免疫细胞化学(24 well)
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学
免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法：简便、快速，用特异性标记荧光 的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗； 石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上， 湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。 (4)pH9.0甘油缓冲液〔磷酸盐〕封片。 〔必需无自发荧光，无色透亮 〕
▪ 2、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体 反响，避开了共价结合，爱护了酶和抗体 的活性。
标记酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被 光镜或电镜观看。
★ 酶反响产物须稳定，不集中，具有 良好定位。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
标本的固定与保存
好的固定剂除能满足一般组织学固定目 的外，还需要： 〔1〕能快速固定抗原 〔2〕防止抗原物质集中 〔3〕固定后的抗原能被抗体识别，不影响 抗原抗体反响
▪ 常用：10%福尔马林〔酸性〕、乙醇、丙酮、 甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛
▪ 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘 酸-赖氨酸-多聚甲醛〔PLP〕固定液
免疫组织化学
把握内容
▪ 免疫组化的根本原理 ▪ 免疫组化的根本过程 ▪ 免疫组化的染色技术分类 ▪ 常用的免疫组化的染色原理和方法 ▪ 留意事项
免疫组织化学的根本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化 学的分支，它是用免疫学原理〔特 异的抗原抗体反响〕来对组织内抗 原〔或抗体〕的分布进展原位检测
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC）定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
免疫组织化学
某些癌的早期转移有时与淋巴结内窦性组织细胞增生不易区别。用常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤细胞或几个细胞是不可能的，而采用免疫组化方法（如用上皮性标志）则十分有助于微小（癌）转移灶的发现。对转移性肿瘤也可借助免疫组化标志寻找原发瘤，如骨组织内有前列腺特异性抗原阳性细胞，提示前列腺癌转移。
（十）寻找感染病因
人体疾病的致病微生物中有的在常规病理检查中不易发现，尤其是病毒性致病微生物，由于其分子水平的结构，在细胞水平上难以发现，通过免疫组化方法则可明确发现病原体抗原部位以及定量，如巨细胞病毒（CMV）、人乳头状瘤病毒（HPV）、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）等，已有商品化标志物帮助解决病因诊断问题。
2 免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组织化学 考试重点
2012年周未班复习要点第一部分名词解释1、IHC 免疫组织化学(Immunohistochemistry;IHC)或称免疫细胞化学(ICC)是根据特异性抗原抗体反应的原理来定位组织或细胞内的抗原或抗体成分。
2、CB 柠檬酸缓冲液（0.01mol/L pH6.0,CB）,主要用于免疫组织化学抗原修复的缓冲液。
3、AR 抗原修复(antigen retrieval;AR)是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复，可以提高抗原抗体阳性检测率的方法。
4、TBS Tris-HCI缓冲液,常用浓度为0.02M,pH7.8 主耍用于IHC的冲洗和底物溶液的配制。
5、PBS 为0.01mol/L,pH7.4磷酸盐缓冲液,主耍用于免疫组织化学的洗涤。
6、酶消化酶消化主耍用于IHC前暴露抗原决定簇,有利于抗原抗体的检测,提高阳性检测率的方法。
7、抗原决定簇抗原决定簇（antigenic determinant）又称抗原表位（epitope），是可与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是决定和控制抗原特异性的特殊化学基因。
8、基因工程抗体基因工程抗体又称重组技术，它是在充分认识Ig基因结构与功能基础上，应用DNA重组技术和蛋白质工程技术，按照客观需求在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成的新型抗体分子。
9、功能性决定簇在一个具有三维空间结构的天然蛋白质抗原分子中,由于存在于抗原分子表面的抗原决定簇易被免疫细胞所识别,故此称为功能性决定簇。
10、单克隆抗体单克隆抗体是通过细胞融合技术使小鼠脾免疫细胞与小鼠骨髓瘤细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，在体外培养的条件下分泌产生的针对单一抗原决定簇,由单个B淋巴细胞增殖而形成的细胞纯系产生的抗体。
11、多克隆抗体多克隆抗体(polyclonal antibodies,PcAb)为免疫动物的全血清(抗血清)含有多个抗原决定簇。
12、隐蔽性抗原决定簇抗原决定簇则被抗原分子本身包绕掩盖在内部，正常情况下不能被免疫细胞所识别，称此为隐蔽性抗原决定簇。
《免疫组织化学病理诊断(第2版)》读书笔记模板
第二十五章神经系统疾病
第一节星形细胞肿瘤 第二节少突胶质细胞肿瘤和混合型胶质瘤 第三节室管膜肿瘤 第四节脉络丛肿瘤 第五节起源不定的神经上皮肿瘤 第六节神经元和混合性神经元-胶质瘤 第七节松果体主质细胞肿瘤 第八节胚胎性肿瘤 第九节颅神经和外周神经肿瘤
第二十六章免疫组织化学在来源不明转移性肿瘤鉴别诊断中的应用
06
第十章免疫 电镜技术
05
第九章免疫 细胞化学在 细胞病理学 中的应用
第一章免疫组织化学的概念、特点及发展
第一节免疫组织化学的概念 第二节免疫组织化学的特点 第三节免疫组织化学的发展
第二章抗体基础知识
第一节抗体与抗原的关系 第二节抗体结构 第三节抗体的来源 第四节抗体标记 笫五节抗体的特性
第三章细胞和组织的处理与抗原修复
第十九章肝脏和肝内胆管系统肿瘤
第一节肝脏肿瘤常用免疫组化诊断及鉴别诊断标记物 第二节肝脏良性肿瘤的免疫组化诊断及鉴别诊断 第三节肝脏恶性肿瘤的免疫组化诊断及鉴别诊断 第四节肝脏杂类病变的免疫组化诊断及鉴别诊断
第二十章胰腺疾病
第一节胰腺外分泌系统病变的免疫组化鉴别诊断 第二节胰腺内分泌肿瘤的免疫组化鉴别诊断
第十三章皮肤与黑色素肿瘤
第一节黑色素细胞肿瘤 第二节皮肤淋巴与组织细胞肿瘤 第三节表皮与皮肤附属器肿瘤 第四节皮肤软组织肿瘤
第十四章眼、耳、鼻、咽喉、口腔及颈部肿瘤
第一节眼部肿瘤 第二节耳肿瘤 第三节鼻腔、鼻窦和鼻咽肿瘤 第四节喉和气管肿瘤 第五节唾液腺肿瘤 第六节口腔和颌骨肿瘤 第七节颈部肿瘤
第二十四章乳腺疾病
第一节乳腺疾病鉴别诊断常用的标记物 第二节普通导管增生与导管原位癌的鉴别 第三节导管癌与小叶癌的鉴别 第四节乳腺微浸润癌的鉴别 第五节乳腺增生性病变与原位癌/浸润性癌的鉴别 第六节泡沫状组织细胞样癌和泡沫状组织细胞的鉴别 第七节透明细胞肿瘤的免疫组化鉴别 第八节嗜酸细胞肿瘤的免疫组化鉴别 笫九节梭形细胞癌和其他梭形细胞病变的鉴别
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫细胞化学
1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；
（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。
）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；
（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。
）
3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/
次；
（Triton X-100是一种去垢剂，可以破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。
）
4.封闭：室温下用3％封闭血清(in TBST)封闭1h，200ul/well；
（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。
）
5.孵一抗：用TBST洗一遍，加入相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)，
200ul/well，室温孵育2h，或者4℃孵育过夜。
（用湿纸巾包住细胞板放入铝盒，以防止水分蒸发，注意设置阴性对照。
）
6.用TBST洗2次，10min/次；
7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，150ul/well，
室温下避光孵育1h；
（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC 为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。
）
8.用TBST洗2次，5min/次；
（如抗体的非特异多也可多洗。
）
9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，200ul/孔。
10.用PBS洗一遍，拍照
试剂配制：
1.4％PFA(in PBS)：每100mlPBS含4gPFA粉剂；
取PBS加热到65-70℃（水浴加热），放至搅拌器上，加入PFA粉末搅拌，若PFA 仍未溶解，可边搅拌边加强碱NaOH至PFA充分溶解，再用HCl调PH值为7.4，室温冷却后分装于-20℃保存，使用时再水浴解冻。
2.TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）：每100mlTBS含0.1ml Triton X-100；
注意：吸Triton X-100时，要剪枪头，在磁力搅拌下逐滴加入。
3.3％封闭血清(in TBST)：每100mlTBST（0.1％Triton X-100 in TBS）中加入
3ml封闭血清。
4.抗体稀释液（3%BSA in TBS）：每100ml 1×TBS含3gBSA，调PH值7.4。