2010年版中国药典微生物培训培养基的配制及质量控制
014-2010版中国药典培训回答(第1部分：培养基配制)-1
2010版中国药典培训回答（第1部分：培养基配制）广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1.含琼脂培养基冷却至25℃后已凝固，如何测定其pH？答：有专门的固体培养基pH计，如Radiometer A /S, DK22400 Copen2 hagen NV, Denmark 或者Microelectrodes Inc1, NH 03053,U1S1A1 。
".2..PH计测培养基的PH好像有比较大的差别，应如何选择PH计？（效价7.8的培养基我用普通理化室的PH计测定只有7.0左右，不知道是否因为在高温下测定（含琼脂）答：培养基应冷却到20℃～25℃才可测量，另外PH计应按时校准。
3.生物指示剂对灭菌设备的性能，灭菌程序的验证是只验证一次呢，而后进行定期验证，如果生物指示剂换批号，是否要重新验证？答：应定期或不定期验证一次，确保灭菌设备正常。
生物指示剂更换批号，不需重新验证。
4..紫外线灭菌后，需要多久进去操作？答：打开通风净化设备，半小时后可入内操作。
5.孟加拉培养基是否可以取代玫瑰红钠琼脂进行培养霉菌和酵母菌？答：根据中国药典，采用玫瑰红钠琼脂。
6.配制PH值7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液时有时因为高压灭菌器灭菌过程温度过高而导致培养基混浊了，这种情况缓冲液还能用吗？答：建议按正常温度灭菌，混浊培养基建议不要使用。
7.培养基在冷藏中形成结晶怎么处理？①销毁②加热再用③待冷却完用。
答：建议不要使用8.融化的培养基为什么不能再冷水中冷却？答：防止受热不均引起结块9.取菌后测PH：（25℃）培养基配制好测PH，取其中一瓶测PH，那这一瓶测完就不能用了，污染了。
答：也可在无菌条件下取出适量测pH.10.配制分装过程中能否使用不锈钢锅？答：我实验室使用不锈钢锅，目前未发现异常。
11. 对新购进无菌0.9%氯化钠（500ml）能否再次灭菌？答：能。
但包装完好，购入时间较短的无需灭菌。
2010药典微生物
中国医学菌种保藏中心提供的标准菌株
美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株
法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株（Bioball)
低温冷冻保藏的标准储备菌株
低温蜡封保藏的标准储备菌株
我所制备的工作菌株
• 中国药典2010年版
– 在方法的附录中对菌种的规定同2005年版 – 在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种 有了较为明确的规定 • 允许使用标准菌株和商业派生菌株 • 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 • 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 • 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超 低温冷冻保藏的方法 • 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作 菌株 • 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 • 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作 工作菌株
针对鉴别培养基
1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查 ——指示能力检查 液体培养基指示能力检查： 分别接种不大于100cfu 的试验菌于 被检培养基和对照培养基中，在相应控制 菌检查规定的培养温度及最短培养时间下 培养。与对照培养基管比较，被检培养基 管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对 照培养基一致。
1.2.3 控制菌检查用培养基适用性检查 ——指示能力检查
固体培养基指示能力检查： 取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu） 分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上， 在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培 养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大 小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。
• 作用特点：没有组织器官的选择性 • • 肌体发热，腹泻，出血性休克或其他组织损伤 不能经甲醛脱毒
2、菌落（colony）：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适 宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼
药品微生物实验室规范指导原则
测实验室质量控制规范（征求意见稿）》 《药品微生物学检验技术 》
整理课件
无菌/微生物限度检查理念
环境保证
培养基保证ຫໍສະໝຸດ 无菌性检查 灵敏度检查SOP操作
有效的方法
方法验证
有效的结果 可靠的结论
结果判断
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污染微生物的来源
人员
原料 环境
对所有人员的培训、考核内容和结果均应记录。
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二、培养基 培养基是绝大多数微生物试验的基础。
因此，培养基的质量是微生物试验成功与 否的关键因素。适宜的培养基制备方法、 贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养 基的保证。
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⑴培养基的制备： 可按处方制备也可使用按处方生产的 符合规定的商品化成品培养基，脱水培养 基除附有处方和使用说明外还应注明有效 期、贮存条件、适用性试验的质控菌株和 用途。配制时应按使用说明上的要求操作， 受潮结块不能使用，以确保培养基的质量 符合要求。
洁净实验条件的维护、验证
阳性菌实验室达到P2生物安全标准
整理课件
整理课件
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药品微生物实验室规范指导原则用于指导 药品微生物检验实验室的质量控制。
药品微生物的检验结果受到很多因素的影 响，如实验人员在取样或试验过程中可能引入 了污染微生物；微生物学分析方法本身的误差 较大；样品中或环境中微生物可能分布不均匀 等因素均影响药品微生物实验结果。因此，在 药品检验中，为保证微生物试验数据的可靠性 和重现性，药品微生物实验室必须使用经验证 的检测方法并按良好的实验室规范指导试验。
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配制培养基使用的容器应是玻璃器皿或搪 瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角烧瓶、刻 度吸管、试管、培养皿等。洗净，用蒸馏水冲 净，烘干后方可使用。禁用金属容器如铁、铜、 铝容器，避免金属离子与培养基成分结合，生 成有害物质，影响细菌生长。
2010版中国药典培训回答（第2部分：微生物限度）
2010版中国药典培训回答（第2部分：微生物限度）2010版中国药典培训回答（第2部分：微生物限度）广东省药检所对《中国药典》2010版微生物专题培训班的有关问题解答答案。
1、微生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。
答：没有上限。
但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。
按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。
（本所控制在110%以内）。
2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作培养过程中发现：在玫瑰红钠琼脂培养生长的白色念珠菌的形态太小与营养琼脂上培养的细菌的某些形态大小相同，这样如何判断营养琼脂上生长的菌落是否是白色念珠菌？为何这两种菌落形态相似？答：菌落形态相似不等于就是同一种菌。
在验证时，营养琼脂的验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，如果本底菌为0，则营养琼脂上长的菌应该不是白色念珠菌。
要判断是否为白色念珠菌，应进行白色念珠菌的相应鉴定方法后才能确定。
任何微生物都不可能只是从菌落就可以进行判断，只能判断为疑似，然后再做一系列相应的鉴定实验后才能进行判断。
3、生孢梭菌的适宜计数用培养基？（很多验证需对生孢梭菌进行计数）答：最简便的方法是用硫乙醇酸盐流体培养基。
该培养基上层为含氧层，适宜需氧菌生长，下层为厌氧层（下层高度最好7cm以上），适宜厌氧菌生长。
在培养16~18小时这个时间进行观察，计数，超过20小时,由于繁殖量大，培养基将混浊，点计不清。
或者是用哥伦比亚琼脂培养基，浇注后，置厌氧罐（袋）里，再置培养箱培养，计数。
4、微生物限度检查法中所用的培养基要进行适用性检查试验，请问这些培养基还需要做无菌检查试验吗？答：微生物限度检查，药典上没有特别说明对培养基作无菌性检查，但每次都要做阴性对照实验，阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。
GMP(2010年修订)培训第10、11、13章
GMP（2010年修订）——质量控制实验室管理
第二百二十六条 试剂、试液、培养基和检定菌的管理应当至少符合以 下要求： （一）试剂和培养基应当从可靠的供应商处采购，必要时应当对供应商 进行评估； （二）应当有接收试剂、试液、培养基的记录，必要时，应当在试剂、 试液、培养基的容器上标注接收日期； （三）应当按照相关规定或使用说明配制、贮存和使用试剂、试液和培 养基。特殊情况下，在接收或使用前，还应当对试剂进行鉴别或其他检 验； （四）试液和已配制的培养基应当标注配制批号、配制日期和配制人员 姓名，并有配制（包括灭菌）记录。不稳定的试剂、试液和培养基应当 标注有效期及特殊贮存条件。标准液、滴定液还应当标注最后一次标化 的日期和校正因子，并有标化记录；
GMP（2010年修订）——持续稳定性考察
第二百三十五条 考察批次数和检验频次应当能够获得足够的数据， 以供趋势分析。通常情况下，每种规格、每种内包装形式的药品， 至少每年应当考察一个批次，除非当年没有生产。
第二百三十六条 某些情况下，持续稳定性考察中应当额外增加批次 数，如重大变更或生产和包装有重大偏差的药品应当列入稳定性 考察。此外，重新加工、返工或回收的批次，也应当考虑列入考 察，除非已经过验证和稳定性考察。
GMP（2010年修订）——质量控制实验室管理
第二百二十七条 标准品或对照品的管理应当至少符合以下要求： （一）标准品或对照品应当按照规定贮存和使用； （二）标准品或对照品应当有适当的标识，内容至少包括名称、批号、 制备日期（如有）、有效期（如有）、首次开启日期、含量或效价、贮 存条件； （三）企业如需自制工作标准品或对照品，应当建立工作标准品或对照 品的质量标准以及制备、鉴别、检验、批准和贮存的操作规程，每批工 作标准品或对照品应当用法定标准品或对照品进行标化，并确定有效期， 还应当通过定期标化证明工作标准品或对照品的效价或含量在有效期内 保持稳定。标化的过程和结果应当有相应的记录。
培养基质量控制
培养基质量控制引言概述：培养基质量控制是微生物实验室中至关重要的一环。
它涉及到培养基的制备、质量检测、贮存等多个方面。
良好的培养基质量控制能够确保实验结果的准确性和可重复性。
本文将从培养基制备、质量检测、贮存、使用和记录等五个大点详细阐述培养基质量控制的重要性和方法。
正文内容：1. 培养基制备1.1 选择适当的配方：根据实验需求选择合适的培养基配方，包括碳源、氮源、无机盐、维生素等成分。
1.2 精确称量：使用精密天平进行精确称量，确保每个成分的比例准确。
1.3 溶解和调节pH：将成分溶解在适当的溶剂中，并使用pH计调节溶液的pH 值至理想范围。
1.4 灭菌：使用高温高压灭菌器或滤器对培养基进行灭菌，以杀灭其中的细菌、真菌和病毒。
2. 培养基质量检测2.1 pH值测定：使用pH计测定培养基的pH值，确保其在理想范围内，以维持微生物生长的最佳条件。
2.2 渗透压测定：使用渗透计测定培养基的渗透压，确保其与微生物细胞内外的渗透压相适应。
2.3 灭菌效果检测：将一部分培养基接种不同的微生物，观察其生长情况，以确认培养基的灭菌效果。
2.4 营养成分检测：使用化学分析方法检测培养基中各种营养成分的浓度，确保其满足微生物生长的需求。
3. 培养基贮存3.1 适当的温度：将培养基贮存于适当的温度下，通常为4℃，以防止其中微生物的生长和培养基成分的分解。
3.2 防止污染：使用无菌技术操作，避免培养基受到外界细菌和真菌的污染。
3.3 包装密封：将培养基装入无菌试管或瓶中，并严密封闭，以防止湿气和细菌的进入。
4. 培养基使用4.1 培养条件控制：根据不同微生物的生长要求，控制培养基的温度、湿度、光照等条件。
4.2 培养时间控制：根据微生物的生长速度和实验需求，控制培养时间，以获取适当的菌落数量。
4.3 培养方法标准化：制定培养方法的标准操作规程，确保每次实验的培养条件和操作步骤一致。
5. 培养基记录5.1 培养基配方记录：详细记录每个培养基的配方，包括成分名称、质量和比例等信息。
02 2010年版《中国药典》微生物检查法
乳糖发酵培养基 曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂 沙门菌 营养肉汤 四硫磺酸钠亮绿培养基
促生长能力+指示能力 促生长能力+指示能力 促生长能力 促生长能力 抑制能力
胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂
促生长能力+指示能力
曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂
铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基
促生长能力+指示能力
促生长能力 抑制能力
21
抑制能力 21 促生长能力+指示能力
三、白色念珠菌的检查
取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少 于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48 小时。取上述培养物划 线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72 小时）。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光 滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。 若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检 出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑 选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时（必要 时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出 白色念珠菌。 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉 米琼脂培养基上，培养24～48小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。 芽管试验 挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载 玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3h，置显微镜下观 察，可见到由孢子长出短小芽管。 若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品 未检出白色念珠菌。
2010年版药典微生物限度检查法
附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。