植物检疫之实验室检测
植物病害检疫检验技术真菌
N=n1×n2×n3/m 式中： N－－每克种子的孢子负荷量 n1－－每视野平均孢子数 n2－－盖玻片面积上的视野数 n3－－1ml水的滴数 m－－供试样品的重量（g）
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如果镜检洗涤液时，没有检查到病菌孢子，则对同一 样品要重复几次取样洗涤，对每一洗涤液至少要镜检5张 玻片。当一个样品两次取样，洗涤检验的结果相差很大时， 则需要重复一次。
（九）接种方法
从种子、苗木及其他繁殖材料上获得的病菌，有时还 需接种到植株上，使其表现典型症状后，再检查鉴别。
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由于病原种类与传播方式不同，其接种的方法也各不相同， 常用接种方法有下列几种：
(1)拌种接种：用病菌孢子拌种，是接种黑粉病（如矮腥黑穗病） 最常用的方法。
(2）浸种接种：用病原真菌孢子悬浮液浸种，也是常用的接种方法。 (3)花期接种法：主要用于从花期侵入的病菌。如：大麦、小麦散 黑穗病菌的接种。在抽穗后1-2天，用冬孢子悬浮液注射到花内。 (4）整株喷雾接种：孢子悬浮液喷在叶片或茎部 (5)土壤接种法：针对一些土传病菌，如棉花枯、黄萎菌。
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保湿萌芽检验的缺点：
1、在对寄主生长发育不良，而适宜于病菌生长发育的条 件下，则某些腐生菌可能变成萌芽阶段的寄生菌，造成幼 芽发生部分病斑。
2、由于主要还是依靠肉眼检查，多种病害可以产生类似的病症， 就是同一种病害也可发生不同的症状等，这些情况都足以影响检验 结果的准确性。
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第四章 植物病害检疫检验技术
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第一节 植物检疫性真菌常见检疫检验技术
直接检验 比重检验 染色检验 洗涤检验 保湿萌芽检验 分离培养检验
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第三章 动植物检验检疫程序
第二节
检疫申报（报检）
检疫申报，也称报检。是动植物检疫程序中 的必经环节。检疫物在到达前或到达时，货 主或代理人必须及时向检疫机关进行检疫申 报，以利于办理提货手续。
第二节
检疫申报（报检）
一、检疫申报的基本含义
检疫申报(quarantine declaration)：是检疫物输 入或输出时由货主或代理人向检疫机关及时声 明并申请检疫的法律程序。 检疫申报的主要作用：是使检疫人员在接到货 主或代理人递交的报检材料后，为进一步核对 相关单证和实施检疫做好必要准备。 检疫申报是一法定程序，是动植物检疫的必经 环节，由货主或代理人和检疫人员共同完成。
第一节
四、检疫许可的基本手续
检疫许可
科研等需要办理特殊许可主要包括3个步骤： (1)领取单证 引进单位提供有关证明和说明材料后， 到当地口岸动植物检疫机关领取许可证申请表 (2)报请批准 引进单位填写申请表后报国家动植物 检疫机关审批。 (3)批准输入 国家动植物检疫机关根据申请和待批 物进境后的特殊需要和使用方式，填发许可证，标 明批准的数量、检疫要求、进境口岸、许可证有效 期等内容，并委托有关口岸动植物检疫机关核查和 监督使用。
第二节
检疫申报（报检）
二、检疫物范围与报检机关
在进出境动植物检疫中，执行检疫申报任务 的检疫机关主要是各口岸出入境检验检疫局。 货主在输入动植物、动植物产品和其他检疫物 时，应向进境口岸动植物检疫机关报检； 输出动植物、动植物产品和其他检疫物时，应 向出境口岸动植物检疫机关报检； 运输动植物、动植物产品和其他检疫物过境时， 向进境口岸动植物检疫机关报检，出境口岸不 再报检。
第二节
检疫申报（报检）
二、检疫物范围与报检机关
在进出境动植物 检疫中，哪些检 疫物需向动植物 检疫机关进行申 报呢?
植物检疫性病害的检测及防除研究方法技术
• 寄主：外来有害生物有了新的食物（寄主）或易感病寄主， 导致大爆发；
• 人为因素：外来有害生物传入初期由于人们没有看到它的 危害（危害有量变到质变的过程） ，没有引起人们的足 够重视和防治，没有防微杜渐，最后导致大爆发；人们对 外来有害生物危害性认识不足，缺乏对其生物学特性的了 解，缺乏防治的经验和有效的方法和手段或没有及时采取 防治措施，导致外来有害生物的大爆发和危害。
绪论
• 目的：发现、检出和鉴定有害 生物，作为出证或检疫处理的 依据（食品安全，化妆品安全， 疾病控制）
• 方式：现场检查、实验室检验
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一 检疫（QUARANTINE)
• 检疫Quarantine是拉丁语，原意是40。
• 14世纪，欧洲发生了一场非常大的鼠疫流行。当时整个欧 洲流行鼠疫，死亡了2000万人，也就是当时欧洲1/4的人 口因患鼠疫而死掉了。感染了鼠疫的病人先是淋巴结溃烂， 接着是引起肺部的病变，到后期由于缺氧，整个皮肤变黑。 到死的时候，整个人是黑的。 黑死病流行非常广泛，在
• 现在此病已在全国十二个省市、自治区、特别行政区迅速 蔓延。发生面积已超过8万公顷，死亡的寄主树木2000万 株以上，累计给中国造成直接经济损失近50亿元、对社会 和生态等产生的间接损失上百亿元。在重点发生区，部分 林地已退化为荒山，疫区相关农副产品和林产品的流通和 出口也直接受到影响。
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• 为防止松材线虫的传入，中国政府于2000 年1月1日开始对美、日进口的货物木质包 装实施检疫。
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马铃薯晚疫病
1845年，爱尔兰由于从美洲传入马铃薯晚 疫病，导致病害大流行，使马铃薯造受了 毁灭性灾害。当时，仅800万人口的爱尔兰 岛死于饥荒者达20万人，外出逃荒者164万 人。引起了全世界的震惊。这就是有名的 “爱尔兰大饥荒”。
植物检疫技术
如确系该菌，则接种部 位软腐、维管束褐变
生理生化及快速测定法
• • 生化测定试剂盒： Biolog 测定：
噬菌体检测
血清学检测技术
酶联免疫吸附技术
(ELISA)-- 酶联免疫吸
附测定(Enzyme linked immunology assay,
电了显微镜观察
• 目前通常认为运用负染和超薄切片电镜观察能诊 断和鉴别植物病毒，一般可诊断到属的水平。
免疫学检测法
快速免疫滤纸测定法(Rapidimmuno afterpaperassay,RIPA)
免疫胶体金技术 (Immune colloidal gold technique)
分子生物学检测方法
植物寄生线虫的各种分离方法
直接解剖法-- 内 生线虫在体视显
微镜下用解剖针
直接解剖病组织
•
简易贝尔曼漏斗法:分离少量植物材料中有活 动能力的线虫。
清洗材料 收集线虫 切成小段
裹纱布
浸入漏斗12h
• 浅盘法
•
卡勃过筛分离法――本法用于从大量土壤中分离
各类线虫。
检疫性线虫的一般检验程序及注意事项
的检查、可用于病害普查，口岸检 疫和产地检疫等。
间接法
一抗
底物
二抗
免疫荧光技术
分子检测技术
特异性基因或DNA序列用于检测病原菌
核糖体DNA基础的PCR策略
分子检测试剂盒
生物学检测技术
• 鉴别寄主检测--以鉴别寄主反应或指示植物为依 据的方法。
• 曾广泛运用，目前却由于其检测速度慢、受环境 和季节影响较大等诸多因素限制，而运用较少。
第二节 病原细菌的检疫检验技术
植物检疫学试验指导书
《植物有害生物检疫》实验指导书适用专业：动植物检疫、农学王建国，向妙莲，李小珍编写江西农业大学农学院植保系2008年1月目录第一部分室内实验植物检疫实验注意事项实验1 检疫性有害生物鞘翅目一……………………………………………………………实验2 检疫性有害生物鞘翅目二……………………………………………………………实验3 鳞翅目检疫性有害生物………………………………………………………………实验3 鳞翅目检疫性有害生物………………………………………………………………实验5 双翅目检疫性有害生物二……………………………………………………………实验6 同翅目检疫性有害生物………………………………………………………………实验7 其他检疫性有害生物…………………………………………………………………实验8 产地检疫………………………………………………………………………………实验9 洗涤检验………………………………………………………………………………实验10 分离培养检验…………………………………………………………………………实验11 生理生化检验…………………………………………………………………………实验12 染色检验………………………………………………………………………………实验13 噬菌体检验……………………………………………………………………………第二部分教学实习植物有害生物检疫教学实习计划………………………………………………………………《植物有害生物检疫》实验注意事项1、每人准备HB和3H绘图铅笔个一支，橡皮一块，厘米尺和小刀各一把。
《江西农业大学实验报告纸》20病装订成册。
2、实验前，预习实验指导书。
3、显微镜安指定号码使用，用完后复原，经教师检查后，放回原处。
4、实验过程中，必须保持安静，按照实验要求和操作规程，认真进行实验。
5、实验报告要求正确、整洁、清晰，当天课后教师批改（教师指定的日期除外）。
3植物病害检疫检验技术
植物界
真菌界
动物界
原生生物界
原核生物界
病毒界
三、真菌的生活史(life-cycle)
3．多型现象(polymorphism)：许多真菌在整个生活史中可以产生2种或2种以上 的孢子。如锈菌有的可产生5种孢子：性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和 担孢子。
4．单主寄生(autoecism)：多数植物病原真菌在一种寄主植物上就可以完成生 活史。
5．转主寄生(heteroecism)：在真菌的生活史中，有的真菌不同的寄生阶段必 需在两种亲缘关系不同的寄主植物上生活才能完成生活史。无性阶段在一种 植物上寄生，有性阶段在另一种植物上，叫转主寄生。经济价值较大的植物 叫寄主，另一寄主植物叫转主寄主或中间寄主。如梨锈病菌冬孢子和担孢子 产生于桧柏上，性孢子和锈孢子则产生于梨树上，转主寄主为桧柏。
(一) 真菌的无性繁殖
真菌不经过核配和减数分裂，营养体直接以断裂、裂殖、芽 殖和割裂的方式直接产生后代新个体叫无性繁殖。无性繁殖产 生的各种孢子均叫无性孢子。基本特征是营养繁殖，无有性结 合过程。无性孢子多种多样，繁殖能力很强，几天一代，在病 害传播和流行中起重要作用。
真菌无性繁殖的孢子类型
1.游动孢子(Zoospore)：鞭毛菌的无性孢子。单细胞，无细胞壁，只有原生质膜， 在膜是着生1-2根鞭毛，水生可游动。形成于游动孢子囊（Zoosporangium）内，在 菌丝的顶端形成的一种囊状物。
6．大多数真菌的营养体为单倍体，而卵菌的营养体为二倍体。许多锈菌和黑粉 菌营养体长时间为双核单倍体。
植物病原细菌检疫检验技术
梨火疫病 Fire blight of pear
分布：
1878年首先由burrill描述，在纽约发生， 后由Erwin命名，是第一个被确定的植 物细菌病害。主要分布于北美洲于西 北欧，中欧、地中海、东南欧及大洋 州和亚洲也有分布。大约40多个国家。
病原菌： 学名：Erwinia amylovora（Burrill）Winslow 异名： Micrococcus amylovorus Burril Bacillus amylovorus (Burrill) Trevisan Bacterium amylovorus (Burrill) Chester
梨火疫病的地理分布
寄主： 梨火疫病菌寄主范围很广，能为害梨、苹果、山楂、木旬 子、李等４０多个属220多种植物，大部分属蔷薇科
Pomoideae亚科。
危害性： 仁果类果树的一种毁灭性病害。一棵多年生的梨和苹果树 发病后可在几星期内死亡
症状：侵害花、果实、枝条和叶片。 ① 花:侵染后变深褐色，枯萎。
（2）溃疡枯萎：是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新 复活的结果。初症是在复活的溃疡附近的健康树皮组 织上出现窄的水渍状区，几天后，树皮内部组织出现 褐色条斑，随后病菌侵入附近繁殖枝内部并引起萎蔫 死亡。这些枝条特别是嫩枝与下面谈及的枝枯萎有明 显区别，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黄至桔黄色）。
（3）枝枯萎：细菌直接侵入前 1～3叶的枝尖，然后杀 死整个枝条及支持枝。初症是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪 色，象拐杖状。条件适宜时，几天内可移动15～30cm， 造成整枝死亡，病枝、枝皮、叶通常变黑。潮湿时，枝 条上出现菌脓。后期，终芽前出现的枝枯萎一般不会萎 蔫，且仅在枝最上部出现坏死。随着病菌不断深入，并 侵染主干，皮层收缩，下陷，形成溃疡斑。
植物检疫
第四章植物检疫程序现场检验：是检疫人员在现场环境中对植物、植物产品或其他限定的商品进行的直观检查，以确定是否存在有害生物和/或确认是否符合植物检疫法规要求的法定程序。
现场检查的主要方法：肉眼检查、过筛检查、X光机检查和检疫犬检查等。
实验室检测：由检验人员在实验室中借助一定的仪器设备对样品进行深入检查的植物检疫法定程序，以确认有害生物是否存在或鉴别有害生物的种类。
实验室检测常用方法：比重检测、染色检测、洗涤检测、保湿萌芽检测、分离培养与接种检测、噬菌体检测、显微镜检测、血清学检测、鉴别寄主检测、分子鉴定和计算机辅助鉴定等产地检疫：是在植物或产品出境或调运前，输出方的植物检疫人员在其生长期间到原产地进行检验、检测的过程。
预检：是在植物或植物产品入境前，输入方的植物检疫人员在植物生长期间或加工包装时到产地或加工包装场所进行检验、检测的过程。
产地检疫和预检意义①提高检疫结果的准确性；②简化现场检验的手续，加快商品流通；③避免货主的经济损失。
隔离检疫：是将拟引进的植物种子、苗木和其他繁殖材料，在植物检疫机关指定的场所内，在隔离条件下进行试种，在其生长期间进行检验和处理的检疫过程。
第七章危险性植物病原生物真菌1、小麦印度腥黑穗病菌越冬场所：病菌以冬孢子或菌瘿在土壤中、种子表面或粪肥中越冬。
传播途径：远距离传播－冬孢子随种子的调运传播。
近距离传播－病区主要靠带菌土壤传播。
粪便和秸秆也能传病；随气流传播到麦穗上进行侵染。
检测方法①直接镜检法：50克麦种加100ml水，加1滴吐温20，震荡洗涤30分钟，洗涤液通过上铺滤纸的布氏漏斗，用抽气泵抽滤，1%-3%的KOH湿润滤纸，在25-50倍解剖镜下镜检。
②氢氧化钠鉴定法：用0.2%NaOH溶液浸种24h (20℃)。
病粒发病部位乌黑发亮，健康部位灰黄色。
③洗涤检验、冬孢子形态鉴定：同小麦矮化腥黑穗病菌。
④过滤抽提---离心富集技术：分级过筛-α-淀粉酶酶解-蔗糖密度梯度离心对小麦中的孢子富集，进行检测。
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细菌病害
病毒病
病毒内含体形态——风轮状、不规则多边形等
检测病毒内含体 （细胞核/细胞质内）
植物染病后的生理代谢反应
植保素大量累积
病毒病染色原理 蓝 色 多酚物质 + NaOH → 蓝色
植保素之一
显色时间较短 易氧化而成红色
• 【不确定性】凡是植物发生生理损伤的情况，植 物体内均能够大量合成多酚。
B、塑料袋密封检验
塑料袋密封数 小时后，其中的 实蝇幼虫因缺氧 破果而出。
6、害虫的检验方法
C、水盆观察法
将水果或蔬菜放入一个瓷盘内，支放在盛有
清水的大瓷盆上，再用40目尼龙纱罩上。室 温下观察7-10d，实蝇幼虫会从果中弹进大盆 内。本方法主要用于新鲜成熟度不高的水果 。
7、现代生物技术检测手段
4、保湿萌芽检测：检查种子是否带菌
【方法】
• 在实验室条件下，
进行种子发芽试验
• 检测种子萌发阶段
的发病情况
多种培养方法
5、“分离培养+接种鉴定”检测
科赫氏法则 (1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；
——镜检 ——分离纯化 (3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害； ——接种 ——再次镜检鉴定
(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；
(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同。
5、“分离培养+接种鉴定”检测
科赫氏法则的应用
(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；
——镜检
(2)该微生物可在培养基上分离，并得到纯培养
——分离纯化
(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；
保湿萌芽检测
1、比重检测——比重即密度
利用比重原理监测病粒与虫粒。
健康种子
重
生病种子
轻
浮在水面 沉在水底
氯化钠溶液（注意浓度的选择）
适用范围 。
通常用于检查粮谷、谷类中的害虫
2、染色检测
不同种子，选择染色剂的浓度不同
虫蛀
虫蛀
虫蛀
病毒病染色——完全不同于植物病原菌物、病原细菌以及害虫
病原菌物病害
第四章
植物检疫的基本程序
植物检疫的基本环节一、检疫许可 Nhomakorabea二、检疫申报
三、现场检验
四、实验室检测 五、检疫监管
四、实验室检测
指形管
技术性
专业性
鉴定种属以下单元
常用方法
比重检测
染色检测 X光检测 洗涤检测 分离培养与接种试验 噬菌体检测
显微镜检测
血清学检测
分子生物学鉴定
计算机辅助鉴定
3、洗涤检测
【原理】利用离心力，使悬浮液或乳浊液中不同 密度、不同颗粒大小的物质分离开来
不同容积的离心管
• 检查植物材料表面附着的微生物孢子、病原线虫
病原生 物在底 部沉降
病原 生物 悬浮 液
•用无菌水反复冲洗植物材料表面，得 到病原菌物孢子悬浮液
•或直接用少量植物材料浸水，进行高
速离心分离
显微镜下，利用血球计数法测孢子数量
• 血清学检测 • PCR检测 • 计算机辅助鉴定：PCR技术和计算机技术结 合。
8、实验室的远程鉴定系统
• 利用计算机网络技术，开展远程鉴定，在无 需寄送标本情况下，充分发挥中心实验室和 国内外专家的作用。 • 2008年江苏省出入境检验检疫局实验室与南 京林业大学合作，开发了“有害生物远程鉴 定与植检实验室管理系统”，通过网络把专 家和实验室连接起来开展工作。
——接种 A B
(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同。
A
B
——再次镜检鉴定
镜检
A
分离纯化
孢子
镜 检
B
A与B是同一种微生物，且
是该植物病害的致病微生物
6、害虫的检验方法
A、饲养检验 将样品定量后置
温箱内，定温在25～26℃下
饲养3～5d或更长时间，测定 害虫含量并鉴定种类。