术有限公司
荧光抗体稀释液(Kolmers 法)
简介：
荧光抗体稀释液用于荧光染色时一抗(primary antibody)、二抗(secondary antibody)的稀释和配制。
当荧光抗体的染色如果背景较高，可以用Leagene 荧光抗体稀释液(Kolmers 法)稀释至临界浓度，使特异性染色呈阳性而非特异性染色呈阴性。
Leagene 荧光抗体稀释液(Kolmers 法)由伊文思蓝、盐等组成，为蓝色液体，减少非特异性荧光，宜做常规应用。
组成：
自备材料：
1、 载玻片
2、 盖玻片
3、 荧光显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作。
2、 稀释抗体后应4℃避光保持。
注意事项：
1、 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
2、 在使用荧光抗体稀释液的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。
有效期： 12个月有效。
编号 名称 IH0347 IH0347 Storage 荧光抗体稀释液(Evans Blue 法) 50ml 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份。
evans blue peroxynitrite 测定原理
Evans Blue是一种具有吸附性能的分子，它可以与蛋白质非共价结合而不影响其功能。
Peroxynitrite是一种反应性氮物质，它与多种生物大分子如蛋白质、核酸等发生反应，
从而引起细胞损伤和炎症反应，甚至导致细胞死亡。
测定Peroxynitrite的方法之一就是使用Evans Blue作为指示剂。
测定过程如下：
1. 首先，将待测样品与Evans Blue混合，在一定的条件下使其反应。
2. Peroxynitrite会导致Evans Blue与蛋白质结合，从而改变其光谱特性。
测量反应体系
的吸收光谱（通常为620nm和680nm），可以计算出相对于Evans Blue的蛋白质结合量。
3. 根据吸光度的变化量，可以推算出反应中Peroxynitrite的含量。
该方法具有快速、灵敏、专属性高等优点，被广泛应用于生物医学领域中对Peroxynitrite产生及相关疾病的研究。
伊文思蓝(EB)检测血脑屏障(BBB)通透性之欧阳歌谷创作
1、测定血脑屏障完整性原理欧阳歌谷（2021.02.01）伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂,因其分子量大小与血浆白蛋白相近，而且在血液中与血浆白蛋白有很高的亲和力，由于正常状态下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所以染色时，如神经系统是完整的，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。
相反如果神经系统血脑屏障被破坏，依文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。
在荧光波长470与540 nm 各有一强峰，680 nm 处有一弱峰。
其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。
脑组织中血脑屏障的破坏，可以引起毛细血管的通透性增加，结合EB的白蛋白可通过BBB进入脑组织，应用化学比色法甲酰胺测定脑组织EB渗出量，可以反映血脑屏障的开放程度，并在此基础上进一步探讨不同细胞移植干预与BBB通透性的效应关系。
伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中EB 荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的EB含量进行定量分析。
两者结合可以从形态学、组织定量上相互补充完善。
2、实验准备试剂：2%EB、1%戊巴比妥钠、0.9%氯化钠、20U/ml肝素钠、二甲基甲酰胺器材：冰冻切片机、共聚焦激光扫描显微镜、分光光度计、恒温箱、离心机、注射器、输液器、解剖器械等3、测定方法1、各组动物处死前0.5h（也有的为1h、2h）尾静脉（或股静脉）注入2%EB（2ml/kg，也有的用3、4ml/kg）（剂量与提前时间成反比？）2、1%戊巴比妥钠30-40 mg/kg麻醉后打开胸腔，心内灌注肝素生理盐水（0.9%氯化钠+20U/ml肝素钠）200-300ml（有文献提出当右心房流出液体变清澈时即可停止灌注），断头取脑作矢状切取半脑分离海马，一半脑组织进行冰冻切片，应用冰冻切片机行10-20μm切片，于共聚焦激光扫描显微镜下观察 EB通透情况。
3、另一半脑组织称重，剪碎置于二甲基甲酰胺（1ml/100mg脑组织，也可用三氯乙酸、甲酰胺）60℃孵育24h，1000r/min离心5min（有的作者认为脑组织在甲酰胺中匀浆呈胶状，上清液不能通过离心取得，水浴后直接取上清液比色），用分光光度计检测波长为620 nm的吸光度。
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北京雷根生物技术有限公司
荧光抗体稀释液(Evans Blue 法)
简介：
荧光抗体稀释液用于荧光染色时一抗(primary antibody)、二抗(secondary antibody)的稀释和配制。
当荧光抗体的染色如果背景较高，可以用Leagene 荧光抗体稀释液(Evans Blue 法)稀释至临界浓度，使特异性染色呈阳性而非特异性染色呈阴性。
Leagene 荧光抗体稀释液(Evans Blue 法)由伊文思蓝、盐等组成，为蓝色液体，减少非特异性荧光，宜做常规应用。
组成：
自备材料：
1、 载玻片
2、 盖玻片
3、 荧光显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作，稀释抗体后应4℃避光保存。
注意事项：
1、 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。
2、 在使用荧光抗体稀释液的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。
有效期： 12个月有效。
相关：
编号 名称 IH0347 IH0347 Storage 荧光抗体稀释液(Evans Blue 法) 50ml 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份
编号 名称 DC0032 Masson 三色染色液 PS0013 RIPA 裂解液(强) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD 比色法)。