植物检疫之实验室检测共33页
植物检疫技术
如确系该菌，则接种部 位软腐、维管束褐变
生理生化及快速测定法
• • 生化测定试剂盒： Biolog 测定：
噬菌体检测
血清学检测技术
酶联免疫吸附技术
(ELISA)-- 酶联免疫吸
附测定(Enzyme linked immunology assay,
电了显微镜观察
• 目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊 断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。
免疫学检测法
快速免疫滤纸测定法(Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA)
免疫胶体金技术 (Immune colloidal gold technique)
分子生物学检测方法
植物寄生线虫的各种分离方法
直接解剖法-- 内 生线虫在体视显
微镜下用解剖针
直接解剖病组织
•
简易贝尔曼漏斗法:分离少量植物材料中有活 动能力的线虫。
清洗材料 收集线虫 切成小段
裹纱布
浸入漏斗12h
• 浅盘法
•
卡勃过筛分离法――本法用于从大量土壤中分离
各类线虫。
检疫性线虫的一般检验程序及注意事项
的检查、可用于病害普查，口岸检 疫和产地检疫等。
间接法
一抗
底物
二抗
免疫荧光技术
分子检测技术
特异性基因或DNA序列用于检测病原菌
核糖体DNA基础的PCR策略
分子检测试剂盒
生物学检测技术
• 鉴别寄主检测--以鉴别寄主反应或指示植物为依 据的方法。
• 曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境 和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少。
第二节 病原细菌的检疫检验技术
植物检疫
第四章植物检疫程序现场检验：是检疫人员在现场环境中对植物、植物产品或其他限定的商品进行的直观检查，以确定是否存在有害生物和/或确认是否符合植物检疫法规要求的法定程序。
现场检查的主要方法：肉眼检查、过筛检查、X光机检查和检疫犬检查等。
实验室检测：由检验人员在实验室中借助一定的仪器设备对样品进行深入检查的植物检疫法定程序，以确认有害生物是否存在或鉴别有害生物的种类。
实验室检测常用方法：比重检测、染色检测、洗涤检测、保湿萌芽检测、分离培养与接种检测、噬菌体检测、显微镜检测、血清学检测、鉴别寄主检测、分子鉴定和计算机辅助鉴定等产地检疫：是在植物或产品出境或调运前，输出方的植物检疫人员在其生长期间到原产地进行检验、检测的过程。
预检：是在植物或植物产品入境前，输入方的植物检疫人员在植物生长期间或加工包装时到产地或加工包装场所进行检验、检测的过程。
产地检疫和预检意义①提高检疫结果的准确性；②简化现场检验的手续，加快商品流通；③避免货主的经济损失。
隔离检疫：是将拟引进的植物种子、苗木和其他繁殖材料，在植物检疫机关指定的场所内，在隔离条件下进行试种，在其生长期间进行检验和处理的检疫过程。
第七章危险性植物病原生物真菌1、小麦印度腥黑穗病菌越冬场所：病菌以冬孢子或菌瘿在土壤中、种子表面或粪肥中越冬。
传播途径：远距离传播－冬孢子随种子的调运传播。
近距离传播－病区主要靠带菌土壤传播。
粪便和秸秆也能传病；随气流传播到麦穗上进行侵染。
检测方法①直接镜检法：50克麦种加100ml水，加1滴吐温20，震荡洗涤30分钟，洗涤液通过上铺滤纸的布氏漏斗，用抽气泵抽滤，1%-3%的KOH湿润滤纸，在25-50倍解剖镜下镜检。
②氢氧化钠鉴定法：用0.2%NaOH溶液浸种24h (20℃)。
病粒发病部位乌黑发亮，健康部位灰黄色。
③洗涤检验、冬孢子形态鉴定：同小麦矮化腥黑穗病菌。
④过滤抽提---离心富集技术：分级过筛-α-淀粉酶酶解-蔗糖密度梯度离心对小麦中的孢子富集，进行检测。
植物检疫之实验室检测
细菌病害
病毒病
病毒内含体形态——风轮状、不规则多边形等
检测病毒内含体 （细胞核/细胞质内）
植物染病后的生理代谢反应
植保素大量累积
病毒病染色原理 蓝 色 多酚物质 + NaOH → 蓝色
植保素之一
显色时间较短 易氧化而成红色
• 【不确定性】凡是植物发生生理损伤的情况，植 物体内均能够大量合成多酚。
B、塑料袋密封检验
塑料袋密封数 小时后，其中的 实蝇幼虫因缺氧 破果而出。
6、害虫的检验方法
C、水盆观察法
将水果或蔬菜放入一个瓷盘内，支放在盛有
清水的大瓷盆上，再用40目尼龙纱罩上。室 温下观察7-10d，实蝇幼虫会从果中弹进大盆 内。本方法主要用于新鲜成熟度不高的水果 。
7、现代生物技术检测手段
4、保湿萌芽检测：检查种子是否带菌
【方法】
• 在实验室条件下，
进行种子发芽试验
• 检测种子萌发阶段
的发病情况
多种培养方法
5、“分离培养+接种鉴定”检测
科赫氏法则 (1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；
——镜检 ——分离纯化 (3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害； ——接种 ——再次镜检鉴定
(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；
(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同。
5、“分离培养+接种鉴定”检测
科赫氏法则的应用
(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；
——镜检
(2)该微生物可在培养基上分离，并得到纯培养
——分离纯化
(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；
保湿萌芽检测
植物检验检疫技术
第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 4、洗涤检验法
洗涤检验的操作程序如下：
(3)镜检计数：弃去离心管内的上清液，加入一定量蒸馏水 或其它浮载液，重新悬浮沉集在离心管底部孢子，取悬浮 液，滴加在血球计数板上，用高倍显微镜检查孢子种类并 计数，据此可计算出种子的带菌量。
琼脂平皿法 用琼脂培养基代替了吸水纸
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第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术
• 二、实验室检验检疫技术
• 9、保湿萌芽检验
萌芽法检验 沙土萌发检验 土内萌发检验 试管幼苗症状测定
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第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 10、诱捕器诱集检验
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第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术
• 二、实验室检验检疫技术
• 12、植物病原线虫的各种分离方法
浅盘分离法：原理同漏斗法
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第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术
• 12、植物病原线虫的各种分离方法
简易漂浮分离法：本法利用干燥的线虫胞囊 能漂浮在水面的特性分离土壤中的马铃薯 金 线 虫 (Globoderarostochiensis) 和 各 种 胞囊线虫(Heterodera)。
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第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术
• 二、实验室检验检疫技术 • 2、染色检验法 对植物病原细菌检验可以用革兰氏染色法和
鞭毛染色法，对于植物病原线虫则用透明 染色法
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第五章 植物检验检疫技术
植物检疫实验报告
实验一种子洗涤检验法
一、目的要求
掌握种子洗涤检验法，确定麦种样品表面附着带菌种类和带菌量。
二、基本原理
洗涤法是种子检验常用的方法之一，用于检测种子表面附着的真菌孢子或颖壳上的病原线虫，如黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以及分生孢子等。
其方法是将一定量的被检样品放入容器中，加入一定量的无菌水，充分振荡一定时间，使样品表面所带的病菌孢子尽量洗涤下来，而后将洗涤液经离心机沉淀，镜检沉淀物，确定病原菌种类并计数。
三、材料、试剂与仪器
材料:带菌麦种。
试剂:蒸馏水、无菌水等。
仪器:显微镜、振荡器、离心机、血球计数器、接物测微尺、药物天平、三角瓶（100ml）、烧杯（100ml）、刻度离心管、滴管、镊子、载玻片、二甲苯（双层瓶
装）、镜头纸、脱脂纱布等。
四、实验操作
•从被检种子样品中取25g放入三角瓶中，加无菌水50ml，将三角瓶加塞后在振荡器上振荡15min。
•将洗涤液分装于两支刻度离心管中，在天平上称重平衡后，放入离心机的对称孔中，以10000rpm速度离心5min。
•用吸管吸去上层部分清水，留下1ml管底沉淀液，将两管底沉淀液摇匀，合并后备用。
•镜检和测定孢子负荷量）。
•五、实验作业
•列出原始数据，计算每克种子上的带菌量。
每克种子所带孢子数＝K×N×L/W
其中 N＝1个小方格中孢子的平均数。
L＝计数孢子的洗涤液总毫升数。
W ＝供检验种子克数。
第五章 植物检验检疫技术课件
第五章 植物检验检疫技术
• 第二节 用
植物检验检疫新技术的应
• 四、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）
• 五、基因芯片检测技术
第五章 植物检验检疫技术
• 第三节 集
植物检疫信息和资料的收
• 一、植物检疫情报资料的内容
• 二、植物检疫信息和资料的收集
• 1、文献信息收集
• 2、利用网络收集文献信息
信息素 诱饵
第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 11、鉴别寄主检测
应用于植物病毒的鉴定、诊断及检疫中
第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 12、植物病原线虫的各种分离方法
漏斗分离法：此法适于分离少量植物材料中有活动能力的线 虫。基本装置是一个直径适当的漏斗，漏斗颈末端接一段 乳胶管，用弹簧夹把管子夹住。漏斗放置在支架上，其内 盛满清水。把检验的植物材料洗掉泥土后，切成0．5cm长 的小段，放在纱布中包起来，轻轻地浸入漏斗内。线虫从 植物组织中逸出，经纱布沉落到漏斗颈底，经12h或过一 夜后，打开弹簧夹使胶管前端的水流到玻皿内，镜检线虫
各加lml新培养的白叶枯细菌指示菌液(浓度 为9X108／ml以上)混匀后加入10ml融化的肉 汁胨琼脂培养基，摇匀凝成平板后，放在 25—28℃温箱中，培养10—12h
第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
保湿培养检验 吸水纸检验法
保湿培养检验 冰冻吸水纸法
是前一个的改进版，可以减少杂菌污染、抑 制种子发芽
第五章 植物检验检疫技术
• 第一节 常规检验检疫技术 • 二、实验室检验检疫技术 • 9、保湿萌芽检验
常用的植物检疫方法
常用的植物检疫方法一、直观检查法1.1 看外观植物检疫的时候啊，这看外观可是个挺重要的法子呢。
就像咱挑水果似的，眼睛得尖。
比如说检查苗木，瞅瞅那叶子有没有发黄啊，有没有长奇怪的斑点或者洞洞啥的。
要是叶子病恹恹的，那可能就有问题喽。
像柑橘苗木，如果叶子上有那种不规则的黄斑，说不定就感染了啥病菌。
这就好比人脸上长了痘痘，肯定是身体哪儿有点不舒服啦。
1.2 查形状再就是形状也得好好瞧。
健康的植物啊，它的枝干啊、果实啊形状都比较规整。
要是发现果实长得歪瓜裂枣的，枝干也奇形怪状，那就得小心喽。
比如说一些被害虫侵害的果树，结的果子可能就会变小、变形，这就是个危险的信号，就像那句老话说的“事出反常必有妖”嘛。
二、实验室检测法2.1 显微镜观察显微镜这玩意儿可厉害啦。
把植物的组织或者害虫啥的放在显微镜下，就像把小虫子或者病菌拉到咱眼皮子底下审问一样。
咱可以看到那些肉眼看不到的病菌孢子啊，害虫的虫卵啊啥的。
比如说检查小麦是否感染锈病，在显微镜下就能看到那些像小棍子一样的锈菌孢子，密密麻麻的，看到这场景，心里就“咯噔”一下，知道这小麦有麻烦了。
2.2 培养检测还有培养检测呢。
把怀疑有病菌的植物组织放在特定的培养基上，就像给病菌一个小窝，让它们“安居乐业”，看它们能不能长出来。
要是长出来了，那就可以确定是啥病菌了。
这就好比钓鱼，把饵放下去，看能钓上来啥。
比如说检测花卉是否感染根腐病菌，把根部组织放在培养基上，要是培养基上出现了那种毛茸茸的菌丝，那根腐病菌就被咱逮着了。
2.3 血清学检测血清学检测也很有用。
这就像是给病菌或者害虫做个特殊的标记。
利用抗原和抗体的反应，就像钥匙和锁一样匹配。
如果检测结果呈阳性，那就说明有咱们要找的病菌或者害虫。
比如说检测植物是否感染病毒，用血清学检测就像火眼金睛一样，能把那些隐藏得很深的病毒给揪出来。
三、诱捕检测法3.1 灯光诱捕灯光诱捕就像是给害虫设个小陷阱。
晚上啊，把那诱虫灯一亮，那些有趋光性的害虫就像飞蛾扑火一样，傻乎乎地就飞过来了。
植物检疫实验报告
实验一种子洗涤检验法
一、目的要求
掌握种子洗涤检验法，确定麦种样品表面附着带菌种类和带菌量。
二、基本原理
洗涤法是种子检验常用的方法之一，用于检测种子表面附着的真菌孢子或颖壳上的病原线虫，如黑粉菌的厚垣孢子、霜霉菌的卵孢子、锈菌的夏孢子以及分生孢子等。
其方法是将一定量的被检样品放入容器中，加入一定量的无菌水，充分振荡一定时间，使样品表面所带的病菌孢子尽量洗涤下来，而后将洗涤液经离心机沉淀，镜检沉淀物，确定病原菌种类并计数。
三、材料、试剂与仪器
材料:带菌麦种。
试剂:蒸馏水、无菌水等。
仪器:显微镜、振荡器、离心机、血球计数器、接物测微尺、药物天平、三角瓶（100ml）、烧杯（100ml）、刻度离心管、滴管、镊子、载玻片、二甲苯（双层瓶
装）、镜头纸、脱脂纱布等。
四、实验操作
•从被检种子样品中取25g放入三角瓶中，加无菌水50ml，将三角瓶加塞后在振荡器上振荡15min。
•将洗涤液分装于两支刻度离心管中，在天平上称重平衡后，放入离心机的对称孔中，以10000rpm速度离心5min。
•用吸管吸去上层部分清水，留下1ml管底沉淀液，将两管底沉淀液摇匀，合并后备用。
•镜检和测定孢子负荷量）。
•五、实验作业
•列出原始数据，计算每克种子上的带菌量。
每克种子所带孢子数＝K×N×L/W
其中 N＝1个小方格中孢子的平均数。
L＝计数孢子的洗涤液总毫升数。
W ＝供检验种子克数。