黄曲霉毒素测定法操作规程
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。
它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。
因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。
国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。
1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。
样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。
样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。
2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。
提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。
一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。
3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。
对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。
检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。
其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。
该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。
总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。
黄曲霉毒素的测定(精)
取20.00mL甲醇水溶液臵于另一125mL分液漏斗 中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静臵分层， 如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出 三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿 润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于 50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗 中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发 皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并 于蒸发皿中。
再用双向展开法展开后，观察样液是否产生与AFTB1标准点重叠
的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。若样 液AFTB1含量较高时，则将样液稀释后，按单向展开法中(4)做确 认试验 .
(5)稀释定量：
若样液中AFTBl含量较高，可按单向展开法中(5)稀释定量操作。 若AFTB1含量较低，稀释倍数小，在定量的纵向展开板上仍有杂质 干扰，影响结果判断，可将样液再做双向展开法测定，以确定含量。 3.2.3 结果计算
(2)展开：
a．横向展开：在展开槽内的长边臵一玻璃支架，加10mL无水 乙醇，将上述点好的薄层板靠标准点的长边，臵于展开槽内展开， 展至板端后，取出挥干。根据情况，需要时，可再重复l～2次。 b．纵向展开：挥干的薄层板以丙酮一三氯甲烷(8：92)展开至 10～12cm为止。丙酮与氯甲烷的比例，根据不同条件自行调节。
黄曲霉毒素属剧毒物质，其毒性比氰化 钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。 其中AFT B1的毒性和致癌性最强，帮其 在食品中允许量各国都有严格规定。 AFT主要污染粮油及其制品，如花生、 花生油、玉米、大米、棉籽等被污染严 重。Biblioteka 曲霉毒素允许量标准
食品品种 允许量标准（ppb或10-6） 玉米、花生、花生油 ≤20 玉米及花生制品 ≤20 大米、其他食用油 ≤10 裱花蛋糕、饼干、面包≤5 婴儿代乳食品 不得检出
黄曲霉毒素B1试剂盒操作流程图
该操作是根据江苏省苏微微生物产品应用编制的，具体使用请参照产品附带说明书！黄曲霉毒素B1操作流程示意图
1.
；
2.1‐6号孔分别按次序由小到大加入浓度为0‐‐2ppb 标准品溶液各50ul ，剩余孔从7号开始分别加入要测定的样品的稀释液；然后从1号开始的所有孔分别加入50ul 稀释后的酶标抗原溶液，加盖后放入37℃培养箱，进行30分钟温育；
3.孵育完成后，倒掉孔内所有试剂，每孔加入约250ul 洗涤液，洗板5次；
4.5次洗板后拍干酶标孔（拍干后残留的气泡可用吸头戳破），按照先后顺序，所有孔先加入50ul 底物a ，然后所有孔再加入50ul 底物b ，加盖后放入37℃培养箱，进行15分钟温育；
显色反应后每个孔基本都会呈现出不同程度的蓝色，肉眼能明显的看到1‐6号孔的蓝色是由深到浅的（毒素含量越低，蓝色越深；反之亦然。
），样品孔则由于毒素含量的不同，呈现出
显色示意图
5.显色反应完成后，在每个孔中加入50ul 的终止液，蓝色变成黄色，混匀后上450nm 波长的酶标仪读取吸光度值。
黄曲霉毒素检验方法
一、目的规范实验室检验方法。
二、内容（一）试验准备1、标定荧光计。
（1）、将仪器后的电源开关打开。
（2）、按SELECTTEST键，直至显示出AflaTest，按ENTER。
（3）、荧光计显示：START CALBRATION…OPEN THE LIDINSERT RED VIAL打开仪器盖，将红色的真菌毒素标定管放入。
一定要确认标定管是否已放到了仪器的底部。
（4）、仪器显示：HIGHCAL 22PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值，请按ENTER键。
否则，从键盘上所规定的设定值，确认准确无误后，按ENTER键。
（5）、仪器显示：READING HIGH CAL…SA VING HIGH INENSTTYOPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出红色的标定管，插入绿色的真菌毒素标定管。
一定要确认标定管是否已充分插入仪器的底部。
（6）、仪器显示：LOW CAL 1.0PPB如果这个值正好是所选分析方法规定的设定值,请按ENTER键.否则,从键盘上所规定的设定值,确认准确无误后,按ENTER键。
（7）、仪器显示：READING LIW CAL…SA VING HIGH INTENSITJY 接着显示：OPEN THE LIDINSERT GREEN VIAL打开仪器盖取出绿色的标定管。
（8）、仪器显示：VICAM V1.3 READY按SELECT TEST键,仪器显示: AFLATEST, 按ENTER键。
（9）、仪器显示：START RUN TEST OPEN THE LID （10）、插入黄色的真菌毒素标定管，其读数应该在分析方法的测定范围内。
（11）、荧光屏计标定工作完毕，可经进行样品分析了。
荧光计每周需要标定一次。
如果需要重新标定，请按STOP键，再按OPIONS 键，直至仪器显示：CALIBRATE TEST然后按ENTER键，仪器显示：AFLATEST如果不是这样，按SELECT TEST键，直至仪器显示：AFLATEST，按ENTER键。
黄曲霉毒素AFB1检测操作规程
黄曲霉毒素AFB1检测操作规程1 原理AgraQuant® 黄曲霉毒素检测试剂盒应用固相直接竞争酶联免疫吸附原理，用70%甲醇从研磨样品中提取黄曲霉毒素。
样品提取液或黄曲霉毒素标准品与酶-黄曲霉毒素偶合物混匀后加入到抗体包被的微孔中，样品中的黄曲霉毒素或黄曲霉毒素标准品与酶-黄曲霉毒素偶合物中的黄曲霉毒素竞争结合微孔中的特异抗体。
经过洗板去除未参加抗原-抗体反应的的黄曲霉毒素，当酶的底物被加入到微孔中，颜色变为蓝色，且颜色深浅与样品中或标准品中黄曲霉毒素含量成反比。
加入反应终止液终止反应后，反应液颜色应由蓝色转为黄色。
在450nm(OD450)滤镜及630nm示差滤镜下使用酶标仪对微孔板进行吸光度值测量。
利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品的吸光度值与标准品的吸光度值进行比较以进行结果的判读。
2 试剂与仪器2.1 单道移液枪（量程：0~200μL、0~1000μL）2.2 八道移液枪（量程：0~300μL）2.3 定时器2.4 吸水纸2.5 试剂槽3个2.6 仪器：酶标仪3 操作步骤3.1样品的准备/萃取3.1.1获取具有代表性的样品，使用研磨机研磨，使至少95%的研磨样品能够通过20目筛网，彻底混合并对样品进行二次取样。
3.1.2称取20g 研磨样品于干净并可密封的广口瓶中。
3.1.3加入100mL 70/30（v/v）甲醇/水萃取溶液并密封广口瓶。
注意：样品与萃取溶液比例应为1:5（w:v）。
3.1.4摇床上振荡混合10分钟。
3.1.5静置样品，用双层滤纸过滤萃取上清液，收集待检滤液（滤液必须澄清）。
3.1.6用提供的分析缓冲液对滤液进行1:2稀释。
例如：将100µL待检滤液加入100µL分析缓冲液中，混匀准备进行随后实验。
3.2 检测步骤3.2.1将绿色的稀释孔条放入微孔板架上，稀释条孔的数目需使每个标准品（0, 2, 5, 20 & 50ppb）或样品能够对应一个稀释孔。
3食品中黄曲霉毒素测定黄曲霉毒素是一组化学结构类似
。
3.1.2 仪器和试剂
(1)仪器 小型粉碎机、样筛、电动振荡器、玻璃浓缩器、玻璃板 5cm×20cm、薄层板涂布器、展开槽(25cm×6cm×4cm)、紫外光灯 100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2)试剂
③确证试验 为确认薄层样上样液荧光系由黄曲霉毒素B1产生的，加滴三氟乙 酸，产生AFTB1的衍生物，展开后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄层板左边依 次滴加两个点。
第一点：10uL 0．04ug／mL AFTBl标准使用液。 第二点：20／μL样液于以上 两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min(板上温 度不高于40℃)，再于薄层板上滴加以下两点。
(3)测定
①单向展开法
a．薄板制备：称取3g硅胶G，加2～3倍量的水，研磨1～2min呈糊状后，倒人 涂布器推成5cm×20cm，厚度约0.25mm的薄层板3块。在空气中干燥15min，在 100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可 再活化后使用。
b．点样：将薄板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm的基线上用微量 注射器或血红素吸管滴加样液。一块板可滴加4个点，点距边缘和点间距为lcm， 点直径约3mm，在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吸 边加。滴加样式如下：
④黄曲霉毒素B：标准使用液：
I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容 量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。
Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。。
⑤次氯酸钠溶液(消毒用)：取100g漂白粉，加入500mL水，搅 拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中 。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g／L。污 染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。
黄曲霉毒素测定仪安全操作及保养规程
黄曲霉毒素测定仪安全操作及保养规程前言黄曲霉毒素测定仪是一种现代化、高精度的仪器设备，广泛应用于农业、食品、药品等领域中。
在使用该仪器时，需要严格遵守安全操作规程和仪器保养要求，以确保测定结果准确稳定，同时保障工作人员和设备的安全。
本文将详细介绍黄曲霉毒素测定仪的安全操作规程及保养要求，以便广大用户能够更好地掌握和运用黄曲霉毒素测定仪进行工作。
安全操作规程1. 仪器使用前的准备工作在使用黄曲霉毒素测定仪之前，应该对仪器进行充分的洗消、消毒和清洁，保证仪器表面干净无尘，避免在操作过程中可能带入其他杂质，影响结果的准确性。
2. 使用防护设备在进行黄曲霉毒素的测定时，应该使用防护手套、口罩、防护镜等防护设备，以确保在操作过程中不会受到残留毒素的危害。
3. 仪器的安装和操作在安装和操作过程中，需要仔细阅读说明书，并严格按照说明进行操作。
特别是在安装黄曲霉毒素测定仪的时候，需注意电源线的接线是否正确，是否符合规范，以避免电气危险。
4. 样品处理和试剂处理在样品处理和试剂处理过程中，需要遵守礼仪、化学实验室安全专业规程，并配备有足够的个人防护设备。
特别是在处理含有有机溶剂、强酸、强碱的试剂时，需要严格按照规范进行操作，以免发生危险。
5. 仪器存放和保养当使用结束后，需要对仪器进行清洗、消毒，以避免仪器内部产生死角，影响下次的使用。
在存放时，需要确保仪器放置在干燥、通风、阴凉的地方。
保养要求1. 定期清洗检查在使用黄曲霉毒素测定仪的过程中，需要定期对仪器进行清洗和检查，以确保仪器的正常运转。
特别是在使用过程中，需注意对仪器表面、仪器内部、试剂瓶口等部分进行清洗，去除污物、尘土等杂质，避免可能对测定结果造成影响。
2. 维护冷却系统黄曲霉毒素测定仪的关键部分即反应体中的显色试剂需要保持在一个恒定温度下才能正常运行。
因此，维护冷却系统就显得非常重要。
需注意定期更换冷却系统的冷却液，清洗冷却系统内部的水路。
3. 更换试剂由于试剂在实验过程中不断消耗，因此，应该在必要时及时更换试剂，以确保测定的准确性。
黄曲霉毒素M1操作规程
黄曲霉毒素M1操作规程一、样品的前处理将适量的液态奶于12000r/min下离心10min,取下层奶样直接检测即可。
二、溶液的配制1、标品稀释液：用去离子水将AFM1浓缩标品稀释液按1：3体积比进行稀释，即1份AFM1浓缩标品稀释液加3份去离子水。
用于提取样本的稀释，标品稀释液在4℃环境可保存一个月。
2、洗涤工作液：用去离子水将浓缩洗涤液（10×）按1:9体积比进行稀释，即1份浓缩洗涤液（10×）加9份去离子水。
用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月3、6个不同浓度的标准液：取6个1.5ml离心管，标为1到6号，分别加入995μl,400μl, 400μl,400μl, 400μl, 400μl标品稀释液,按照下表配制标准品。
如取5μl高浓度黄曲霉毒素M1标准品（810ppb）加入1号管，与995μl标品稀释液混匀，制备成4.05ppb黄曲霉毒素M1标准液。
取200μl配好的4.05ppb黄曲霉毒素M1标准液，加入2号管，与400μl标品稀释液混匀，制备成1.35ppb黄曲霉毒素M1标准液。
取200μl配好的1.35ppb黄曲霉毒素M1标准液，加入3号管，与400μl标品稀释液混匀，制备成0.45ppb黄曲霉毒素M1标准液。
依次稀释，制备成1.35ppb、0.45ppb、0.15ppb、0.05ppb、0ppb的标准液，（见下表）。
标准品现配现用。
配制好的标准液请在一周内用完（4℃存放）。
三、检测步骤1.、测前须知：（1）、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20~25℃）。
（2）、使用之后立即将所有试剂放回2~8℃。
（3）、黄曲霉毒素M1可致癌，应戴手套操作。
2、操作步骤：（1）、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20~25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。
（2）、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2~8℃。
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分发部门：质量部、中心化验室
生效日期：年月日
黄曲霉毒素测定法操作规程
1目的
通过制定黄曲霉毒素测定法操作规程，以确保检验的准确性。
2适用范围
适用于中心化验室所有的高效液相色谱法-柱后衍生法对药品的黄曲霉毒素测定。
3职责
必须由经过相应知识培训的QC人员方可进行黄曲霉毒素测定法的操作。
4文件内容
4.1简述
黄曲霉毒素可以由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉4种真菌产生，是一组化学结构类似的二呋喃香豆素的衍生化合物。
中药在贮藏、制备、运输过程中如保存不当有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。
黄曲霉毒素是目前世界上已知的毒性最强电话化合物之一，其致癌性肯定。
对中药中黄曲霉毒素残留量进行严格控制对保证用药安全具有重要意义。
本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相色谱分离，柱后衍生-荧光检测器检测进行分析测定。
用于测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2总量计）。
4.2仪器及用具
4.2.1 高速匀浆器
4.2.2 高效液相色谱仪，配荧光检测器（具360nm激发波长和大于420nm发射波长）
4.2.3 柱后衍生系统（碘衍生系统或光化学衍生系统）
4.2.4 离心机
4.2.5 超纯水处理系统
4.2.6 超声波提取器
4.2.7 固相萃取装置
4.2.8 离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。
4.3试药与试液
4.3.1 甲醇、乙腈均为色谱纯。
4.3.2 水为超纯水
4.3.3 黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，标示浓度分别为1.0µg/ml、0.3µg/ml、1.0µg/ml、
0.3µg/ml）
4.3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解用水稀释至1000ml即得。
4.4色谱条件及系统适用性试验
4.4.1 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40:18:42）为流动相；柱温：40℃；采用柱后
衍生法检测（分为碘衍生法和光化学衍生法）；以荧光检测器检测，激发波长λem=360nm(或365nm)，发射波长λex=450nm。
两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。
4.4.2 碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液，衍生化泵流速为每分钟0.3ml，衍生化温度70℃。
4.4.3 光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）
4.5操作方法
4.5.1混合对照品溶液的制备
精密量取黄曲霉毒素混合对照品1支（规格1.0ml/瓶），小心转移至20ml量瓶中，并用甲醇少量多次冲洗对照品瓶，洗液并入量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液（储备液黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，浓度分别为0.05µg/ml、0.015µg/ml、0.05µg/ml、0.015µg/ml）。
精密吸取储备液1ml，置25ml 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
4.5.2 供试品溶液的制备
取供试品粉末（过二号筛）约15g（除另有规定外），精密称定，加入氯化钠3g，置于锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟）（或超声处理20min），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲和柱，流速约每分钟3ml，用水20ml 洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品制备两份平行样品。
4.5.3 测定法：分别精密量取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，每个
进样量重复进样两次，测定峰面积，以峰面积平均值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。
另精密量取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，每份供试品溶液重复进样两次，测定峰面积并
计算平均值，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。
4.5.4 随行回收率：取供试品粉末（过二号筛）约15g（除另有规定外），加入与供试品黄曲霉毒素B1最
高限量等量的对照品溶液储备液（如陈皮供试品黄曲霉毒素B1限量为不大于5μg/kg，供试品取样量为5g，则加入黄曲霉毒素混合对照溶液储备液的量以黄曲霉毒素B1计为0.5ml），混匀挥干溶剂后，按
4.5.2供试品溶液的制备方法制备随行回收率测试样品，随行回收率结果范围参照章节4.6.5。
4.6注意事项
4.6.1 本实验应具有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。
4.6.2 残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装10%次氯酸钠溶液）内，浸
泡24小时以上，再用清水江玻璃器皿清洗干净。
实验室废液也需加入次氯酸钠进行处理。
4.6.3 紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性，所以混合黄曲霉毒素对照品贮备液应配制在棕色容量
瓶中，并避光保存。
黄曲霉毒素对照品溶液则需临用新配，并注意避光。
4.6.4 当供试品溶液进样量超过20μl时，为包装获得良好的色谱峰峰形，供试品制备中最后可用水稀释至
刻度。
4.6.5 随行回收率：加标浓度＜1.0μg/kg，回收率应在50%～120%；加标浓度1μg/kg～10μg/kg，回收率
应在70%～110%
5参考文献
中国药典2010年版第二增补本
中国药品检验标准操作规范
6相关文件
GWQ1-700-022.00 高效液相色谱法操作规程
7附录
NA
8附件
NA。